青島煙區(qū)馬鈴薯Y病毒株系鑒定及系統(tǒng)傳導(dǎo)特性

郭光耀，宋麗云,2*，江連強(qiáng)，沈廣材，張富強(qiáng)，董文鳳，何青云，申莉莉*

青島煙區(qū)馬鈴薯Y病毒株系鑒定及系統(tǒng)傳導(dǎo)特性

郭光耀1，宋麗云1,2*，江連強(qiáng)3，沈廣材4，張富強(qiáng)4，董文鳳1，何青云1，申莉莉1*

（1.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所，青島 266101；2.濰坊職業(yè)學(xué)院農(nóng)林科技學(xué)院，山東 濰坊 262737；3.四川省煙草公司涼山州公司，四川 西昌 615000；4.云南省煙草公司保山市公司，云南 保山 678000）

為明確引起青島試驗(yàn)田煙草脈壞死及花葉的PVY的發(fā)生規(guī)律、分子進(jìn)化和系統(tǒng)傳導(dǎo)特性，通過(guò)病毒病害表型，發(fā)病率和病情指數(shù)明確青島試驗(yàn)田病毒病害流行規(guī)律；利用MEGA7構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)鑒定PVY青島分離物的株系；通過(guò)qRT-PCR，western blotting和PVY-GFP熒光明確PVY侵染煙株的傳導(dǎo)路徑；通過(guò)不同葉位、不同癥狀病葉取樣，利用qRT-PCR檢測(cè)PVYmRNA相對(duì)含量，明確顯癥和隱癥葉片的病毒含量差異，以及TMV、CMV、PVY單獨(dú)、兩者混合、三者混合侵染時(shí)的干擾或協(xié)生作用。結(jié)果顯示：煙株成熟期，PVY與TMV和CMV混合發(fā)生嚴(yán)重，PVY分離物為N:O株系，未突破基因抗性。在侵染早期，病毒從接種葉沿葉脈進(jìn)入莖，開(kāi)始雙向運(yùn)輸時(shí)，先向根部移動(dòng)，進(jìn)而到達(dá)苗端；再擴(kuò)散至上部葉，較慢移動(dòng)至下部葉；最后伴隨煙株生長(zhǎng)持續(xù)向兩端新生部位運(yùn)輸。侵染中期病株上部葉隱癥現(xiàn)象顯著，病葉癥狀與病毒濃度呈正相關(guān)。煙田中后期，PVY與TMV和CMV混合侵染，病毒間的干擾和協(xié)生作用導(dǎo)致癥狀復(fù)雜多變。研究結(jié)果有助于提高品種抗性鑒定試驗(yàn)的準(zhǔn)確性和藥效試驗(yàn)的靶標(biāo)性。

馬鈴薯Y病毒；株系鑒定；系統(tǒng)傳導(dǎo)；隱癥；混合侵染

馬鈴薯Y病毒（potato virus Y，PVY）是危害植物的十大病毒之一，主要經(jīng)農(nóng)事操作和蚜蟲取食傳播，嚴(yán)重為害馬鈴薯、煙草、番茄、辣椒等作物[1]。PVY在自然界中存在很多株系，根據(jù)與馬鈴薯抗病基因的識(shí)別關(guān)系，將其劃分為C、O、N、Z、E等株系[2-4]。株系C和O引起煙草花葉和脈明，而N株系導(dǎo)致脈壞死。由O和N重組產(chǎn)生的N:O、NTN、N-Wi、NTN-NW、NA-NTN等株系[5]，因含有N型HC-Pro，均引起普通煙草脈壞死[6-8]。來(lái)自煙草品種VAM的隱性基因抗PVY多個(gè)株系，被應(yīng)用于抗病育種。但隨著型抗病品種的廣泛種植，已在多國(guó)發(fā)現(xiàn)克服抗性的突變毒株[9-10]。PVY-CJ是我國(guó)首個(gè)被報(bào)道的突破抗性的毒株，在分子進(jìn)化上歸于NTN株系[11]。

隱癥是指被病毒侵染的植物在系統(tǒng)發(fā)病顯癥一段時(shí)間后，新生部分的癥狀出現(xiàn)減輕或消失的現(xiàn)象，一旦恢復(fù)適宜發(fā)病的條件，癥狀又可重新出現(xiàn)[12]。不同病毒株系在不同環(huán)境條件下侵染抗/感寄主，誘導(dǎo)產(chǎn)生的癥狀極為復(fù)雜多變[13]。煙田早期感染PVY的病株中后期上部葉常表現(xiàn)隱癥[14]。在三生NN煙上活體保存毒源及在煙草苗期接種病毒的抗性鑒定中，PVY隱癥現(xiàn)象尤為突出。通常，接種后1～2周上部葉出現(xiàn)花葉脈明和輕微反卷；2～3周俯瞰病株群體表現(xiàn)輕癥，逐株分級(jí)調(diào)查時(shí)可見(jiàn)頂部葉輕微花葉脈明，中上部葉隱癥，而下部葉顯著脈壞死且反卷皺縮[14]。

此外，兩種或幾種病毒復(fù)合侵染是煙田中后期的普遍現(xiàn)象。多種病毒在同一植物體內(nèi)發(fā)生復(fù)合侵染時(shí)，主要表現(xiàn)為協(xié)生或干擾作用[14-15]。明確煙草主要病毒復(fù)合侵染時(shí)病毒間的協(xié)同或干擾作用及其對(duì)應(yīng)的病害表型，有助于準(zhǔn)確判定復(fù)合侵染和發(fā)病級(jí)別。并且煙株感染PVY的顯癥規(guī)律和隱癥現(xiàn)象的準(zhǔn)確判定，是制定病情系統(tǒng)調(diào)查節(jié)點(diǎn)和病害嚴(yán)重度分級(jí)的關(guān)鍵。為探明引起青島試驗(yàn)田煙草脈壞死及花葉的PVY毒株的發(fā)生規(guī)律、分子進(jìn)化和系統(tǒng)傳導(dǎo)特性，本文進(jìn)行了田間病情普查、毒株鑒定和系統(tǒng)傳導(dǎo)特性的研究，以期提高品種抗性鑒定試驗(yàn)的準(zhǔn)確性和藥效試驗(yàn)的靶標(biāo)性。

1 材料與方法

1.1 供試植物、病毒和引物

供試植物：莧色藜（）、本氏煙（）、三生煙NN（Samsun NN）、中煙100、K326、VAM、CV91、云煙85、NC95、粘煙草。煙草花葉病毒（tobacco mosaic virus，TMV）、黃瓜花葉病毒（cucumber mosaic virus，CMV）、馬鈴薯Y病毒（potato virus Y，PVY）、侵染性克隆PVY-GFP，以上材料均保存于本實(shí)驗(yàn)室。擴(kuò)增全長(zhǎng)和熒光定量檢測(cè)的引物（表1）及測(cè)序由青島派森諾基因科技有限公司完成。

1.2 PVY大田普查、病葉采集、純化保存及株系鑒定

2021年在青島即墨市龍泉鎮(zhèn)石門村試驗(yàn)田，于中煙100和K326團(tuán)棵期至旺長(zhǎng)期進(jìn)行大田病情普查[16]，統(tǒng)計(jì)分析發(fā)病規(guī)律。隨機(jī)采集典型PVY發(fā)病癥狀的5個(gè)病葉樣本，汁液摩擦接種在莧色藜上，單斑分離純化，在三生煙NN上活體保存。在5～6葉期K326、VAM、CV91、云煙85和NC95兩片最大展開(kāi)葉上，汁液摩擦接種40倍質(zhì)量濃度的病汁液，25～26 ℃培養(yǎng)，記錄抗感表型。每處理3～6株，重復(fù)3次。下述煙苗接種PVY均按此方法。

表1 引物序列

提取病葉總RNA，以引物PVY-CP-F1/R1擴(kuò)增病毒外殼蛋白全長(zhǎng)，提交NCBI進(jìn)行同源分析。下載PVY各株系為外群，采用MEGA 7.0構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)[17]。

K326接種PVY后4～16 d，以PVY-CP-F2/R2和Actin-F/R為引物，qRT-PCR檢測(cè)相對(duì)于接種葉的植株不同部位中mRNA相對(duì)含量[18]。

在5～6葉期本氏煙最大展開(kāi)葉上，浸潤(rùn)接種PVY-GFP。接種后2～16 d在紫外光下記錄GFP傳導(dǎo)路徑；3.5 d檢測(cè)不同部位中mRNA含量；8～16 d采用Western blot檢測(cè)不同部位中CP積累量[18]。

1.3 PVY顯癥和隱癥葉片中病毒含量檢測(cè)

三生NN接種PVY后出現(xiàn)上部葉隱癥時(shí)，自下而上取花葉脈壞死皺縮、花葉、隱癥和輕微花葉的葉片，檢測(cè)mRNA含量。在田間旺長(zhǎng)期，對(duì)下部葉脈壞死皺縮、上部葉隱癥的PVY病株檢測(cè)不同葉位中的病毒含量。

1.4 PVY與TMV、CMV混合侵染煙株中的病毒含量檢測(cè)

對(duì)K326分別進(jìn)行TMV、CMV、PVY單獨(dú)、兩者混合、三者混合侵染的接種，設(shè)不接種空白對(duì)照，共計(jì)8個(gè)處理。接種后7 d取上部系統(tǒng)葉，檢測(cè)mRNA含量，分析病毒間的協(xié)生或干擾作用。

1.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR（Quantitative Real-time PCR）檢測(cè)病毒相對(duì)含量

首先利用TRIzol（Vazyme，南京）裂解煙草葉片組織提取植物總RNA，然后按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒（Vazyme，南京）說(shuō)明合成cDNA。最后利用SYBR Premix Ex TaqTM試劑盒（Vazyme，南京）和Applied Biosystems 7500系統(tǒng)進(jìn)行qRT-PCR。β-肌動(dòng)蛋白基因用作內(nèi)源對(duì)照，用熒光定量檢測(cè)的引物（表1）檢測(cè)病毒外殼蛋白表達(dá)的變化。采用2-△△CT法計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)量，每處理3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。

2 結(jié) 果

2.1 試驗(yàn)田PVY發(fā)生規(guī)律

普查結(jié)果顯示（圖1），移栽緩苗后15～20 d（6月下旬），移栽接觸傳毒導(dǎo)致TMV成串甚至成行爆發(fā)，中煙100和K326的發(fā)病率分別為4.60%和16.25%，此時(shí)偶有PVY脈壞死和花葉病株。團(tuán)棵期至旺長(zhǎng)期（7月上旬），農(nóng)事接觸和蚜蟲傳毒促使PVY發(fā)病率上升，時(shí)有連串病株，形成局部發(fā)病中心，中煙100和K326發(fā)病率分別為27.96%和25.00%；但此時(shí)上部葉隱癥現(xiàn)象普遍，病情指數(shù)較輕，分別為13.14和18.62。此期間試驗(yàn)地塊施藥和農(nóng)事操作導(dǎo)致TMV發(fā)病率和病情指數(shù)均較高，但CMV病株較少。始花期至打頂期（7月下旬），除TMV、PVY單獨(dú)侵染病株病情較重之外，兩者混合侵染顯著提高，中煙100和K326發(fā)病率分別為14.43%和39.08%，病情指數(shù)分別為14.43和37.80，下部葉受PVY侵染脈壞死皺縮，上部葉受TMV侵染出現(xiàn)沿葉脈黃綠相間的花葉；PVY與CMV混合侵染株數(shù)較少，但花葉皺縮壞死癥狀較重。

上述結(jié)果表明：PVY病情略低于TMV但顯著高于CMV。緩苗期以TMV為主；團(tuán)棵期至旺長(zhǎng)期以TMV和PVY單獨(dú)侵染為主，偶有CMV單獨(dú)侵染；始花期至成熟期是TMV和PVY單獨(dú)侵染和兩者混合侵染的高峰，偶有與CMV混合侵染。

2.2 PVY分離物的株系鑒定

如圖2所示，病毒外殼蛋白基因的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物大小為804 bp。提取病葉總蛋白，Western blot免疫印跡到一條34 kDa的單一蛋白條帶，與PVY CP大小一致。進(jìn)化樹(shù)（圖3A）表明分離物PVY-Qingdao與PVY-N:O株系的核苷酸相似性最高，為98.75%，其系統(tǒng)關(guān)系聚為一族，顯示青島煙草分離物為N:O株系。該分離物與O、C、NTN、N株系的親緣關(guān)系相對(duì)較遠(yuǎn)，核苷酸相似性分別為96.14%～98.01%、91.20%～91.95%、89.37%～90.67%、87.73%～89.76%。

PVY-Qingdao接種在莧色藜上表現(xiàn)接種葉枯斑；粘煙草表現(xiàn)花葉脈明；三生煙NN為上部葉脈明，下部葉脈壞死皺縮向內(nèi)側(cè)彎曲；K326為花葉脈明；VAM僅上部葉脈明；CV91接種葉之上的中部葉片脈明，向內(nèi)側(cè)微卷，上部葉輕微花葉；云煙85和NC95中部葉嚴(yán)重花葉皺縮內(nèi)卷，脈壞死，上部葉脈明花葉（圖3B）。依據(jù)這一結(jié)果，在煙草苗期接種PVY的抗性鑒定中，設(shè)置抗病對(duì)照VAM，中抗對(duì)照CV91，感病對(duì)照云煙85和NC95。VAM抗病說(shuō)明該分離物未突破基因抗性。

圖1 試驗(yàn)田病毒病種類及病害表型

注：A，基因核酸電泳；B，CP蛋白印跡。

Note: A,gene nucleic acid electrophoresis; B, CP western blotting.

圖2 PVY青島分離物的CP檢測(cè)

Fig. 2 CP Detection of PVY Qingdao isolate

注：A，CP蛋白株系進(jìn)化樹(shù)；B，PVY-Qingdao在寄主上的病害表型。

Note: A, CP protein strain evolution tree; B, PVY-Qingdao disease phenotype on the host.

圖3 PVY青島分離物的毒株鑒定

Fig. 3 Strain identification of PVY Qingdao isolate

2.3 PVY在K326及PVY-GFP在本氏煙上的系統(tǒng)傳導(dǎo)路徑

K326接種PVY后4～16 d，植株各部位mRNA表達(dá)量（圖4）顯示：第4天，接種葉含量最高，根和上1葉、上2葉檢出PVY，顯示病毒進(jìn)入主莖后，先近乎同時(shí)兩端運(yùn)輸，但此時(shí)尚未擴(kuò)散至下部葉。第8天，含量排序?yàn)椋合?葉＜上2葉＜根＜下2葉＜接種葉＜上1葉，顯示病毒布滿全株，且向上運(yùn)輸旺盛。第12天，各部位病毒含量達(dá)到高峰，含量排序?yàn)椋航臃N葉＜上2葉＜根＜上1葉＜下1葉＜下2葉，說(shuō)明病毒布滿全株后開(kāi)始持續(xù)向中下部葉和根擴(kuò)散。第16天，含量排序?yàn)椋焊枷?葉＜下2葉＜上2葉＜接種葉＜上1葉，顯示伴隨煙株生長(zhǎng)，病毒持續(xù)向頂葉運(yùn)輸。這一結(jié)果顯示PVY在K326上的擴(kuò)散路徑為：接種葉→莖→根、心葉→上部葉、下部葉→全株→旺長(zhǎng)的上部葉。

為示蹤病毒在同一植株上系統(tǒng)傳導(dǎo)路徑，在本氏煙上浸潤(rùn)接種PVY-GFP。紫外燈下植株外部熒光顯示（圖5A）：病毒熒光先從初侵染點(diǎn)沿側(cè)脈進(jìn)入主脈，擴(kuò)展至莖，隨即快速雙向運(yùn)輸；第8天，心葉和根系均布滿熒光，然后擴(kuò)散至毗鄰接種葉的上部葉，較慢到達(dá)下部葉，最后伴隨植株生長(zhǎng)持續(xù)向兩端新生部位運(yùn)輸；第16天，新葉和新根均呈現(xiàn)熒光。qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示（圖5B），接種后3.5 d各部位中mRNA相對(duì)表達(dá)量以根部最大，接種葉次之，再是心葉和上部葉。這說(shuō)明病毒進(jìn)入主莖后，先向根部移動(dòng)，進(jìn)而移動(dòng)到苗端。Western blot檢測(cè)接種后8～16 d各部位中CP積累量，同樣顯示病毒先在根部、接種葉及其上部葉積累，再擴(kuò)散至下部葉布滿全株；病毒含量均以中上部葉最高，根中持續(xù)有病毒，較慢到達(dá)下部葉（圖5C），這與熒光分布規(guī)律相符。

注：A，K326接種PVY后16 d，3、4、5分別為接種葉、上1葉、上2葉。

Note: A, 16 days after K326 was inoculated with PVY, 3, 4, and 5 were the inoculated leaves, upper 1 leaf, and upper 2 leaves, respectively.

圖4 PVY在K326上的系統(tǒng)傳導(dǎo)

Fig. 4 Systemic transduction of PVY on K326

注：A，PVY-GFP在本氏煙上的擴(kuò)散時(shí)程，白色箭頭指病毒接種點(diǎn)/接種葉片，時(shí)間指接種后天數(shù)；B，qRT-PCR檢測(cè)接種后3.5 d各部位mRNA相對(duì)含量；C，Western blotting檢測(cè)接種后不同時(shí)間、不同部位中CP積累量（S2，上2葉；S1，上1葉；JZ，接種葉；X1，下1葉；X2，下2葉；G，根）。

Note: A, Time course of PVY-GFP diffusion on, the white arrow indicates the virus inoculation point/leaf, and the time refers to the day after inoculation; B, qRT-PCR detection of relative content ofmRNA in each part 3.5 days after inoculation; C, Western blotting detection CP accumulation at different times and in different parts after inoculation (upper 2 leaves, S2; upper 1 leaf, S1; inoculated leaf, JZ; lower 1 leaf, X1; lower 2 leaves, X2, root, G).

圖5 PVY-GFP在本氏煙上的系統(tǒng)傳導(dǎo)

Fig. 5 Systematic spread of PVY-GFP infected

2.4 隱癥病株的病葉癥狀與病毒濃度的相關(guān)性

5～6葉期三生NN煙接種PVY后7～10 d，上部系統(tǒng)葉先出現(xiàn)脈明花葉，隨之脈壞死、內(nèi)卷皺縮，心葉花葉；14～21 d，上部葉出現(xiàn)隱癥現(xiàn)象，頂端新生葉輕微花葉。第14天，花葉脈壞死皺縮的下部葉、花葉輕微變形的中部葉、隱癥的上部葉、輕微花葉的心葉，其mRNA含量分別為1.477?3、0.570?0、0.041?0和0.091?0。田間表現(xiàn)下部葉脈壞死皺縮、中部葉花葉輕微皺縮、上部葉隱癥、頂葉隱癥的病株，自下而上4片葉中mRNA含量分別為8.47、7.63、1.25、0.97（圖6）。結(jié)果表明：隱癥葉片中病毒含量最少，且病葉癥狀與病毒濃度呈正相關(guān)。

注：A，溫室中感病煙株；B，溫室感病煙株不同葉位中mRNA含量；C，田間感病煙株；D，田間感病煙株不同葉位中mRNA含量。

Note: A, virus infected tobacco in the greenhouse; B,mRNA content in different leaf positions of virus infected tobacco plants in the greenhouse; C, virus infected tobacco in the field; D ,mRNA content in different leaf positions of virus infected tobacco in the field.

圖6 煙株感染PVY的顯癥/隱癥葉片及其病毒濃度

Fig. 6 Symptomatic/recessive leaves of tobacco infected with PVY and their viral concentration

2.5 PVY與TMV、CMV混合侵染時(shí)的干擾或協(xié)生作用

如圖7所示，在TMV、CMV、PVY單獨(dú)、兩者混合、三者混合侵染K326后7 d，系統(tǒng)葉中mRNA含量顯示：（1）相比于TMV單獨(dú)侵染，TMV+CMV復(fù)合侵染時(shí)，TMV表達(dá)量略有降低但差異不顯著；而TMV+PVY復(fù)合侵染以及TMV+CMV+PVY同時(shí)侵染時(shí)，均顯著促進(jìn)TMV表達(dá)，但后者的促進(jìn)作用略低。這表明兩者混合侵染時(shí)，CMV對(duì)TMV的干擾不顯著，PVY對(duì)TMV起協(xié)生作用，在三者混合侵染時(shí)，CMV侵染引起的干擾作用削減了PVY侵染引起的協(xié)生作用。（2）相比于CMV單獨(dú)侵染，TMV+CMV復(fù)合侵染、CMV+PVY復(fù)合侵染時(shí)，CMV表達(dá)量顯著被抑制，而且這種抑制作用在TMV+CMV+PVY三者同時(shí)侵染時(shí)最大。表明兩者和三者混合侵染時(shí)，TMV和PVY均對(duì)CMV起干擾作用，且呈累加干擾效應(yīng)。（3）相比于PVY單獨(dú)侵染，TMV+CMV復(fù)合侵染、CMV+PVY復(fù)合侵染以及TMV+CMV+PVY同時(shí)侵染時(shí)，PVY表達(dá)量均顯著被抑制，而且抑制程度漸次減弱。表明兩者和三者混合侵染時(shí)，TMV和CMV對(duì)PVY起干擾作用，其中以TMV的干擾作用強(qiáng)于CMV的干擾作用，但兩者無(wú)累加干擾效應(yīng)。

圖7 不同病毒混合侵染7 d后K326系統(tǒng)葉中CP mRNA含量

上述結(jié)果說(shuō)明3種病毒在兩兩復(fù)合侵染時(shí)，TMV顯著抑制CMV，而CMV對(duì)TMV的抑制不顯著；TMV顯著抑制PVY而PVY顯著促進(jìn)TMV；CMV與PVY相互顯著抑制。在三者同時(shí)侵染時(shí)，CMV對(duì)TMV的輕微干擾部分地抵消PVY對(duì)TMV的協(xié)生作用；TMV和PVY對(duì)CMV的干擾呈累加效應(yīng)；TMV對(duì)PVY的干擾強(qiáng)于CMV對(duì)PVY的干擾，但無(wú)累加效應(yīng)。

3 討 論

根據(jù)危害的嚴(yán)重程度，PVY主要有兩種類型：中度危害的花葉株系和重度危害的壞死兼花葉株系。我國(guó)各煙區(qū)已報(bào)道多種PVY株系或分離物，張帥[19]將8個(gè)主產(chǎn)煙區(qū)的51個(gè)PVY分離物劃分為O、N、N:O、NTN 4個(gè)株系。此外，在云南昭通煙草上檢出O和N株系[20]，在黑龍江煙草上發(fā)現(xiàn)N、NTN、NW、NTN-NW株系，其中優(yōu)勢(shì)株系為NTN-NW[21]，四川煙草分離物分為O、N、N:O株系[22]，貴州煙田優(yōu)勢(shì)株系為N、NTN、NTN-NW[23-24]，湖南煙草分離物為E和NTN-NW株系[25]。本研究中青島煙田PVY分離物在分子進(jìn)化上歸于N:O株系，引起煙草花葉和脈壞死，VAM抗病，未突破抗性。

相比病毒胞間運(yùn)動(dòng)機(jī)制，多種病毒因子和寄主因子參與的病毒系統(tǒng)運(yùn)輸機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。通常，當(dāng)病毒從侵染葉片葉脈進(jìn)入微管系統(tǒng)時(shí)，系統(tǒng)侵染才開(kāi)始。有研究顯示韌皮部參與了病毒的長(zhǎng)距離移動(dòng)，例如花椒斑駁病毒（pepper mottle virus，PeMoV）首先通過(guò)辣椒的外韌皮部向根部移動(dòng)，并在子葉節(jié)或其附近進(jìn)入內(nèi)韌皮部，進(jìn)而移動(dòng)到苗端[26]。也有研究顯示植物病毒通過(guò)維管束鞘進(jìn)入薄壁組織，進(jìn)而滲透到伴胞/篩分子復(fù)合體中，通過(guò)篩分子快速運(yùn)輸?shù)狡渌鞴賉27]。蕪菁花葉病毒TuMV/6K2:GFP侵染本氏煙時(shí)，病毒復(fù)制囊泡出現(xiàn)在莖部各種類型細(xì)胞以及木質(zhì)部汁液中；且在只留下木質(zhì)部的莖部環(huán)剝株中，復(fù)制復(fù)合體仍可到達(dá)韌皮部和木質(zhì)部，通過(guò)木質(zhì)部導(dǎo)管建立系統(tǒng)感染[28]。本研究通過(guò)檢測(cè)K326接種PVY后各部位mRNA表達(dá)量，也發(fā)現(xiàn)病毒在進(jìn)入莖后先向根部移動(dòng)、進(jìn)而到達(dá)苗端。本氏煙上PVY-GFP示蹤，mRNA及蛋白檢測(cè)顯示：病毒沿葉脈進(jìn)入莖韌皮部后，先傳導(dǎo)至根，隨即至心葉；再擴(kuò)散至接種葉上、下的中部葉，布滿全株；最后伴隨植株生長(zhǎng)，持續(xù)向兩端新生部位運(yùn)輸。

有關(guān)隱癥的條件和內(nèi)在機(jī)制，孫燕霞等[29]通過(guò)分析不同溫度下PVY侵染的心葉煙（）中病毒蛋白含量、癥狀和病毒來(lái)源的小分子干擾RNA含量，確定30 ℃以上高溫引起癥狀消失；且常溫時(shí)，檢測(cè)到極少量的病毒起源的siRNAs，高溫時(shí)在新生無(wú)癥葉中檢測(cè)不到，而下部癥狀保持葉中含量明顯增加，顯示高溫激活了RNA沉默介導(dǎo)的抗病毒防御反應(yīng)，導(dǎo)致隱癥。本研究在三生NN、CV91、云煙85和NC95接種時(shí)，以及旺長(zhǎng)期病情調(diào)查時(shí)，均發(fā)現(xiàn)隱癥現(xiàn)象是PVY-N:O株系所具有的一種系統(tǒng)顯癥規(guī)律，且不同葉位的病毒濃度與癥狀呈正相關(guān)，具體的機(jī)制有待于后續(xù)研究。病毒混合侵染在煙田中后期普遍發(fā)生。夏燁[15]在TMV與CMV復(fù)合侵染K326后7 d的檢測(cè)顯示，兩者同時(shí)侵染時(shí)，CMV對(duì)TMV干擾、TMV對(duì)CMV協(xié)生；在TMV、CMV、PVY三者同時(shí)侵染時(shí)，CMV對(duì)TMV干擾、PVY對(duì)TMV協(xié)生且占主導(dǎo)，TMV對(duì)CMV協(xié)生、PVY對(duì)CMV干擾且占主導(dǎo)。其兩者混合侵染時(shí)TMV對(duì)CMV的協(xié)生，與本研究相反，且本文未檢測(cè)到CMV對(duì)TMV的顯著干擾。三者同時(shí)侵染時(shí)，其PVY對(duì)TMV協(xié)生且占主導(dǎo)，與本研究結(jié)論一致；但本文還檢測(cè)到TMV和PVY均對(duì)CMV干擾，TMV和CMV對(duì)PVY干擾，且TMV干擾占主導(dǎo)。這可能與環(huán)境和溫度差異相關(guān)，這也正說(shuō)明了病毒侵染、系統(tǒng)傳導(dǎo)和植株顯癥是復(fù)雜的動(dòng)態(tài)過(guò)程。本研究結(jié)果有助于提高品種抗性鑒定試驗(yàn)的準(zhǔn)確性和藥效試驗(yàn)的靶標(biāo)性。

4 結(jié) 論

本研究表明，青島試驗(yàn)田中引起煙草花葉和脈壞死的PVY分離物為N:O株系，未突破基因抗性。病毒侵染早期，由接種葉沿葉脈進(jìn)入莖韌皮部雙向運(yùn)輸，先向下至根，向上至心葉，再逐漸擴(kuò)散至上部葉，較慢到達(dá)下部葉，最后伴隨煙株生長(zhǎng)向兩端新生部位運(yùn)輸。侵染中期，煙株上部葉隱癥出現(xiàn)，病葉癥狀與病毒濃度呈正相關(guān)。煙株始花期至成熟期，PVY與TMV和CMV混合發(fā)生，病毒間的干擾和協(xié)生作用導(dǎo)致癥狀復(fù)雜多變。

[1] SCHOLTHOF K B G, ADKINS S, CZOSNEK H, et al. Top 10 plant viruses in molecular plant pathology[J]. Molecular plant pathology, 2011, 12(9): 938-954.

[2] SINGH R P, VALKONEN J P, GRAY S M, et al. Discussion paper: the naming of potato virus Y strains infecting potato[J]. Archives of Virology, 2008, 153(1): 1-13.

[3] BLANCHARD A, ROLLAND M, LACROIX C, et al. Potato virus Y: a century of evolution[J]. Current Topics in Virology, 2008, 7(12): 21-32.

[4] KARASEV A V, HU X, BROWN C J, et al. Genetic diversity of the ordinary strain of potato virus Y (PVY) and origin of recombinant PVY strains[J]. Phytopathology, 2011, 101(7): 778-785.

[5] 程林發(fā)，陳冠偉，姬麗云，等. 馬鈴薯Y病毒中國(guó)分離物的分子株系組成[J]. 植物病理學(xué)報(bào)，2021，51（5）：721-733.

CHENG L F, CHEN G W, JI L Y, et al. Molecular strain composition of Chinese isolates of potato virus Y[J]. Plant Physiology Journal, 2021, 51(5): 721-733.

[6] FAUREZ F, BALDWIN T, TRIBODET M, et al. Identification of new potato virus Y (PVY) molecular determinants for the induction of vein necrosis in tobacco[J]. Molecular Plant Pathology, 2012, 13(8): 948-959.

[7] TRIBODET M, GLAIS L, KERLAN C, et al. Characterization of potato virus Y (PVY) molecular determinants involved in the vein necrosis symptom induced by PVY N isolates in infectedcv. Xanthi[J]. Journal of General Virology, 2005, 86: 2101-2105.

[8] 程林發(fā)，董文浩，張鳳桐，等. 馬鈴薯Y病毒HC-Pro第182位賴氨酸殘基參與引起煙草葉脈壞死[J]. 植物病理學(xué)報(bào)，2021，51（1）：41-48.

CHENG L F, DONG W H, ZHANG F T, et al. The 182nd lysine residue of potato virus Y HC-Pro is involved in causing tobacco leaf vein necrosis[J]. Plant Physiology Journal, 2021, 51(1): 41-48.

[9] LACROIX C, GLAIS L, VERRIER J L, et al. Effect of passage of a potato virus Y isolate on a line of tobacco containing the recessive resistance gene va2 on the development of isolates capable of overcoming alleles 0 and 2[J]. European Journal of Plant Pathology, 2011, 130: 259-269.

[10] KIM J H, KIM Y S, JANG S W, et al. Characterization of a novel resistance-breaking isolate of potato virus Y in[J]. International Journal of Phytopathology, 2014, 3(1): 1-10.

[11] 李若，李尊強(qiáng)，萬(wàn)秀清，等.一株突破基因型煙草抗性的PVY病毒分離物的鑒定[J]. 中國(guó)煙草學(xué)報(bào)，2020，26（4）：72-77.

LI R, LI Z Q, WAN X Q, et al. Identification of a PVY virus isolate that breaks throughgenotype tobacco resistance[J]. Acta Tabacaria Sinica, 2020, 26(4): 72-77.

[12] 王小青. 高溫脅迫下煙草-TMV互作中的防御酶活性變化[D]. 鄭州：河南農(nóng)業(yè)大學(xué)，2006.

WANG X Q. Changed activities of defense-related enzymes in Nicotiana-TMV interaction under high-temperature stress[D]. Zhengzhou: Henan Agriculture University, 2006.

[13] 申莉莉，賈海燕，何青云，等. 毒株、苗齡及溫度對(duì)煙草苗期接種TMV試驗(yàn)的影響[J]. 植物病理學(xué)報(bào)，2021，51（4）：607-617.

SHEN L L, JIA H Y, HE Q Y, et al. Effects of virus strain, seedling age and temperature on tobacco seedling inoculation test with TMV[J]. Plant Physiology Journal, 2021, 51(4): 607-617.

[14] 王靜，申莉莉，王秀芳，等. 煙草主要病蟲害嚴(yán)重度分級(jí)圖譜[M]. 北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)技術(shù)出版社，2021.

WANG J, SHEN L L, WANG X F, et al. Severity classification map of major tobacco pests and diseases[M]. Beijing: China Agricultural Science and Technology Press, 2021.

[15] 夏燁. 三種煙草病毒在煙田土壤中的分布動(dòng)態(tài)及在煙草中的互作[D]. 廣州：華南農(nóng)業(yè)大學(xué)，2017.

XIA Y. Distribution dynamics of three tobacco viruses in tobacco field soil and their interactions in tobacco[D]. Guangzhou: South China Agricultural University, 2017.

[16] 任廣偉，孔凡玉，王鳳龍，等. 煙草病蟲害分級(jí)及調(diào)查方法：GB/T 23222—2008[S].

REN G W, KONG F Y, WANG F L, et al. Grade and investigation method of tobacco diseases and insect pests: GB/T 23222—2008[S].

[17] 申莉莉，宋麗云，龔明月，等. 煙草黃瓜花葉病毒亞組Ⅰ分離物生物學(xué)特性[J]. 中國(guó)煙草科學(xué)，2021，42（6）：30-35.

SHEN L L, SONG L Y, GONG M Y, et al. Biological characteristics of tobacco cucumber mosaic virus subgroup I isolates[J]. China Tobacco Science, 2021, 42(6): 30-35.

[18] 曲瀟玲，宋麗云，張道順，等. 轉(zhuǎn)錄因子NbNAC062及其納米藥物對(duì)PVY侵染的抑制作用[J]. 中國(guó)煙草科學(xué)，2023，44（2）：35-42.

QU X L, SONG L Y, ZHANG D S, et al. Inhibitory effects of transcription factor NbNAC062 and its nanomedicine on PVY infection[J]. China Tobacco Science, 2023, 44(2): 35-42.

[19] 張帥. 我國(guó)主要煙區(qū)PVY株系分化研究[D]. 北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院，2010.

ZHANG S. Research on PVY strain differentiation in major tobacco areas in my country[D]. Beijing: Chinese Academy of Agricultural Sciences, 2010.

[20] 盧訓(xùn)，丁銘，方琦，等. 馬鈴薯Y病毒云南昭通煙草分離物的檢測(cè)及年度間差異比較[J]. 植物保護(hù)，2013，39（3）：56-60.

LU X, DING M, FANG Q, et al. Detection of potato virus Y isolates from Yunnan Zhaotong tobacco and comparison of annual differences[J]. Plant Protection, 2013, 39(3): 56-60.

[21] 萬(wàn)秀清，喬嬋，趙淑娟，等. 黑龍江煙區(qū)煙草馬鈴薯Y病毒株系的分子鑒定[J]. 煙草科技，2015，48（10）：13-18，25.

WAN X Q, QIAO C, ZHAO S J, et al. Molecular identification of tobacco and potato virus Y strains in Heilongjiang tobacco-growing areas[J]. Tobacco Science and Technology, 2015, 48(10): 13-18, 25.

[22] 趙雪君. 四川省部分煙區(qū)蚜傳病毒種類鑒定及LAMP體系的建立[D]. 重慶：西南大學(xué)，2015.

ZHAO X J. Identification of aphid-borne virus species in some tobacco areas of Sichuan Province and establishment of LAMP system[D]. Chongqing: Southwest University, 2015.

[23] 夏范講，郭玉雙，賈蒙驁. 貴州煙田馬鈴薯Y病毒優(yōu)勢(shì)株系全序列克隆及系統(tǒng)進(jìn)化分析[J]. 中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2017，22（7）：34-39.

XIA F J, GUO Y S, JIA M A. Full sequence cloning and phylogenetic analysis of dominant potato virus Y strains in Guizhou tobacco fields[J]. Journal of China Agricultural University, 2017, 22(7): 34-39.

[24] 遲云化. 貴州省煙草主產(chǎn)區(qū)馬鈴薯Y病毒株系劃分及致病力分析[D]. 泰安：山東農(nóng)業(yè)大學(xué)，2019.

CHI Y H. Classification and pathogenicity analysis of potato virus Y strains in the main tobacco producing areas of Guizhou Province[D]. Tai’an: Shandong Agricultural University, 2019.

[25] 李思佳. 湖南煙草馬鈴薯Y病毒的檢測(cè)與變異分析[D]. 長(zhǎng)沙：湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)，2019.

LI S J. Detection and mutation analysis of Hunan tobacco and potato virus Y[D]. Changsha: Hunan Agricultural University, 2019.

[26] ANDRIANIFAHANANA M, LOVINS K, DUTE R, et al. Pathway for phloem-dependent movement of pepper mottle potyvirus in the stem of[J]. Phytopathology, 1997, 87(9): 892-898.

[27] WAIGMANN E, UEKI S, TRUTNYEVA K, et al. The ins and outs of nondestructive cell-to-cell and systemic movement of plant viruses[J]. Critical Reviews in Plant Sciences, 2004, 23(3): 195-250.

[28] WAN J, CABANILLAS D G, ZHENG H, et al. Turnip mosaic virus moves systemically through both phloem and xylem as membrane-associated complexes[J]. Plant physiology, 2015, 167(4): 1374-1388.

[29] 孫燕霞，張獻(xiàn)軍，劉蘭偉，等. 高溫激活RNA沉默介導(dǎo)的心葉煙抗病毒防御反應(yīng)[J]. 植物病理學(xué)報(bào)，2008（1）：58-63.

SUN Y X, ZHANG X J, LIU L W, et al. Antiviral defense response ofmediated by high temperature-activated RNA silencing[J]. Plant Physiology Journal, 2008(1): 58-63.

Identification of Potato Virus Y Strains and System Spreading Characteristics in Qingdao Tobacco-growing Areas

GUO Guangyao1, SONG Liyun1,2*, JIANG Lianqiang3, SHEN Guangcai4, ZHANG Fuqiang4, DONG Wenfeng1, HE Qingyun1, SHEN Lili1*

（1. Tobacco Research Institute of CAAS, Qingdao 266101, China; 2. College of Agriculture and Forestry Science and Technology, Weifang Vocational College, Weifang Shandong 262737, China; 3. Liangshan Prefecture Company of Sichuan Tobacco Company, Xichang, Sichuan 615000, China; 4. Baoshan Company of Yunnan Tobacco Company, Baoshan, Yunnan 678000, China）

To clarify the occurrence, molecular evolution and system conduction characteristics of potato virus Y, which causes vein necrosis and mosaic leaves in Qingdao experimental field. The prevalence of virus disease in Qingdao experimental field was determined by viral disease phenotype, incidence rate and disease index; MEGA7 was used as a phylogenetic tree to identify the strains of PVY Qingdao isolate; qRT-PCR, western blotting and PVY-GFP were used to clarify the conduction path of PVY-infected plants; diseased leaves were sampled from different leaf positions and disease symptoms, and the relative content ofmRNA was used to clarify the viral content of leaves with obvious symptoms and latent symptoms; the CP content of the three viruses when TMV, CMV, and PVY infected alone, mixed with the two, and mixed with the three were detected to clarify the interference or synergistic effects of the viruses mixed infection. The results showed that PVY mixed seriously with TMV and CMV infection in the maturity stage, and the PVY isolate was an N:O strain, which did not break through the resistance of thegene. In the early stage of infection, the virus enters the stem from the inoculated leaf along the veins, and when it begins to transport in two directions, it first moves to the root, and then reaches the seedling tip; then spreads to the upper leaves, and then slowly moves to the lower leaves; finally, it continues to transport to the new parts at both ends as the tobacco plant grows. The recessive symptoms of the upper leaves were obvious in the mid-infection stage, and the symptoms of diseased leaves were positively correlated with the virus concentration. In the middle and late stages of the tobacco field, PVY is mixed with TMV and CMV, and the interference and synergy between viruses lead to complex and changeable symptoms. The research results will help improve the accuracy of the variety resistance identification test and the target of the drug efficacy test.

potato virus Y; strain identification; system transmission; disappeared symptom; mixed infection

S435.72

A

1007-5119(2023)06-0059-10

煙草行業(yè)煙草病蟲害監(jiān)測(cè)與綜合治理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室揭榜掛帥項(xiàng)目（KLTPMIMT2022-02）；四川省煙草公司涼山州公司科技項(xiàng)目（SCYC202311）

郭光耀（1998-），男，碩士研究生，主要從事病毒學(xué)研究。E-mail：1419332912@qq.com*通信作者。E-mail：宋麗云，jiayoulily2009@126.com；申莉莉，shenlili@caas.cn

2023-07-26

2023-11-24

10.13496/j.issn.1007-5119.2023.06.009