非小細(xì)胞肺癌患者血清miR-873和miR-138-5p表達(dá)水平及其與免疫微環(huán)境及預(yù)后的相關(guān)性分析

劉 捷，楊玲玲，程秋霞，高 瞻（.重慶醫(yī)科大學(xué)附屬巴南醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科，重慶 400054；.陸軍軍醫(yī)大學(xué)第二附屬醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科，重慶 400037）

非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）是全世界癌癥相關(guān)死亡的主要原因，我國(guó)是NSCLC 高負(fù)擔(dān)國(guó)家，據(jù)2020年全球癌癥統(tǒng)計(jì)我國(guó)有82 萬(wàn)例肺癌新診斷病例和71.5 萬(wàn)例肺癌相關(guān)死亡病例[1-2]。腫瘤免疫微環(huán)境（tumor immune microenvironment，TIME）是腫瘤細(xì)胞賴(lài)以生存的周?chē)h(huán)境，利于腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖和侵襲，并參與免疫抑制和促進(jìn)治療耐藥性，在NSCLC 的發(fā)生、侵襲和轉(zhuǎn)移過(guò)程中起到作用[3]。微小核糖核酸（micro RNA，miRNAs）參與調(diào)控腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲和免疫逃逸等生物學(xué)過(guò)程，可通過(guò)調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞功能影響TIME，進(jìn)而影響腫瘤進(jìn)展[4]。miR-873 是腫瘤診斷和預(yù)后的分子標(biāo)志物，已被證實(shí)可通過(guò)調(diào)控其靶基因表達(dá)參與癌細(xì)胞增殖、凋亡、遷移和侵襲等過(guò)程，與肝細(xì)胞癌、結(jié)直腸癌、乳腺癌等惡性腫瘤密切相關(guān)[5]。miR-138-5p 在胰腺癌、鼻咽癌、乳腺癌等多種癌癥中被發(fā)現(xiàn)充當(dāng)腫瘤抑制基因，miR-138-5p 表達(dá)缺失與癌細(xì)胞增殖、侵襲和癌癥不良預(yù)后有關(guān)[6]。miR-873 和miR-138-5p 在NSCLC 的報(bào)道十分少見(jiàn)，其在NSCLC 的表達(dá)特點(diǎn)以及臨床意義尚不清楚，鑒于此本研究擬探討血清miR-873 和miR-138-5p 表達(dá)與NSCLC 患者免疫微環(huán)境以及預(yù)后的關(guān)系，以期為臨床NSCLC 治療和預(yù)后分析提供參考。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象 選擇2019年2月～2021年2月重慶醫(yī)科大學(xué)附屬巴南醫(yī)院收治的108 例NSCLC患者（NSCLC 組），男性65 例，女性43 例；年齡≥60 歲60 例，＜60 歲48 例；腫瘤直徑≥3cm 57例，＜3cm 51 例；病理類(lèi)型：鱗癌82 例，腺癌26例；分化程度：低中度分化72 例，高度分化36 例；TNM 分期：Ⅰ～Ⅱ期59 例，Ⅲ～Ⅳ期49 例。納入標(biāo)準(zhǔn)：①經(jīng)穿刺活檢或手術(shù)獲得組織標(biāo)本，病理學(xué)證實(shí)為NSCLC；②入組前未接受任何形式的化療、放療或靶向藥物治療；③有完整的臨床資料；④標(biāo)本的采集和處理符合臨床試驗(yàn)的倫理規(guī)范和操作規(guī)程。排除標(biāo)準(zhǔn)：①其它部位原發(fā)惡性腫瘤；②血液腫瘤、血液疾病和免疫系統(tǒng)疾病。另選擇同期于我院門(mén)診體檢中心體檢的65 例健康志愿者為對(duì)照組，男性39 例，女性26 例，年齡≥60 歲42 例，＜60 歲23 例，兩組性別和年齡分布比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），本研究已經(jīng)獲得我院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 儀器與試劑 miRNeasy Serum/Plasma Kit 試劑（德國(guó)QIAGEN 公司）；Primer Script RT 試劑盒，SYBR Green PCR Kit（日本Takara 公司）；Veriti PCR 儀（美國(guó)賽默飛公司）；Vectra 全自動(dòng)定量病理成像分析系統(tǒng)（美國(guó)PerkinElmer）。

1.3 方法

1.3.1 實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)檢測(cè)miR-873，miR-138-5p 表達(dá)：所有患者入組次日清晨（對(duì)照組體檢當(dāng)日）采集靜脈血3ml 注入干燥試管，待血液凝固后離心（相對(duì)離心力3 024×g，時(shí)間5min）獲得血清，-80℃保存。取血清樣本，miRNeasy Serum/Plasma Kit 試劑提取總RNA，使用Primer Script RT 試劑盒將總RNA 反轉(zhuǎn)錄為cDNA。SYBR Green PCR Kit 和Veriti PCR 儀進(jìn)行qRT-PCR。反應(yīng)條件：95℃初始變性5 min，95℃ 20s，56℃退火30s，72℃延伸1min，35 個(gè)循環(huán)，72℃最終延伸5 min。反應(yīng)體系：SYBR?Premix Ex Taq? II（2×）12.5μl，dNTP1.6μl，Taq DNA 聚合酶1μl，上下游引物10μmol/L 各1μl，加反應(yīng)緩沖液至25μl。引物序列：miR-873 的正向引物為5’-GGGGCAGGAACTT GTG AG-3’，反向引物為5’-GTGTGGTGTGGTATG GTGTG-3’。miR-138-5p 的正向引物為：5’-CTAGA GCTCAACTGAAGTGGCTAAACTG-3’，反向引物為5’-GCTAGGCGTTGAAGTTCTGCCTAAATGC-3’。β-actin（內(nèi)參），上游：5’-TGCGTGACATTAAG GAGAA-3’，下游：5’-AAGGAA GGCTGGAAGAG T-3’。2-ΔΔCt計(jì)算miR-873和miR-138-5p相對(duì)表達(dá)量。

1.3.2 多重免疫熒光染色法檢測(cè)TIME 指標(biāo)：取肺癌組織石蠟標(biāo)本，經(jīng)脫蠟、水化，10 mmol/L 枸椽酸鈉緩沖液孵育10 min，微波20 min，0.3g/dl H2O2處理抑制內(nèi)源性過(guò)氧化物酶活性，5g/dl 脫脂奶粉孵育阻斷非特異性結(jié)合，PBS 洗滌。加入一抗、二抗孵育、漂洗。多重免疫組織化學(xué)試劑盒進(jìn)行熒光標(biāo)記，DAPI 染料復(fù)染、封片，全自動(dòng)定量病理成像分析系統(tǒng)進(jìn)行分析，1+，2+，3+表示陽(yáng)性程度，1+弱陽(yáng)性，2+中等程度陽(yáng)性，3+強(qiáng)陽(yáng)性，采用組織化學(xué)評(píng)分（H 值）分析TIME 中CD3，CD4，CD8，CD68 和CD163，叉頭狀轉(zhuǎn)錄因子3（forked head transcription factor 3，F(xiàn)OXP3）、淋巴細(xì)胞活化基因3（lymphocyte activation gene 3，LAG3）、T 細(xì)胞免疫球蛋白黏蛋白分子3（T-cell immunoglobulin mucin molecule 3，TIM3）、程序性細(xì)胞死亡受體1（programmed cell death receptor 1，PD-1）和程序性細(xì)胞死亡配體1（programmed cell death ligand 1，PD-L1）的蛋白表達(dá)情況，H 值=[（3+）%×3+（2+）%×2+（1+）%×1]×100[7]。

1.3.3 隨訪：NSCLC 患者出院后定期電話隨訪和門(mén)診復(fù)查，隨訪截止2022年6月。記錄隨訪期間NSCLC 患者生存情況。總生存（overall survival，OS）時(shí)間定義為自術(shù)后至全因死亡或隨訪截止時(shí)間。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 SPSS 25.00 進(jìn)行數(shù)據(jù)錄入和分析，經(jīng)K-S 法檢驗(yàn)miR-873,miR-138-5p 和TIME指標(biāo)符合正態(tài)分布以(±s)表示，采用student-t檢驗(yàn)。Pearson 分析血清miR-873,miR-138-5p 表達(dá)與TIME 指標(biāo)的相關(guān)性。Kaplan-Meier 法繪制不同miR-873 和miR-138-5p 表達(dá)下NSCLC 患者生存曲線，Log-Rank 檢驗(yàn)生存率的差異。COX 比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型分析影響NSCLC 患者預(yù)后的危險(xiǎn)因素。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 NSCLC 組和對(duì)照組血清miR 873,miR 138 5p 表達(dá)比較 見(jiàn)表1。NSCLC 組血清miR-873 和miR-138-5p 表達(dá)低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。

表1 NSCLC 組和對(duì)照組血清miR-873,miR-138-5p表達(dá)比較（±s）

表1 NSCLC 組和對(duì)照組血清miR-873,miR-138-5p表達(dá)比較（±s）

指標(biāo)NSCLC 組（n=108）對(duì)照組（n=65）t 值P 值miR-873（2-ΔΔCt）1.02±0.23 3.15±0.82-25.426 0.001 miR-138-5p（2-ΔΔCt） 1.21±0.26 3.54±0.92-24.769 0.001

2.2 NSCLC 血清miR-873,miR-138-5p 表達(dá)與患者臨床病理特征的關(guān)系 見(jiàn)表2。TNM 分期Ⅲ～Ⅳ期、低中度分化患者血清miR-873 和miR-138-5p表達(dá)低于TNM 分期Ⅰ～Ⅱ期、高度分化患者（均P＜0.05），不同性別、年齡分布、病理類(lèi)型、腫瘤直徑之間血清miR-873 和miR-138-5p 表達(dá)比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）。

表2 不同NSCLC 臨床病理特征患者血清miR-873,miR-138-5p 表達(dá)比較(±s)

表2 不同NSCLC 臨床病理特征患者血清miR-873,miR-138-5p 表達(dá)比較(±s)

類(lèi) 別nmiR-873（2-ΔΔCt）tPmiR-138-5p（2-ΔΔCt）tP性別男650.99±0.25 1.19±0.30 0.9490.345女431.07±0.161.24±0.21 1.8600.066年齡（歲）≥60601.00±0.26 1.18±0.31 1.1320.260 1.3880.168＜60481.05±0.181.25±0.18腫瘤直徑（cm）≥3570.98±0.25 1.9220.057 1.17±0.25 1.9550.053＜3511.06±0.171.25±0.16病理類(lèi)型鱗癌821.01±0.23 1.20±0.21 0.8270.410腺癌261.05±0.201.24±0.23 0.7960.428分化程度高度分化361.15±0.09 1.32±0.10 9.6150.001 6.8890.001低中度分化720.96±0.101.16±0.12 TNM 分期Ⅰ～Ⅱ期591.10±0.11 10.2530.001 1.26±0.16 3.3610.001ⅢA 期490.92±0.061.15±0.18

2.3 miR-873，miR-138-5p 表達(dá)與TIME 指標(biāo)的相關(guān)性 見(jiàn)表3。NSCLC 患者CD3，CD4，CD8，CD68，CD163，F(xiàn)OXP3，LAG3，TIM3，PD-1 和PD-L1 的H值分別為5.21，4.02，13.02，2.02，1.32，1.16，3.35，16.02，17.43 和15.32。血清miR-873和miR-138-5p 表達(dá)與PD-1，PD-L1，CD4，CD8 的H值呈負(fù)相關(guān)（均P＜0.05），與CD3，CD68，CD163，F(xiàn)OXP3，LAG3 和TIM3 的H值無(wú)相關(guān)性（均P＞0.05）。

表3 miR-873，miR-138-5p 表達(dá)與TIME 指標(biāo)的相關(guān)性

2.4 不同miR-873,miR-138-5p 表達(dá)NSCLC 患者生存比較 中位隨訪21（4～40）月，108 例患者中失訪5 例，余103 例患者在隨訪期間死亡56例，繪制Kaplan-Meier 生存曲線，低表達(dá)miR-873（＜1.02，n=52）和低表達(dá)miR-138-5p（＜1.21，n=53）NSCLC 患者OS 生存率為34.62%（18/52），32.08%（17/53），低于高表達(dá)miR-873（≥1.02，n=51） 和高表達(dá)miR-138-5p（ ≥1.21，n=50）NSCLC 患者的56.86%（29/51），60.00%（30/50），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Log-Rankχ2=4.724，5.607，均P＜0.05），見(jiàn)圖1。

圖1 不同miR-873，miR-138-5p 表達(dá)NSCLC 患者生存曲線

2.5 影響NSCLC 生存的因素分析 見(jiàn)表4。以NSCLC 患者生存情況為因變量（0=存活，1=死亡），納入年齡（賦值：0=＜60 歲，1=≥60 歲），性別（賦值：0=女，1=男），腫瘤直徑（賦值：0=＜3cm，1=≥3cm），病理類(lèi)型（賦值：0=鱗癌，1=腺癌），分化程度（賦值：0=高度分化，1=低中度分化），TNM 分期（賦值：0=Ⅰ～Ⅱ期，1=Ⅲ～Ⅳ期），miR-873（賦值：0=高表達(dá)，1=低表達(dá)），miR-138-5p（賦值：0=高表達(dá)，1=低表達(dá)）為自變量。單因素COX比例風(fēng)險(xiǎn)回歸分析結(jié)果顯示分化程度、TNM 分期、miR-873,miR-138-5p 與NSCLC 患者預(yù)后有關(guān)（P＜0.05）。多因素COX 比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型（向后逐步法篩選變量），結(jié)果顯示TNM分期Ⅲ～Ⅳ期是NSCLC 患者不良預(yù)后的危險(xiǎn)因素（P＜0.05），miR-873 和miR-138-5p 是保護(hù)因素（P＜0.05）。

表4 影響NSCLC 生存的單因素和多因素COX 比例風(fēng)險(xiǎn)回歸

3 討論

研究顯示腫瘤往往與其賴(lài)以生存的微環(huán)境相依相行，腫瘤免疫微環(huán)境（TIME）是一個(gè)極其復(fù)雜的系統(tǒng)，包括細(xì)胞和非細(xì)胞成分，如血管、成纖維細(xì)胞、免疫細(xì)胞、骨髓來(lái)源的炎癥細(xì)胞、信號(hào)化學(xué)物質(zhì)和細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM），上述細(xì)胞和非細(xì)胞成分均可與腫瘤細(xì)胞相互作用，促使惡性細(xì)胞表型和行為，如增殖、侵襲、上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化、血管生成和耐藥等，并影響免疫治療應(yīng)答，與腫瘤進(jìn)展和預(yù)后密切相關(guān)[8-9]。TIME 中含有大量的免疫細(xì)胞，部分具有抑癌作用，比如CD8+T 細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞，部分抑制免疫功能發(fā)揮促瘤作用，如調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞和髓源性抑制細(xì)胞。miRNAs 是一種小型非編碼RNA，能通過(guò)抑制信使RNA 翻譯或促進(jìn)信使RNA 降解在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)基因表達(dá)，包括癌癥、心血管和代謝疾病在內(nèi)的無(wú)數(shù)生理過(guò)程和病理過(guò)程高度依賴(lài)于miRNAs 的調(diào)節(jié)，miRNAs 在TIME 腫瘤細(xì)胞與其周?chē)庖呒?xì)胞相互作用過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用，miRNA 可控制腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生趨化因子或細(xì)胞因子，影響免疫細(xì)胞的遷移和擴(kuò)張，直接調(diào)節(jié)TIME的成分，促進(jìn)效應(yīng)功能、抗原呈遞、表型極化和不同程度的免疫抑制，還可通過(guò)外泌體運(yùn)輸?shù)矫庖呒?xì)胞，影響免疫微環(huán)境[10]。

miR-873 位于染色體9p21.1 上，包括miR-873-5p 和miR-873-3p 兩個(gè)主要成員，miR-873 具有多種靶基因以及獨(dú)特的催化活性、轉(zhuǎn)錄調(diào)控、結(jié)合等分子功能，miR-873 可通過(guò)磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B/哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白、Wnt/β-Catenin，核因子-κβ 和絲裂原細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶/細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶等信號(hào)通路，參與癌細(xì)胞增殖、凋亡、遷移、侵襲、細(xì)胞周期、細(xì)胞干性和化療反應(yīng)等過(guò)程，影響癌癥發(fā)展[11]。研究顯示miR-873 在胃癌中表達(dá)下調(diào)，通過(guò)靶向含THUMP結(jié)構(gòu)域蛋白1 抑制胃癌細(xì)胞增殖、侵襲，并促使化療敏感[12]。在結(jié)腸癌發(fā)病機(jī)制中，miR-873 通過(guò)靶向調(diào)節(jié)腫瘤抑制候選基因3，抑制癌細(xì)胞的增殖、集落形成和侵襲，抑制癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移[13]。miR-873-5p在乳頭狀甲狀腺癌組織和細(xì)胞系中表達(dá)下調(diào)，通過(guò)靶向CXC 趨化因子配體16 抑制p65 和Rel-B 磷酸化，降低基質(zhì)金屬蛋白酶1，9 和13mRNA 和蛋白表達(dá)，抑制甲狀腺癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，發(fā)揮抑瘤作用[14]。本研究發(fā)現(xiàn)NSCLC 患者血清miR-873 表達(dá)降低，且與高TNM 分期、中低分化程度、不良預(yù)后有關(guān)。研究顯示miR-873 可能通過(guò)調(diào)節(jié)叉頭框蛋白M1 抑制癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲，并增加癌細(xì)胞凋亡[15]。進(jìn)一步分析miR-873 與TIME指標(biāo)PD-1，PD-L1，CD4，CD8 的H值呈負(fù)相關(guān)，表明miR-873 可能參與TIME 調(diào)控過(guò)程，抑制NSCLC 進(jìn)展。分析原因：首先，miR-873 通過(guò)直接結(jié)合PD-L1 的3’-未翻譯區(qū)抑制PD-L1 的表達(dá)以及PD-L1 下游磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B 信號(hào)通路，減弱乳腺癌細(xì)胞的干性和化療耐藥性[16]；其次，單核細(xì)胞通過(guò)誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞毒性，抑制轉(zhuǎn)移，吞噬腫瘤物質(zhì)和負(fù)調(diào)控Treg細(xì)胞，能夠抑制腫瘤的進(jìn)展，靜息樹(shù)突狀細(xì)胞（又稱(chēng)未成熟樹(shù)突狀細(xì)胞）能有效地捕獲抗原，通過(guò)調(diào)節(jié)T 細(xì)胞的活化，參與維持自我耐受性，抑制肺癌進(jìn)展[17]，miR-873 可能通過(guò)降低單核細(xì)胞和靜息樹(shù)突狀細(xì)胞相對(duì)比例參與TIME調(diào)控過(guò)程，抑制NSCLC 進(jìn)展[18]。因此miR-873 表達(dá)降低，其抑癌作用減弱，導(dǎo)致NSCLC 惡性進(jìn)展和不良預(yù)后的發(fā)生。

miR-138-5p 在多癌癥類(lèi)型表達(dá)下調(diào)，被稱(chēng)為腫瘤抑制因子，現(xiàn)有報(bào)道顯示miR-138-5p 通過(guò)外泌體從乳腺癌細(xì)胞傳遞到腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞，下調(diào)賴(lài)氨酸特異性去甲基化酶6B 的表達(dá)，抑制巨噬細(xì)胞M1 極化，刺激M2 極化，抑制腫瘤進(jìn)展[19]。miR-138-5p 通過(guò)抑制靶向叉頭盒C1 表達(dá)，抑制前列腺癌細(xì)胞增殖、集落形成、細(xì)胞遷移和侵襲，發(fā)揮腫瘤抑制基因作用[20]。miR-138-5p 還可通過(guò)靶向抑制DEK 表達(dá)，抑制胃癌細(xì)胞增殖和腫瘤生長(zhǎng)[21]。miR-138-5p 在膠質(zhì)瘤中下調(diào)，miR-138-5p 過(guò)表達(dá)可通過(guò)靶向抑制其靶基因高遷移率盒蛋白13，下調(diào)脊椎蛋白2 的表達(dá)，抑制膠質(zhì)瘤血管生成[22]。本研究發(fā)現(xiàn)NSCLC 患者血清miR-138-5p 表達(dá)下調(diào)，且與高TNM 分期、中低分化程度、NSCLC 患者低生存率有關(guān)。分析miR-138-5p 參與NSCLC 的機(jī)制為：miR-138-5p 可能通過(guò)靶向smad 核相互作用蛋白1抑制肺癌細(xì)胞增殖和遷移[23]，miR-138-5p 可直接結(jié)合到CDK8 的3’未翻譯區(qū)抑制細(xì)胞周期G0/G1 期阻滯，減緩癌細(xì)胞生長(zhǎng)，增加癌細(xì)胞凋亡[24]。本研究發(fā)現(xiàn)miR-138-5p 與TIME 指標(biāo)PD-1，PD-L1，CD4，CD8 的H值呈負(fù)相關(guān)，miR-138-5p 可能還參與NSCLC 的免疫應(yīng)答，與TIME 有關(guān)。miR-138-5p 作為一種靶向PD-L1 的強(qiáng)腫瘤抑制因子[25]，可直接下調(diào)樹(shù)突細(xì)胞和T 細(xì)胞上PD-L1 和PD-1 的表達(dá)，激活免疫系統(tǒng)，降低腫瘤細(xì)胞中Ki67 和微小染色體維持蛋白2 的表達(dá)，抑制腫瘤生長(zhǎng)[26]。可見(jiàn)miR-138-5p 在NSCLC 發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮抑癌基因作用，miR-138-5p 低表達(dá)可能促使NSCLC 惡性進(jìn)展，與不良預(yù)后有關(guān)。

綜上，NSCLC 患者血清miR-873 和miR-138-5p 表達(dá)均較健康對(duì)照組下調(diào)，miR-873 和miR-138-5p 表達(dá)缺失與NSCLC 惡性病理特征以及低生存率有關(guān)。miR-873 和miR-138-5p 可能通過(guò)調(diào)控TIME參與NSCLC 發(fā)病過(guò)程。本研究創(chuàng)新性地為證實(shí)miR-873，miR-138-5p 與NSCLC 病理特征、TIME以及預(yù)后的關(guān)系，為NSCLC 臨床治療提供了新的靶點(diǎn)，為預(yù)后分析提供了新的標(biāo)志物。不足之處在于尚不能直接證實(shí)miR-873，miR-138-5p 與TIME的關(guān)系，仍需開(kāi)展體外細(xì)胞培養(yǎng)或構(gòu)建動(dòng)物模型來(lái)進(jìn)一步探討。