重度子癇前期患者胎盤組織中CD44 mRNA和CD24 mRNA及蛋白表達水平的臨床價值研究

滕玲玲，馬廣貞，石 可，呂穎欣，徐 靜（1.聊城市第二人民醫院 a.產科；b.病理科，山東臨清5601；.河北醫科大學第一醫院產科，石家莊 050000）

子癇前期（preeclampsia，PE）是最危險的妊娠高血壓疾病之一，在妊娠20 周后發展，發生在2%～8%的妊娠中[1]。重度子癇前期（severe preeclampsia，SPE）是PE 較為嚴重的類型，發生率約為14.20%，嚴重威脅孕婦和圍產兒的健康[2-3]。由于目前對SPE 的發病機制尚不明確，在臨床中SPE 的防治是個巨大挑戰[1]。因此探尋與SPE 有關的生物標志物為SPE的臨床診療提供新的研究方向。研究表明，PE 是全身性血管疾病[4]。細胞表面跨膜糖蛋白分子（cell surface transmembrane glycoprotein molecules，CD）44 是一種跨膜80～90 kDa 細胞表面黏附分子糖蛋白，與細胞外結構域配體的相互作用對細胞信號傳導調節至關重要，包括血管生成、細胞遷移和侵襲等過程[5]。CD24 是一種細胞黏附分子，與各種實體瘤的轉移性腫瘤進展有關，研究發現CD44，CD24 低表達與三陰性乳腺癌患者的預后不良密切相關[6]。目前，CD44，CD24 在SPE 中的研究鮮有報道。因此，本研究通過檢測SPE 患者胎盤組織中CD44 mRNA，CD24 mRNA 及蛋白表達水平，探討二者對SPE 的臨床診療價值。

1 材料與方法

1.1 研究對象 選取2019年6月～2022年6月在聊城市第二人民醫院接受剖宮產分娩的SPE 患者，根據發病孕齡的不同，進一步將其分為早發型SPE組（孕齡≤34 周，n=45）和晚發型SPE 組（孕齡＞34 周，n=55）。納入標準：①符合《婦產科學》[7]中SPE 的診斷標準；②活胎單妊娠；③自然受孕。排除標準：①并發傳染、免疫、血液性系統疾病者；②并發惡性腫瘤者；③并發心、肝、腎等功能障礙者；④并發生殖器官畸形及其他妊娠并發癥者。選取同期產檢正常者100 例為對照組。SPE 組年齡為23～49 歲，BMI 為20～36 kg/m2，分娩孕周為32～40 周。對照組年齡為23～48 歲，BMI 為19～34 kg/m2，分娩孕周為31～39 周。兩組間年齡無顯著性差異（t=0.314，P＞0.05），具有可比性。兩組間BMI 和分娩孕周差異具有統計學意義（t=5.360，3.232，均P＜0.05）。本研究通過本院倫理委員會批準，并得到所有參與者的知情同意。

1.2 儀器與試劑 TRIzol 試劑、PCR 試劑盒（德國Qiagen 公司）；逆轉錄試劑盒（日本TaKaRa 公司）；熒光定量PCR 儀（美國ABI 公司）；480II RT-PCR 系統（Roche，Basel，Switzerland）。

1.3 方法

1.3.1 實時熒光定量PCR（qRT-PCR）檢測CD44 mRNA，CD24 mRNA 的表達水平：研究者在剖宮產后立即避開鈣化及出血部位，從胎盤表面不同位置處取多塊約1cm × 1cm × 1cm 的組織，用冷PBS 洗凈血液后放-80℃待測。使用TRIzol 試劑從處于凍存狀態的組織中提取總RNA，進一步反向轉錄。計算A260nm/A280nm比率以評估RNA 質量和純度。在推薦的熱循環設置下，使用480II RTPCR 系統進行qRT-PCR 分析，步驟如下：95℃進行一次初始循環（30s），然后95℃循環55 次（每次15s），60℃循環20s，72℃循環15s。以GAPDH為內參。基因相關序列見表1。反應結束后CD44 mRNA，CD24 mRNA 的相對表達量采用2-ΔΔCt方法計算。

表1 qRT-PCR 引物序列

1.3.2 免疫組織化學檢測CD44，CD24 蛋白表達：采用免疫組織化學試劑盒（DAKO Corporation，USA）檢測CD44 和CD24。參照文獻[6]對染色進行評估。CD44 mRNA，CD24 mRNA 蛋白表達水平基于陽性細胞百分比和細胞染色強度的總組合進行評分：200 倍鏡下選取5 個視野，以棕黃色或棕色顆粒為陽性標準，陽性細胞的百分比評分為0（無陽性細胞），1分（≤5%陽性細胞），2分（＞5%～25%細胞染色陽性），3 分（＞25%～50%細胞染色陽性），4分（＞50%細胞染色陽性）；染色強度評分為1分（淡黃色），2 分（黃棕色）和3 分（棕褐色）。計算每個組織樣本的總分，＞3 分為陽性、≤3 分為陰性。

1.3.3 臨床資料收集：①一般資料：如年齡、體質量指數、孕周、是否初產、舒張壓、收縮壓；②實驗室指標：如血小板計數（PLT）、平均血小板體積（MPV）、24h 蛋白尿、總膽紅素（TBIL）、門冬氨酸氨基轉移酶（AST）、丙氨酸氨基轉移酶（ALT）、清蛋白（ALB）、肌酐（Cr）、乳酸脫氫酶（LDH）、尿素氮（BUN）；新生兒性別、出生時身長、體質量等。

1.4 統計學分析 選用SPSS25.0 軟件對數據進行統計學分析。計數資料以n（%）表示，組間比較用χ2檢驗；符合正態分布計量資料用均數±標準差（±s）表示，組間比較采用t檢驗；采用Pearson 法分析SPE 患者組織中CD44，CD24 表達及與臨床特征的相關性；采用多因素Logistic 回歸分析的SPE 影響因素。P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 CD44，CD24 在SPE 組與對照組胎盤組織中mRNA 及蛋白的表達 見表2。經t檢驗分析，相較于對照組，SPE 組胎盤組織中CD44 mRNA，CD24 mRNA 的表達水平均降低，差異具有統計學意義（P＜0.05）。免疫組織化學染色結果顯示，CD44，CD24 在SPE 組胎盤組織中多呈陰性表達或弱陽性表達，而在對照組中多呈陽性表達，且經方差分析，SPE 胎盤組織中CD44，CD24 陽性率均低于對照組，差異具有統計學意義（P＜0.05）。

表2 CD44，CD24 在SPE 組與對照組胎盤組織中mRNA 及蛋白的表達情況[±s，n（%）]

表2 CD44，CD24 在SPE 組與對照組胎盤組織中mRNA 及蛋白的表達情況[±s，n（%）]

項目對照組（n=100）SPE 組（n=100）χ2/tP CD44 mRNA1.02±0.330.55±0.1213.3850.001 CD24 mRNA1.05±0.110.68±0.1916.8530.001 CD44 陽性率63（63.00）41（41.00）9.6960.002 CD24 陽性率75（75.00）49（49.00）14.3460.001

2.2 不同孕齡SPE 組患者胎盤組織中CD44 mRNA，CD24 mRNA 表達水平比較 經t檢驗分析，相較于早發型SPE 組，晚發型SPE 組胎盤組織中CD44 mRNA（0.65±0.17 vs 0.42±0.11），CD24 mRNA（0.77±0.23 vs 0.58±0.13）的表達水平均上升，差異具有統計學意義（t=7.830，4.932，P＜0.05）。

2.3 SPE 組與對照組臨床特征的比較 見表3。經t檢驗分析和方差分析，相較于對照組，SPE組BMI，收縮壓、舒張壓、尿蛋白、Cr，LDH 和BUN 均升高，差異具有統計學意義（均P＜0.05）；SPE 組分娩孕周較早、MPV，ALB 較低、新生兒出生身長較短、體質量較輕低于對照組，差異具有統計學意義（均P＜0.05）。而兩組的年齡、是否初產、PLT，TBIL，AST，ALT、新生兒性別等差異無顯著性差異。

表3 SPE 組與對照組臨床特征的比較

2.4 胎盤組織CD44 mRNA，CD24 mRNA 水平與SPE 患者臨床特征的相關性分析 見表4。經Pearson 分析，SPE 胎盤組織中CD44 mRNA 的表達分別與分娩孕周、MPV，新生兒出生身長呈正相關（r=0.639，0.612，0.465，均P＜0.05）；與收縮壓、尿蛋白、LDH 呈負相關（r=-0.604，-0.569，-0.593，均P＜0.05）。CD24 mRNA 的表達分別與分娩孕周、MPV，新生兒出生身長呈正相關（r=0.605，0.584，0.640，均P＜0.05）；與收縮壓、尿蛋白、LDH 呈負相關（r=-0.637，-0.593，-0.561，均P＜0.05）。

表4 胎盤組織CD44 mRNA，CD24 mRNA 水平與SPE 患者臨床特征的相關性分析

2.5 SPE 影響因素的多因素Logistic 回歸分析 以是否發生SPE（否=0，是=1）為因變量，以表2，表4 中P＜0.05 的因素BMI，分娩孕周、舒張壓、收縮壓、MPV，尿蛋白，ALB，Cr，LDH，BUN、新生兒出生身長、新生兒體質量、CD44 和CD24 水平（具體值）為自變量，進行Logistic 回歸分析。結果顯示，MPV（95%CI：1.429～4.350），尿蛋白（95%CI：1.529～2.709），LDH（95%CI：1.425～3.932）均是發生SPE 的獨立危險因素（P＜0.05）。高水平CD44（95%CI：0.561～0.940），CD24（95%CI：0.495～0.814）是發生SPE 的獨立保護因素（P＜0.05），見表5。

表5 影響SPE 發生的多因素Logistic 回歸分析

3 討論

妊娠是受精卵經過輸送、分裂、胚胎發育后著床的一系列過程，任一環節出現問題均會出現妊娠期并發癥及不良分娩結局[8]。子癇前期（PE）是妊娠期出現的常見并發癥，重度子癇前期（SPE）是PE 疾病的嚴重情況[9]。其主要表現為全身小動脈痙攣，由于周身阻力形成微血栓，進一步出現肝、腎、腦、胎盤等器官血流灌注不足而出現機體功能受損以及胎兒生長受限的情況，是導致母嬰死亡的主要因素[9-10]。目前SPE 的發病機制尚不明確。使用生物標志物監測病情已成為熱點，現已有一些生物標志物對PE 或SPE 進行研究，如血清親環素A，組織型轉谷氨酰胺酶、內皮細胞特異性分子等，但均未推廣使用[11-12]。因此，探尋能準確反映SPE 的新的生物標志物，對SPE 疾病的臨床治療提供新的研究方向十分重要。

先兆子癇是妊娠期的主要心血管并發癥，炎癥反應的級聯反應可通過炎癥細胞浸潤血管組織并釋放蛋白酶、細胞因子和活性氧來改變組織中的血流，從而引發血管收縮或松弛[13-14]。細胞表面跨膜糖蛋白分子（CD44）是一種廣泛表達的細胞黏附分子，是細胞外基質（ECM）成分的主要受體，在炎癥和血管損傷中均起重要作用，據報道，FK506 結合蛋白樣蛋白(FKBPL)-CD44 通路似乎在PE 的發病機制中起核心作用，有望對其進行早期診斷和治療[13]。

CD24 在脂肪細胞前體細胞中顯示高表達水平，在許多類型的人類癌癥中的高表達表明癌癥、糖尿病和肥胖之間存在關聯，研究發現CD24 KO雄性小鼠在早期表現出更高的胰島素敏感性和葡萄糖攝取[15]。SAMMAR 等[16]人發現，CD24 在PE 的患者中表達降低，與PE 的免疫耐受性降低有關。本實驗發現SPE 患者胎盤中CD44 mRNA 和CD24 mRNA 表達降低，且SPE 胎盤組織中CD44和CD24 陽性率低于對照組；高水平CD44 mRNA和CD24 mRNA 是SPE 發生的獨立保護因素，與上述研究結果一致，提示高水平CD44 和CD24 對SPE 疾病有抑制作用。本研究進一步表明，CD44 mRNA 與CD24 mRNA 表達呈正相關（r=0.611，P＜0.05），提示二者相互作用，共同在SPE 中發揮作用。此外，SPE 的發病孕期越早，病情越嚴重[17]。本研究中早發型SPE 患者胎盤中CD44 mRNA 和CD24 mRNA 的水平低于晚發型SPE，提示CD44 和CD24 水平與SPE 的嚴重程度有關，與ONYANGUNGA 等[18]實驗結果一致。MPV 檢測全身炎癥反應，是PE 重要的生物標志物[19]。

本實驗發現MPV 表達下降，提示SPE 患者機體處于炎癥狀態。與上述報道相對應[13-14]。此外，CD44 mRNA，CD24 mRNA 與MPV 呈現正相關，表明二者均可通過與炎癥因子相互作用加重SPE。蛋白尿水平可通過血管內皮細胞損傷增加血管通透性，是影響PE 進展的因素之一[20]。本實驗中SPE患者蛋白尿水平較高，與?ALK 等[20]人實驗結果一致。CD44，CD24 與蛋白尿呈現負相關，表明SPE 患者中低水平CD44，CD24 加重血管內皮損傷，累積蛋白尿。PE 患者胎盤缺氧，會增加厭氧糖酵解的代謝途徑，LDH 在厭氧糖酵解可催化丙酮酸轉化為乳酸，加重PE，因此在PE 患者中LDH 數量增加。本實驗SPE 患者中LDH 表達上升，是SPE發生的獨立危險因素，進一步驗證了上述言論。這可能與SPE 患者中血管內皮細胞障礙，溶血后可使血漿中LDH 水平升高有關[21]。因此猜測本實驗可能是低水平CD44 和CD24 相互作用，加重SPE，進一步導致患者機體炎癥聚集，血管內皮細胞障礙。然而本實驗僅研究了SPE 患者胎盤CD44 和CD24水平與SPE 的一般資料及實驗室指標的的相關性，其具體機制還需進一步研究。

綜上所述，隨著SPE 疾病的加深，胎盤中CD44 mRNA 和CD24 mRNA 表達水平均降低，高水平CD44 mRNA 和CD24 mRNA 是SPE 發生的獨立保護因素，MPV，尿蛋白、LDH 是SPE 發生的獨立危險因素，參與SPE 疾病的發生。但本實驗中樣本量較小，實驗結果具有一定局限性。后續可用大樣本對SPE 的具體機制進行研究，對臨床中SPE的診療提供基礎依據。