花椒黑脛病的病原鑒定與殺菌劑篩選

李培琴 阮釗 焦嘉卉 孫孟嬌 丁俊園 唐光輝

摘 要：【目的】鑒定陜西鳳縣花椒產(chǎn)區(qū)黑脛病的病原，篩選該病害的有效防治藥劑，為花椒黑脛病的有效防控提供指導(dǎo)依據(jù)。【方法】采用組織分離法和致病性檢驗獲得花椒黑脛病的病原菌，結(jié)合形態(tài)學(xué)特征和ITSrDNA、COXⅡ、TEF1-α 和β-tubulin 序列分析對病原菌進行鑒定；采用菌落生長速率法測定了15 種殺菌劑對花椒黑脛病菌的室內(nèi)毒力。【結(jié)果】從花椒黑脛病組織中分離純化到4 株菌落形態(tài)不同的菌株，經(jīng)柯赫氏法則驗證，明確菌株Zb-P1 為花椒黑脛病的病原菌；基于Zb-P1 菌落形態(tài)和繁殖體顯微結(jié)構(gòu)特征觀察，發(fā)現(xiàn)Zb-P1 菌落呈花瓣狀，菌絲無隔膜，無性繁殖時產(chǎn)生典型的檸檬狀游動孢子囊，故將Zb-P1 鑒定為疫霉屬Phytophthora 菌物；通過對Zb-P1 的ITS、COXⅡ、TEF1-α 和β-tubulin 序列分析，將Zb-P1 鑒定為柑橘褐腐疫霉P. citrophthora。復(fù)配化學(xué)殺菌劑40% 烯酰·氰霜唑懸浮劑、68.75% 氟菌·霜霉威懸浮劑、2% 霜脲·錳鋅可濕性粉劑和78% 烯酰·吡唑酯水分散粒劑對花椒黑脛病的室內(nèi)毒力較強，其EC50 值分別為0.390 1、0.385 6、0.216 6 和0.182 0 mg·L-1；生物源殺菌劑5% 香芹酚可溶液劑、0.4% 蛇床子素可溶液劑、0.5% 小檗堿水劑和0.3% 苦參堿乳油對花椒黑脛病的室內(nèi)毒力較差，EC50 均值分別為13.246 7、9.411 7、8.244 3 和8.231 5 mg·L-1。【結(jié)論】引起陜西鳳縣花椒黑脛病的病原菌為柑橘褐腐疫霉P. citrophthora，對花椒黑脛病菌抑菌作用顯著的殺菌劑為烯酰·氰霜唑、氟菌·霜霉威、霜脲·錳鋅和烯酰·吡唑酯。

關(guān)鍵詞：花椒黑脛病；柑橘褐腐疫霉；形態(tài)鑒定；分子鑒定；殺菌劑篩選

中圖分類號：S763.1 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號：1003—8981（2023）03—0150—09

花椒Zanthoxylum bungeanum 為蕓香科花椒屬灌木或落葉小喬木，是我國鄉(xiāng)村振興的重要經(jīng)濟林樹種，多栽培于氣候濕潤的丘陵山地區(qū)，如陜西、甘肅、四川等地，陜西省鳳縣地處我國秦嶺腹地，屬溫帶半濕潤山地氣候，是我國花椒的重要產(chǎn)區(qū)之一，其主要栽培種‘鳳縣大紅袍含有豐富的麻味素，個大、肉厚、色艷、味濃，有極高的經(jīng)濟價值，但‘鳳縣大紅袍抗性弱、易感病，常發(fā)生干腐病、根腐病、疫霉病及葉銹病等多種病害，這嚴(yán)重制約了陜西鳳縣花椒產(chǎn)業(yè)的發(fā)展[1-2]。

近年來，本研究團隊在陜西進行花椒病害田間調(diào)查時，在鳳縣花椒試驗示范園區(qū)發(fā)現(xiàn)了一種花椒病害，該病害主要危害‘鳳縣大紅袍花椒，受害花椒樹大面積衰弱且坐果率降低，嚴(yán)重制約了該產(chǎn)區(qū)花椒產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。該病害常發(fā)生在花椒莖基部，發(fā)病初期，受害部位表皮變褐，隨著病斑的發(fā)展與擴展，病斑凹陷，變?yōu)楹诤稚癄€嚴(yán)重，橫向縱向不斷延展，環(huán)繞整個根莖交界部位，導(dǎo)致花椒樹的水分和營養(yǎng)運輸受阻，最終枝葉萎蔫，全株枯死，該病害與石培賢等[3] 在2011 年報道的由疫霉屬Phytophthora 菌物引起的臨夏花椒黑脛病癥狀相似。2013 年，謝寧等[4] 曾對甘肅隴南和陜西鳳縣的花椒黑脛病（亦稱疫霉病）的病原進行了研究，基于形態(tài)學(xué)和ITS 序列分析，將陜西鳳縣2 個不同地理區(qū)域的花椒黑脛病病原鑒定為多寄主疫霉P. multivora、柑橘褐腐疫霉P. citrophthora 和苧麻疫霉P. boehmeriae，而將甘肅3 個不同地理區(qū)域的花椒黑脛病的病原鑒定為多寄主疫霉P. multivora 和柑橘褐腐疫霉P.citrophthora。其后，王潔菲等[5] 也對陜甘兩省花椒疫霉病的病原進行了鑒定，基于形態(tài)學(xué)特征與ITS 和β-tubulin 序列分析，將陜西寶雞地區(qū)4 個不同區(qū)域的花椒疫霉病的病原鑒定為苧麻疫霉P.boehmeriae，而將甘肅隴南地區(qū)4 個不同區(qū)域的花椒疫霉病的病原鑒定為多寄主疫霉P. multivora。

由此可知，不同地理區(qū)域的花椒黑脛病的病原菌可能不一樣，同一地理區(qū)域的花椒黑脛病的病原菌也有可能隨著花椒的引種栽培和種質(zhì)資源的交換而發(fā)生改變。2015 年后，尚未見花椒黑脛病相關(guān)的研究報道。陜西鳳縣花椒試驗示范園為我國著名的花椒示范園，園區(qū)育有多種花椒品種，近幾年來，在該示范園區(qū)名優(yōu)品種‘鳳縣大紅袍上黑脛病發(fā)生極為嚴(yán)重，目前，由于尚不清楚該示范園區(qū)花椒黑脛病的病原，對該病害的有效防控帶來了一定的困難。本研究擬通過組織分離法和致病性驗證獲得鳳縣花椒試驗示范園區(qū)花椒黑脛病的病原菌，并結(jié)合形態(tài)學(xué)與ITS、COXⅡ、TEF1-α 和β-tubulin 基因的序列分析，對花椒黑脛病的病原進行系統(tǒng)鑒定，在此基礎(chǔ)上，進一步開展殺菌劑對花椒黑脛病菌的室內(nèi)毒力測定，可為花椒黑脛病的有效防治奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試病樣

于2020 年7 月， 在陜西省寶雞市鳳縣花椒試驗示范基地鳳州鎮(zhèn)白石鋪村（106°31′12″E，33°55′12″N）內(nèi)選取‘鳳縣大紅袍花椒，其海拔為964 m，觀察并記錄花椒黑脛病的田間發(fā)病癥狀，后刨根挖出發(fā)病但尚未完全死亡的椒樹，截取發(fā)病的莖基部組織帶回實驗室。

1.2 供試培養(yǎng)基

配制馬鈴薯葡萄糖瓊脂（Potato dextrose agar， PDA）培養(yǎng)基[6]，用于花椒黑脛病菌的分離培養(yǎng)。V8 汁培養(yǎng)基：V8 蔬菜汁（美國產(chǎn)，采用8種不同營養(yǎng)成分的蔬菜作為原料進行混合配比的罐裝飲料）200 g，碳酸鈣 2 g，瓊脂粉16 g，水1 000 mL，121 ℃高壓蒸汽滅菌25 min，備用；用于誘導(dǎo)花椒黑脛病菌產(chǎn)生子實體和殺菌劑室內(nèi)毒力測定。

1.3 供試殺菌劑

供試藥劑：5% 香芹酚可溶液劑（SL）（PD20200138），山西德威本草生物科技有限公司；0.4% 蛇床子素可溶液劑（SL）（PD20182169），楊凌馥稷生物科技有限公司；0.3% 苦參堿乳油（EC）（PD20101371），楊凌馥稷生物科技有限公司；0.5% 小檗堿水劑（AS）（PD20151304），山東圣鵬科技股份有限公司；3% 多抗霉素可濕性粉劑（WP）（PD20100187），山東魯抗生物農(nóng)藥有限責(zé)任公司；25% 吡唑醚菌酯懸浮劑（SC）（PD20170997），山東恒利達(dá)生物科技有限公司；23.4% 雙炔酰菌胺懸浮劑（SC）（PD20142151），先正達(dá)南通作物保護有限公司；10% 氰霜唑懸浮劑（SC）（PD20050191），日本石原產(chǎn)業(yè)株式會社；50% 氟啶胺懸浮劑（SC）（PD20080180），日本石原產(chǎn)業(yè)株式會社；80% 代森錳鋅可濕性粉劑（WP）（PD20096679），陜西上格之路生物科學(xué)有限公司；40% 烯酰·氰霜唑懸浮劑（SC）（PD20171564）， 浙江威爾達(dá)化工有限公司；68.75% 氟菌·霜霉威懸浮劑（SC）（PD20120373），拜耳作物科學(xué)（中國）有限公司；78% 烯酰·吡唑酯水分散粒劑（WG）（PD20183011），山東百農(nóng)思達(dá)生物科技有限公司；72% 霜脲·錳鋅可濕性粉劑（WP）（PD20081950），河北中保綠農(nóng)作物科技有限公司；47% 春雷·王銅可濕性粉劑（WP）（PD20121558），陜西麥可羅生物科技有限公司。

1.4 花椒黑脛病菌的分離、純化與保存

采用組織分離法[6]：花椒黑脛病發(fā)病組織在自來水下沖洗干凈，切取病健交界處大小約為5 mm×5 mm 見方的組織塊，用75% 的酒精表面消毒30 ～ 50 s 后，用0.1% 的氯化汞水溶液消毒2 min，用無菌水沖洗4 次，將組織塊放置于PDA培養(yǎng)基上在25 ℃黑暗培養(yǎng)。當(dāng)有菌絲從組織塊邊緣長出時，用無菌鑷子小心夾取菌落邊緣的菌絲組織，接種至新的PDA 平板上，在25 ℃進行黑暗培養(yǎng)，純化2 次以上，直至獲得純培養(yǎng)的菌落，在4 ℃低溫條件下進行保存。

1.5 分離物的致病性測定

根據(jù)柯赫氏法則檢驗分離物的致病性，獲得花椒黑脛病的病原菌。在培養(yǎng)了14 d 的各分離物菌落上制備菌餅（Φ：5 mm），采用針刺接種法[2]將菌餅接種在花椒植株上。選取2 a 生健康的‘鳳縣大紅袍花椒盆栽苗為接種植株，將莖基部及向上部分的莖干用無菌水擦洗干凈，在莖基部和莖中上部分別選取與菌餅大小相當(dāng)?shù)牟课粸榻臃N位點，用無菌尖口鑷子在接種位點制造7 ～ 10 個針刺微傷口，將菌餅接種在傷口處（菌絲面緊貼傷口處），用濕潤的脫脂棉包裹菌餅，并用保鮮膜纏繞，6 個重復(fù)處理，以接種PDA 培養(yǎng)基菌餅的枝干作為對照。每個處理5 株盆栽苗，接種后的植株放置于植物培養(yǎng)室培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為25 ℃、光周期為L//D=12 h//12 h，分別在接種后的15 和30 d 拍照記錄發(fā)病癥狀。從接種15 d 的發(fā)病的花椒根莖部的病健交界處進行病原物的再分離培養(yǎng)和致病性測定。

1.6 病原物的鑒定

1.6.1 形態(tài)學(xué)鑒定

將花椒黑脛病菌接種在V8 培養(yǎng)基平板上，放置于25 ℃的培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)，觀察菌落形態(tài)特征。采用平板光照培養(yǎng)法誘導(dǎo)花椒黑脛病菌產(chǎn)生子實體[7]，在顯微鏡下觀察并拍照記錄其菌絲及子實體特征，觀察其是否能產(chǎn)生孢子囊、藏卵器、雄器和卵孢子等繁殖結(jié)構(gòu)，并測量其大小，參照Ho[8] 及Kroon 等[9] 的分類方法對花椒黑脛病菌進行形態(tài)學(xué)鑒定。

1.6.2 分子生物學(xué)鑒定

采用核糖體DNA 內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（ribosomalDNA-internal transcribed spacer，rDNA-ITS）、細(xì)胞色素氧化酶基因Ⅱ（Cytochrome oxidase Ⅱ，COXⅡ）、翻譯延長因子基因（Translationelongation factor 1-α，TEF1-α） 和β-tubulin 微管蛋白基因（β-tubulin）序列分析對花椒黑脛病菌進行分子生物學(xué)鑒定。收集花椒黑脛病菌的菌絲體， 采用CTAB 法進行基因組DNA 的提取[10]，rDNA-ITS 的PCR 擴增引物為ITS1（5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′） 和ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）[11]，COXⅡ 基因的PCR 擴增引物為Fm75（3′-CCTTGGCAATTAGGATTTCAAGAT-5′） 和Fm78（3′-ACAAATTTCACTACATTGTCC-5′）[12]，TEF1-α 的擴增引物為TEF1（3′-TCACGATCGACATTGCCCTG-5′） 和TEF2（3′-ACGGCTCGAGGATGACCATG-5′）[12]，β-tubulin 的擴增引物為TUB2（3′-CGGTAACAACTGGGCCAAGG-5′） 和TUB1（3′-CCTGGTACTGCTGGTACTCAG-5′）[12]。PCR 擴增體系為30 μL，包含引物各1 μL、DNA 模板0.5 μL、2×Es TaqMasterMix 15 μL、ddH2O 12.5 μL。PCR 擴增產(chǎn)物經(jīng)檢測合格后送生工生物工程（上海）股份有限公司進行測序。所得序列經(jīng)拼接后在NCBI 數(shù)據(jù)庫進行BLAST 分析，并將其提交至NCBI，獲取相應(yīng)的GenBank 登錄號。結(jié)合參考文獻(xiàn)和比對分析結(jié)果再從GenBank 中下載相關(guān)菌株的ITS、COXⅡ、TEF-1α 和β-tubulin 序列， 以鐘器腐霉Pythium vexans 為外群， 采用鄰近法（Neighborjoining，NJ） 構(gòu)建花椒黑脛病菌的ITS-COXⅡ-TEF-1α-β-tubulin 多基因系統(tǒng)發(fā)育樹[4]，分析花椒黑脛病菌的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系。

1.7 不同殺菌劑對病原物的室內(nèi)毒力測定

采用菌落生長速率法[13] 測定供試藥劑對花椒黑脛病病菌的室內(nèi)毒力。待花椒黑脛病菌在含藥V8 培養(yǎng)基平板上生長8 d 時，采用十字交叉法測量菌落直徑（mm），按照以下公式計算抑菌率：抑制率（%）=（R0-R）×100/（R0-5） （1）R0 為對照菌落直徑；R 為處理組菌落直徑。

以抑制率對應(yīng)的幾率值為因變量（Y），農(nóng)藥各濃度的對數(shù)值為自變量（X），建立毒力回歸方程，計算各農(nóng)藥對花椒黑脛病菌的有效中濃度（Effective medium concentration， EC50） 及其95%置信限（Fiducial limit，F(xiàn)L）。

2 結(jié)果與分析

2.1 花椒黑脛病田間發(fā)病癥狀

花椒黑脛病常發(fā)生在花椒根莖交接部位，一至多年生椒樹均可發(fā)病，感病部位發(fā)病初期表皮失綠變褐，輕度腐爛凹陷，并有黑褐色膠汁溢出，發(fā)病后期病斑腐爛嚴(yán)重，木質(zhì)部變黑，植株水分和營養(yǎng)運輸受阻，花椒樹地上部分枝葉萎蔫，葉片脫落樹勢衰弱，嚴(yán)重時可導(dǎo)致植株枯死（圖1a—b）。

2.2 花椒黑脛病菌的分離與致病性檢驗

從花椒黑脛病發(fā)病組織分離獲得4 個菌落形態(tài)不同的分離物，分別編號為Zb-P1 ～ P4。經(jīng)柯赫氏法則驗證致病性，發(fā)現(xiàn)只有菌株Zb-P1 能成功侵染花椒枝干，并導(dǎo)致接種部位變黑、腐爛（圖2）。Zb-P1 接種在花椒根莖交界部位15 d 時，接種部位表皮失綠變褐，木質(zhì)部變軟，枝干腐爛凹陷（圖2b）；培養(yǎng)至30 d 時，接種部位發(fā)病面積不斷擴大環(huán)繞枝干，沿著接種部位向上、向下均可擴展，表皮腐爛脫落，木質(zhì)部組織腐爛變黑（圖2c）。花椒黑脛病在田間的發(fā)病部位大部分都是根莖交界處，本研究為了探討其是否也能引起花椒莖干中上部位發(fā)病，故將Zb-P1 接種在花椒莖干的中上部，發(fā)現(xiàn)其也能引起發(fā)病部位的變褐、腐爛和組織壞死。在莖干中上部接種15 d 時，植株患處表皮失綠變黑，木質(zhì)部變軟變褐，腐爛凹陷（圖2e）；將其培養(yǎng)至30 d 時，發(fā)現(xiàn)病斑與15 d 時的病斑大小變化不大，病斑從15 d 后基本停止擴展（圖2f）。從接種15 d 發(fā)病部位的病健交界處進行病原物的分離、培養(yǎng)和純化，獲得與Zb-P1 具有相同形態(tài)特征的菌株，將其再接種到健康花椒植株上，引起與花椒黑脛病相同的癥狀。根據(jù)柯赫氏法則，證明Zb-P1 為引起花椒黑脛病的病原菌。

2.3 花椒黑脛病病原菌的形態(tài)特征

病原物Zb-P1 在V8 培養(yǎng)基上培養(yǎng)，菌落平均生長速率為5.71±0.54 mm/d，菌落正面白色，背面土黃色，呈花瓣輻射狀，氣生菌絲較少，短絨毛狀，致密，菌絲不易挑起（圖3a—b）。菌絲無隔，分枝處常縊縮，菌絲寬為3.3 ～ 7.4（5.7±1.2）μm（圖3c）。培養(yǎng)14 d 左右，發(fā)現(xiàn)Zb-P1 會產(chǎn)生特有的珊瑚狀菌絲（圖3d），比正常菌絲略寬，其寬度為7.5 ～ 9.8（8.6±1.8）μm。孢子囊檸檬狀，橢圓形，顯微鏡下測量50 個孢子囊大小，其長為20.3 ～ 30.6（30.2±5.7）μm， 寬為15.2 ～ 20.9（19.5±3.2）μm，長寬比為1.34 ～ 1.46（1.55），孢子囊具明顯乳突，乳突高度2.1 ～ 6.1（2.8±0.8）μm，孢囊梗呈簡單合軸分枝或不分枝（圖3e）。厚垣孢子球形，簇生（圖3f）或頂生（圖3g），顯微鏡下測量50 個厚垣孢子大小，直徑為13.5 ～ 25.6（19.1±2.3）μm。尚未觀察到Zb-P1 在V8 固體培養(yǎng)基上產(chǎn)生藏卵器、雄器和卵孢子。綜合菌落形態(tài)與無性繁殖器官等特征，參照謝寧等[4]、王潔菲等[5] 和仇芳等[14] 對疫霉菌的描述，將花椒黑脛病的病原菌Zb-P1 鑒定為疫霉屬Phytophthora菌物。

2.4 花椒黑脛病病原菌的分子鑒定結(jié)果

利用ITS、COXⅡ、TEF-1α 和β-tubulin 引物分別對菌株Zb-P1 的ITS、COXⅡ、TEF-1α 和β-tubulin基因進行擴增，經(jīng)測序分析，確定片段全長分別為839、624、1 061 和1 035 bp。將Zb-P1 的ITS、COXⅡ、TEF-1α 和β-tubulin 序列提交到GenBank，獲得其相應(yīng)的GenBank 登錄號，分別為MZ396820、MZ419442、MZ419444 和MZ419446。將Zb-P1 的ITS、COXⅡ、TEF-1α 和β-tubulin 序列在NCBI 中進行BLAST 同源性分析，發(fā)現(xiàn)其與柑橘褐腐疫霉Phytophthora citrophthora的同源性均在99%以上。采用多基因聯(lián)合系統(tǒng)發(fā)育分析，構(gòu)建ITS-COXⅡ- TEF1-α-β-tubulin 串聯(lián)數(shù)據(jù)集，拼接后，串聯(lián)序列的堿基個數(shù)為2 986 bp，同質(zhì)性檢驗P=0.01，說明ITS、COXⅡ、TEF-1α 和β-tubulin 可進行串聯(lián)分析。使用MEGA10.2.6 軟件，計算串聯(lián)數(shù)據(jù)集的平均遺傳距離，該值為0.089，說明可采用鄰接法（Neighbor-joining，NJ）法建立系統(tǒng)發(fā)育樹。采用NJ法，構(gòu)建Zb-P1 的多基因系統(tǒng)發(fā)育樹（圖4），結(jié)果表明，花椒黑脛病菌Zb-P1 與柑橘褐腐疫霉P. citrophthora 聚在為一支，支持率達(dá)100%。根據(jù)上述花椒黑脛病菌的形態(tài)學(xué)特征及多基因聯(lián)合分子鑒定結(jié)果，將花椒黑脛病菌鑒定為柑橘褐腐疫霉P. citrophthora。

2.5 室內(nèi)毒力測定結(jié)果

15 種殺菌劑對花椒黑脛病菌的菌落生長均表現(xiàn)出不同程度的抑制效果（表1），其中，以氰霜唑、氟啶胺、烯酰·氰霜唑、氟菌·霜霉威、霜脲·錳鋅和烯酰·吡唑酯的抑菌效果較強，其相應(yīng)的EC50 均值分別為1.366 7、0.609 5、0.390 1、0.385 6、0.216 6 和0.182 0 mg·L-1；多抗霉素、吡唑醚菌酯、雙炔酰菌胺和春雷·王銅抑菌作用次之，EC50 均值分別為4.274 4、3.792 4、2.360 7 和1.930 9 mg·L-1；而植物源殺菌劑香芹酚、蛇床子素、小檗堿和苦參堿抑菌效果相對較差，EC50 均值分別為13.246 7、9.411 7、8.244 3 和8.231 5 mg·L-1。

3 結(jié)論與討論

3.1 結(jié) 論

本研究結(jié)合形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)的方法將引起陜西鳳縣花椒黑脛病的病原菌Zb-P1 鑒定為柑橘褐腐疫霉P. citrophthora，對花椒黑脛病菌Zb-P1具有顯著抑菌作用的殺菌劑為40% 烯酰·氰霜唑懸浮劑、68.75% 氟菌·霜霉威懸浮劑、2% 霜脲·錳鋅可濕性粉劑和78% 烯酰·吡唑酯水分散粒劑，相對應(yīng)的EC50 值分別為0.390 1、0.385 6、0.216 6和0.182 0 mg·L-1，而生物源殺菌劑5% 香芹酚可溶液劑、0.4% 蛇床子素可溶液劑、0.5% 小檗堿水劑和0.3% 苦參堿乳油對花椒黑脛病的室內(nèi)毒力較差，EC50 均值高達(dá)13.246 7、9.411 7、8.244 3和8.231 5 mg·L-1。

3.2 討 論

疫霉屬于卵菌，是引起作物病害的重要病原菌之一，目前在世界范圍內(nèi)已發(fā)現(xiàn)超過100 種高侵染性致病疫霉病原[15]，最為著名的是致病疫霉菌P. infestans 引起的馬鈴薯晚疫病及大豆疫霉菌P. sojae 引起的大豆疫霉病。傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)根據(jù)菌絲、孢子囊、藏卵器、雄器、卵孢子或培養(yǎng)性狀的形態(tài)差異特征鑒定疫霉屬卵菌，但由于這些特征不易區(qū)分，界限模糊，給該屬菌物種的鑒定帶來一定的困難，基于形態(tài)學(xué)特征，采用多基因序列分析可對疫霉屬菌物在種水平上進行準(zhǔn)確的鑒定[16-17]。本研究基于花椒黑脛病病原菌的菌落、菌絲、孢子囊及厚垣孢子等形態(tài)特征，聯(lián)合分析其ITS、COXⅡ、TEF-1α 和β-tubulin 這4 個分子序列的特征并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育分析，將陜西鳳縣花椒試驗示范園區(qū)的花椒黑脛病病原鑒定為柑橘褐腐疫霉P. citrophthora。多基因聯(lián)合系統(tǒng)發(fā)育分析能提供豐富的位點基因，通過聯(lián)合不同基因的數(shù)據(jù)集，鑒定結(jié)果準(zhǔn)確性更高，如Luongo 等[12] 采用ITS、TEF-1α、COXⅡ 基因和β-tubulin 基因4 種序列進行同源分析將意大利合歡黑脛病病原鑒定為Phytophthora tropicalis；Maizatul-Suriza 等[18] 同時采用ITS、TEF-1α、COXⅡ、β-tubulin、PpHPAV 基因序列和擴增長度片段多態(tài)性對分離自哥倫比亞和馬來西亞兩個地區(qū)的油棕芽腐病菌P. palmivora進行了比對分析，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，研究其遺傳多樣性及變異情況。利用多基因序列聯(lián)合分析，能更好地區(qū)分疫霉屬內(nèi)的部分近緣種，是對疫霉屬內(nèi)類群鑒定的有效方法。

疫霉在陜西地區(qū)花椒上造成的病害曾有報道， 謝寧等[4] 曾在2013 年報道了陜甘地區(qū)的花椒疫霉病害，基于形態(tài)特征和ITS 序列分析將鳳縣雙十鋪鎮(zhèn)的疫霉菌株P(guān)fs1 鑒定為苧麻疫霉P. boehmeriae、菌株P(guān)fs2 鑒定為多寄主疫霉P. multivora、將鳳縣平木鋪的疫霉菌株P(guān)fp 鑒定為柑橘褐腐疫霉P. citrophthora；而王潔菲等[5] 于2015 年基于病原物形態(tài)特征、ITS 和β-tubulin 序列分析，將鳳縣雙十鋪鎮(zhèn)的花椒疫霉病菌株P(guān)fs3、Pfs4 和Pfs5 鑒定為苧麻疫霉P. boehmeriae。由此可知，盡管是同一地理區(qū)域的同種病害，其病原物有可能不一樣。本研究基于形態(tài)學(xué)特征和ITS、COXⅡ、TEF-1α 和β-tubulin 這4 個分子序列分析，發(fā)現(xiàn)鳳縣花椒試驗示范園區(qū)的黑脛病是由柑橘褐腐疫霉P. citrophthora 引起的，與謝寧等報道的鳳縣平木鋪的疫霉菌株P(guān)fp 鑒定結(jié)果一致，而與王潔菲等報道的結(jié)果有所差異。本研究發(fā)現(xiàn)花椒黑脛病菌Zb-P1 的菌絲能特化形成珊瑚狀菌絲體，這與仇芳等[14] 基于形態(tài)學(xué)特征在鑒定油梨根腐病病原菌發(fā)現(xiàn)的現(xiàn)象一致；此外，本研究未發(fā)現(xiàn)花椒黑脛病菌Zb-P1 在固體培養(yǎng)基上形成卵孢子，與謝寧等[4] 對花椒疫霉病菌菌株P(guān)fp 的鑒定結(jié)果一致，由此說明花椒黑脛病菌Zb-P1 的有性生殖為異宗配合。鳳縣花椒試驗示范園為我國花椒標(biāo)準(zhǔn)示范基地，黑脛病的發(fā)生嚴(yán)重影響了園區(qū)花椒的種植，給示范園區(qū)花椒的管理帶來了一定的困難。本研究綜合形態(tài)學(xué)特征分析和分子生物學(xué)技術(shù)，鑒定了鳳縣花椒試驗示范園區(qū)的黑脛病的病原物，能為園區(qū)花椒黑脛病的有效防控奠定基礎(chǔ)。然而，本研究中花椒黑脛病的采樣區(qū)域僅限于陜西鳳縣花椒產(chǎn)區(qū)，我國花椒種植面積廣泛，在其他花椒產(chǎn)區(qū)是否也有黑脛病的發(fā)生及其病原物是什么也值得后期深入研究。

黑脛病在煙草上報道得較多，也稱“黑桿瘋”，是由煙草疫霉P. nicotianae 引起的一種廣泛分布、嚴(yán)重危害煙草的土傳病害[19]。花椒黑脛病的發(fā)病部位及癥狀與煙草黑脛病相似，均以根莖部發(fā)病為主，向莖髓部蔓延擴展，病株根莖交接處變黑且壞死，葉片自下而上依次變黃、脫落，發(fā)病嚴(yán)重時整株枯死。由疫霉屬卵菌引起的林木病害發(fā)病情況復(fù)雜，其病原物可能會在土壤及其凋落物中富集，因此，這類病害初侵染菌源量的多少與土壤環(huán)境因子密切相關(guān)，如根際土壤微生物的群落結(jié)構(gòu)、土壤理化性質(zhì)、土壤營養(yǎng)成分等，而這些因素又會受到寄主的林齡和品種等各種因素的影響[20-21]，因此，在構(gòu)建花椒園區(qū)時應(yīng)該將這些因素考慮在內(nèi)。近年來，由于花椒黑脛病發(fā)病快、分布廣、防治難等特點，已經(jīng)成為我國花椒產(chǎn)區(qū)最嚴(yán)重的病害之一。本研究在致病性測定時發(fā)現(xiàn)病原菌在莖基部和莖中上部均能侵染發(fā)病，然而，莖中上部的病斑由于保濕措施的去除導(dǎo)致病斑擴展停止，而莖基部病斑仍在擴展。花椒莖基部鄰近土壤，土壤中的水分能為其創(chuàng)造高濕條件，故當(dāng)去除保濕措施后，莖基部的病斑仍可繼續(xù)發(fā)展，推斷高濕環(huán)境有利于該病害的發(fā)展。這也能解釋在田間花椒黑脛病主要發(fā)生在根莖交接部位這一現(xiàn)象，同時，也說明了花椒黑脛病的發(fā)病部位不僅僅局限于莖基部，只要條件合適，也能危害莖干中上部分。卵菌病害由于土壤帶菌隱蔽性極易與其他病害混發(fā)，導(dǎo)致實際生產(chǎn)中防治困難，開展卵菌病原的室內(nèi)殺菌劑篩選能為其有效防治提供指導(dǎo)依據(jù)[22]。疫霉屬菌物是一類重要的植物病原物，本研究測定了卵菌專用殺菌劑、植物源殺菌劑和常見廣譜殺菌劑對花椒黑脛病菌的室內(nèi)毒力，發(fā)現(xiàn)供試的7 種卵菌專用殺菌劑對花椒黑脛病菌的抑菌效果顯著，其中以復(fù)配殺菌劑烯酰·吡唑酯抑菌效果最強。烯酰·吡唑酯是唑醚菌酯和烯酰嗎啉的混配制劑，其中烯酰嗎啉是針對病原卵菌的專一性殺菌劑，抗性風(fēng)險小，作用于卵菌生活史的各個階段，在植株體內(nèi)有分層轉(zhuǎn)移活性和局部內(nèi)吸活性，是卵菌植物病害的有效防控藥劑[23]；而植物源農(nóng)藥對花椒黑脛病病原抑菌效果均不佳；廣譜性殺菌劑中以保護性殺菌劑春雷·王銅的抑菌作用較強，其余3 種廣譜性殺菌劑的抑菌效果一般。本研究針對花椒黑脛病菌開展的室內(nèi)殺菌劑篩選試驗，雖然能為該病害的田間防治藥劑選擇提供一定的指導(dǎo)依據(jù)，然而，田間植物病害發(fā)生復(fù)雜，環(huán)境條件對殺菌劑的功效也會有影響，后期有必要深入開展烯酰·吡唑酯對花椒黑脛病的田間防效試驗，從而為陜西地區(qū)花椒黑脛病的有效防控提供重要指導(dǎo)依據(jù)。

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[ 本文編校：李義華]