基于生物信息學分析雙硫死亡相關基因PDLIM1 mRNA在多種腫瘤中的表達及臨床應用價值

刁 迅，范綺雨，耿良棟，劉繼斌，朱衛華（.南通大學附屬腫瘤醫院，江蘇南通 6006；.南通大學附屬醫院普外科，江蘇南通 600）

雙硫死亡（disulfidptosis）是新發現的一種因二硫化物應激誘導的細胞死亡的機制，與已知的細胞死亡機制不同，它與肌動蛋白細胞骨架有關[1]。PDZ 和LIM 域蛋白1（PDZ and LIM domain protein 1,PDLIM1）是人PDZ-LIM 蛋白家族的成員之一，又名（CLIM1）或CLP36，是一種細胞骨架蛋白[2]。它可作為銜接分子，介導包括信號轉導在內的蛋白質與細胞骨架相互作用[3]。盡管PDLIM1 與腫瘤[4-6]之間的關系得到廣泛的關注，但其在免疫微環境和作用機制等方面的作用仍不清楚。因此本研究擬通過生物信息學分析PDLIM1 在表達水平、診斷、預后、免疫浸潤、基因富集及藥物敏感性等方面的情況。以期找到一種新的腫瘤診斷和預后生物標志物或治療靶點，作為個性化患者治療的基礎。

1 材料與方法

1.1 數據來源 本研究中腫瘤的PDLIM1 RNAseq數據主要為美國加州大學圣克魯茲分校（US University of California Sant Cruz，UCSC ）XENA(https://xenabrowser.net/datapages/)經Toil 流程統一處理的TPM 格式的RNAseq 數據。部分缺少UCSC 數據的模塊將利用癌癥基因組圖譜(the Cancer Genome Atlas ，TCGA)中數據補充研究內容。數據處理方法:log2(value+1)。所有數據均在線數據庫直接獲取，不涉及倫理問題。文章中所涉及到的所有腫瘤及其相關縮寫：腎上腺皮質癌（adrenocortical carcinoma，ACC），膀胱尿路上皮癌（bladder urothelial carcinoma，BLCA），乳腺浸潤癌（breast invasive carcinoma，BRCA），宮頸癌（cervical squamous cell carcinoma and endocervical adenocarcinoma，CESC）， 膽管癌（cholangiocarcinoma，CHOL），結腸癌（colon adenocarcinoma，COAD），結直腸癌（colon adenocarcinoma/rectum adenocarcinoma esophageal carcinoma，COADREAD），彌漫性大B 細胞淋巴瘤（lymphoid neoplasm diffuse large b-cell lymphoma，DLBC），食管癌（esophageal carcinoma，ESCA），FFPE 試點二期（FFPE pilot phase II，FPPP），多形性膠質細胞瘤（glioblastoma multiforme，GBM），膠質瘤（glioma，GBMLGG）、頭頸鱗狀細胞癌（head and neck squamous cell carcinoma，HNSC），腎嫌色細胞癌（kidney chromophobe，KICH），混合腎癌（pan-kidney cohort(KICH+KIRC+KIRP)，KIPAN），腎透明細胞癌（kidney renal clear cell carcinoma，KIRC），腎乳頭狀細胞癌（kidney renal papillary cell carcinoma，KIRP），急性髓細胞樣白血病（acute myeloid leukemia，LAML），腦低級別膠質瘤（brain lower grade glioma，LGG），肝細胞肝癌（liver hepatocellular carcinoma，LIHC），肺腺癌（lung adenocarcinoma，LUAD），肺鱗癌（lung squamous cell carcinoma，LUSC），間皮瘤（mesothelioma，MESO），卵巢癌（ovarian serous cystadenocarcinoma，OV），胰腺癌（pancreatic adenocarcinoma，PAAD），嗜鉻細胞瘤和副神經節瘤（pheochromocytoma and paraganglioma，PCPG），前列腺癌（prostate adenocarcinoma，PRAD），直腸腺癌（rectum adenocarcinoma，READ），肉瘤（sarcoma，SARC），胃癌（stomach adenocarcinoma，STAD），黑色素瘤（skin cutaneous melanoma，SKCM），胃和食管癌（stomach and esophageal carcinoma，STES），睪丸癌（testicular germ cell tumors，TGCT），甲狀腺癌（thyroid carcinoma，THCA），胸腺癌（thymoma，THYM），子宮內膜癌（uterine corpus endometrial carcinoma，UCEC），子宮肉瘤（uterine carcinosarcoma，UCS），葡萄膜黑色素瘤（uveal melanoma，UVM），骨肉瘤（osteosarcoma，OS），白血病（acute lymphoblastic leukemia，ALL），神經母細胞瘤（neuroblastoma，NB），腎母細胞瘤（high-risk wilms tumor，WT）。

1.2 方法

1.2.1 獲取PDLIM1mRNA 的表達情況：利用仙桃學術（https://www.xiantao.love/）中的“[泛癌]分組比較”模塊分析PDLIM1 mRNA 在33 種腫瘤中的表達情況。UCSC XENA 數據集中共有18 102 例數據，包括：7 568 例來自GTEx 正常數據、727 例來自TCGA 癌旁數據、9 807 例來自TCGA 腫瘤數據。

使用人類蛋白質圖譜（The Human Protein Atlas，HPA）數據庫（https://www.proteinatlas.org/）中的“TISSUE”和“PATHOLOG”模塊，探究 PDLIM1蛋白在多個腫瘤組織及正常組織中免疫組織化學染色情況（抗體HPA017010）。

1.2.2 探究PDLIM1mRNA 在腫瘤中的診斷能力：利用仙桃學術中的“云診斷ROC”模塊繪制受試者工作特征(ROC)曲線探究PDLIM1mRNA 表達在腫瘤中的診斷能力。

1.2.3 探究PDLIM1mRNA 表達與腫瘤患者總生存期的關系：利用Sangerbox 3.0 數據分析平臺（http://www.sangerbox.com/） 的單基因“泛癌分析”模塊分析在UCSC 數據庫中44 種腫瘤中的PDLMI1 與總生存期（overall survival， OS）的關系，參數選擇如下：數據來源（TCGA + GTEx），樣本量（所有樣本（79 630），數據變換[log2(x+1)]。

1.2.4 探究PDLIM1 mRNA 表達與臨床分級、分期的相關性：利用TISIDB（an integrated repository portal for tumor-immune system interactions）網站(http://cis.hku.hk/TISIDB/index.php)中的“Clinica”模塊對PDLIM1 mRNA 的表達與臨床分級和分期的關系進行分析。

1.2.5 探究PDLIM1mRNA 與免疫細胞浸潤的相關性：使用Sangerbox 3.0 中的“免疫細胞分析Timer”模塊分析PDLIM1mRNA 表達與在38 種腫瘤中與多種免疫細胞之間的相關性，參數選擇如下：數據來源（TCGA + GTEx），數據變換[log2(x+1)]。在Kaplan-Meier Plotter(https://kmplot.com/analysis/)的“Immunotherapy”模塊中根據PDLIM1mRNA表達水平分組對所有腫瘤病人進行分析,將Sample acquisition:選項設置為Ontreatment 選項，其余保持默認設置。

1.2.6 蛋白質互作網及富集分析：在檢索相互作用基因的搜索工具STRING（https://string-db.org/）搜索PDLIM1，篩選置信度得分≥ 0.4 ，獲得20 個與PDLIM1 存在互作的蛋白。然后利用Cytoscape（Cytoscape_v3.9.1）軟件評分，預測最關鍵蛋白，并進行基因本體論（Gene Ontology,GO）和京都基因與基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG）富集分析以確定相關的功能和途徑。最后利用基因組癌癥分析（Gene Set Cancer Analysis，GSCA）(http://bioinfo.life.hust.edu.cn/GSCA/#/)在癌癥治療反應門戶（Cancer Therapeutics Response Portal ，CTRP）數據庫中探索PDLIM1 在腫瘤中基因表達與藥物敏感性。

1.3 統計學分析 在腫瘤中的表達分析采用的統計方法為Wilcoxon 秩和檢驗。在與總生存期（overall survival，OS）的分析中使用Logrank test 方法進行分析。與臨床參數的相關性分析采用了Logrank test。R 軟件包psych(version 2.1.6)的corr.test 函數被用于免疫方面的研究中。P＜0.05 為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 PDLIM1mRNA 及蛋白在正常組織及腫瘤組織中的表達分析 通過仙桃在線網站分析PDLIM1mRNA 在33 種腫瘤組織中的表達情況（圖1A），發現相對于癌旁組織PDLIM1 mRNA 在大多癌癥組織中高表達。在ACC，BRCA，KICH，LAML，LUAD，LUSC，PRAD，SKCM 和UCS中低表達，僅在BLCA，MESO，PCPG，SARC，UCEC 和UVM 中差異無統計學意義（均P＞0.05）。

相對于對應的正常組織，PDLIM1 蛋白在子宮頸、肝、卵巢、腎和膀胱的腫瘤組織中表達更高，免疫組織化學染色表現為中等或者高染色。在子宮內膜癌中表達低于對應的正常組織，免疫組織化學染色為未檢出（圖1B～G）,這驗證了我們在圖1A中的預測。

2.2 PDLIM1 的診斷能力分析 PDLIM1mRNA表達在33 種腫瘤的診斷價值（除CHOL,HNSC,SARC 中的數據來自TCGA，MESO 和OVM數據缺少，其他數據均來自UCSC）。表1所示，PDLIM1 在18 種腫瘤中具有較高的預測能力，尤其是在CHOL，GBM，KIRC，LUAD，OV，PAAD，SKCM 和TGCT 中。

2.3 PDLIM1mRNA 表達與腫瘤患者OS 的關系 本研究旨在分析PDLIM1mRNA 表達水平與44 種腫瘤患者OS 之間的關系。通過對OS 的COX 比例風險模型分析發現PDLIM1mRNA 在7 個腫瘤類型（GBMLGG，LGG，KIPAN，GBM，MESO，UVM和ACC）中高表達預后差，在1 個腫瘤類型(SARC)中低表達預后差（見圖2）。

圖2 PDLIM1 表達與33 種腫瘤預后的OS 森林圖

2.4 PDLIM1mRNA 表達與臨床分期、分級的相關性 見圖3A～E。PDLIM1mRNA 的表達在5 種腫瘤中與臨床分期存在相關性。在HNSC，KIRP 和UCEC 腫瘤中PDLIM1mRNA 的表達和分期呈負相關，在UVM 呈正相關。PDLIM1mRNA 的表達在4種腫瘤中與臨床分級存在相關性。在CESC，HNSC和UCEC中PDLIM1mRNA的表達與分級呈負相關，而在LGG 中呈正相關。見圖3F～I。

圖3 PDLIM1mRNA 與臨床分期、分級之間的相關性

2.5 PDLIM1mRNA 表達與腫瘤免疫微環境的相關性 見圖4A。研究PDLIM1mRNA 表達與38 種腫瘤類型中9 406 個腫瘤樣本的6 類免疫細胞浸潤評分（B cell，T cell CD4，T cell CD8，Neutrophil，Macrophage 和DC 浸潤評分）。分析發現在36 種腫瘤中PDLIM1mRNA 表達與免疫浸潤顯著相關。將在獲得的免疫治療的患者以PDLIM1mRNA 表達的中位數分為高低兩組，發現PDLIM1mRNA 高表達的患者在經過免疫治療后具有更好的OS，見圖4B。

圖4 PDLIM1 mRNA 表達與腫瘤免疫微環境的相關性

2.6 PDLIM1 的相互作用蛋白分析 為進一步闡明PDLIM1 在腫瘤中的生物學功能，利用STRING 共獲得20 個與PDLIM1 存在直接相關或間接相互作用的結合蛋白，并構建PPI 網絡。使用Cytoscape 計算打分，見圖5。發現在構建的PPI 網絡中最關鍵的蛋白是人黏著蛋白（Vinculin，VCL）（Betweenness值最高，為32）。我們將獲得的所有蛋白進行了GO 和KEGG 分析發現：GO 和KEGG 富集的通路主要涉及肌動蛋白細胞骨架、細胞黏附、腫瘤相關途徑的調節。PDLIM1 和VCL 最敏感藥物分別是異甘草素（Isoliquiritigenin）和貝利司他（Belinostat）。

圖5 PDLIM1 互作蛋白共同構建PPI 網絡

3 討論

癌癥是一個全球范圍內公認的公共衛生問題[7]。根據國際癌癥研究機構編制的 GLOBOCAN 2020癌癥發病率和死亡率估計值提供了全球癌癥負擔的最新信息，預計2040年全球癌癥負擔將達到2 840萬例，比 2020年增加7%[8]。因此對癌癥的預防、診斷和治療方面的研究引起人們廣泛關注。而基于腫瘤的生物信息學分析為腫瘤的診斷和治療打開了新的思路[9]。挖掘對多種腫瘤有效的生物標志物可以使沒有有效靶點的腫瘤得到有效診斷和治療[10]，可以為腫瘤預防和個性化治療策略提供新穎而深入的見解[11-13]。近日，劉曉光等[14]人揭示了一種代謝相關的細胞死亡形式：雙硫死亡。研究發現，在葡萄糖缺乏時，腎癌細胞中溶質載體家族7 成員11(solute carrier family 7 member 11,SLC7A11)蛋白的高表達加速了還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）的耗竭，導致二硫化物的積累，誘導雙硫應激，這種應激激活了Rac/ WAVE 調節復合物(WRC)-7 亞基肌動蛋白相關蛋白2/3(Arp2/3)信號通路，從而造成細胞骨架的紊亂，最終誘導細胞發生雙硫死亡[1,14]。簡而言之，細胞骨架蛋白對二硫化物應激的敏感性介導了雙硫死亡。而PDLIM1 是一種與肌動蛋白應力纖維相關的細胞骨架蛋白[2]，故我們合理推測PDLIM1 可能介導雙硫死亡的發生。細胞骨架蛋白在體內以協調的方式起作用，在細胞癌變過程中可通過重新編程，從而參與調節腫瘤的侵襲和轉移擴散[15]。故進一步分析PDLIM1在腫瘤中的作用，可能為腫瘤預防、治療找到新靶點。

本研究首次利用生物信息學系統、全面地分析PDLIM1 在腫瘤中的作用。研究發現PDLIM1mRNA過表達可以促進慢性粒細胞白血病細胞的增殖和抑制細胞凋亡，加速其癌變的進程[16]。在乳腺癌中PDLIM1 可通過與α-輔肌動蛋白1 和α-輔肌動蛋白-4 的相互作用，從而參與細胞運動、腫瘤浸潤與遷移。或通過抑制CDC42 的活性，從而參與細胞功能（細胞形態、細胞遷移、內吞）和細胞周期的調節[17]。還可以通過PDZ 結構域與CD271羧基端含有絲氨酸的PDZ 結合基序作用,從而促進CD271 依賴的膠質瘤的浸潤。或者通過上皮-間充質轉化相關轉錄因子Slug 調控神經鈣粘素和β-連環蛋白表達,進而調節膠質瘤細胞的遷移和侵襲[17]。我們在關于PDLIM1mRNA 表達與腫瘤預后的研究中發現，在包括腦低級別膠質瘤和多形性膠質細胞瘤在內的多種膠質瘤中PDLIM1 的高表達往往腫瘤患者預后較差，這再次驗證了我們的分析。令人值得思考的是，在肉瘤中PDLIM1 低表達往往提示預后較差。可能是低PDLIM1 降低E-鈣黏素/β-連環蛋白復合體的穩定性，從而促進腫瘤細胞上皮間質轉化（Epithelial-mesenchymal transition，EMT），加速腫瘤的進展[18]。這些研究表明PDLIM1 在多種腫瘤中的發生發展中具有良好的診斷和預后價值。

免疫細胞浸潤影響腫瘤預后是毋庸置疑的[19]。而免疫療法的應用顯著改善了部分患者的預后[20]。目前常見的免疫療法靶點包括PD1，PDL1 和CTAL-4 等，它們在高浸潤表型患者中都顯著上調[21]。我們的研究發現PDLIM1 的表達在以前列腺癌為首的36 種腫瘤中與免疫浸潤呈顯著相關。有研究發現在卵巢癌患者中，抗PDLIM1 自身抗體應答與PDLIM1 在卵巢癌組織中的高表達呈正相關，可作為CA125 的補充措施，提高卵巢癌檢測的能力[4]。同樣在胰腺癌中，PDLIM1 也可作為自身抗原誘導體液免疫應答[17]。而在對乳腺癌的研究中發現PDLIM1 的表達水平與CD8+T 細胞和樹突狀細胞的浸潤水平呈正相關[17,22]。并且我們在對PDLIM1的免疫治療隊列分析中，發現PDLIM1 高表達的患者在經過免疫治療后，往往擁有更長的OS。這表明PDLIM1 高表達的患者更有接受免疫治療的必要，這為PDLIM1 mRNA 高表達患者的治療提供了新方向。

為了進一步探索PDLIM1 在腫瘤中的作用，我們利用PDLIM1 構建了PPI 網絡。發現PDLIM1 主要通過參與肌動蛋白細胞骨架、細胞黏著和腫瘤等相關途徑發揮作用，而肌動蛋白網絡的調控是已確定的雙硫死亡的機制之一[1,14]，這再次驗證了我們的推測。我們首次提出PDLIM1 參與調節的網絡中黏著斑蛋白（VCL）是最關鍵蛋白。VCL 是一種與細胞-細胞和細胞-基質連接相關的細胞骨架蛋白，它被認為是參與將 F-肌動蛋白錨定到膜上的幾種相互作用蛋白之一，可以通過調節上皮細胞黏附分子（EPCAM）的表達來影響EMT 和腫瘤免疫[23]。然后我們探討了PDLIM1 在腫瘤中的藥物敏感性。發現PDLIM1 最敏感的藥物是Isoliquiritigenin。靶向細胞骨架蛋白并不是腫瘤治療中的新策略，其臨床療效早在50年前就已通過其抗有絲分裂能力得到證實[15]。紫杉醇和長春新堿等微管特異性化療藥物是化療中常見的細胞骨架特異性毒物，目前仍然是腫瘤治療的主要藥物[15]。但耐藥性仍然是一個重要的未解決的臨床問題，需要開發有效的新型化合物。研究表明Isoliquiritigenin 已在多種疾病模型中被證實是一種強大的抗氧化劑，可通過激活 Sirtuin 1 和Nrf2 發揮作用[24-26]。且在多種腫瘤中被證實具有潛在的治療價值。如：Isoliquiritigenin 可通過靶向 p38 MAPK 信號傳導阻斷自噬來抑制胰腺癌的進展[27]；靶向 TGF-β/Smad 信號通路逆轉 EMT 抑制轉移性子宮內膜癌的進展[28]；抑制 AMPK 和 Akt/mTOR 介導的糖酵解和乳酸生成參與結直腸癌的治療[29]。但Isoliquiritigenin 是如何影響PDLIM1 的還需要我們進一步的探索。

通過以上研究，我們足以有理由推測PDLIM1在腫瘤的發生發展中起重要作用。進一步探討PDLIM1 在腫瘤中的作用機制，有望為腫瘤治療找到新的靶點。

同樣，本研究還存在一些局限性：①本研究是基于公共數據庫的數據進行的生物信息學分析，由于納入分析的數據不同，預測得到的結果也存在一定偏差。②本研究中的所有預測都需要進一步的實驗來驗證。

綜上所述，PDLIM1 有潛力成為一種新的診斷性的和預后性的腫瘤標記物。并且，因為PDLIM1與免疫浸潤相關，可以預測免疫治療的療效，故也有潛力成為一個新的分子靶點。