膿毒癥并發(fā)急性腎損傷患者血清miR-181c和miR-578水平表達(dá)及臨床意義

宋 飛，李 丹，余 夢(mèng)，李 敏，丁 繼，李蘭蘭（三峽大學(xué)第三臨床醫(yī)學(xué)院/國(guó)藥葛洲壩中心醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科，湖北宜昌 443000）

膿毒癥（sepsis）是患者對(duì)感染反應(yīng)失調(diào)引起的器官功能障礙，是一種危及生命的臨床綜合征[1]。腎臟是膿毒癥期間最早受傷的器官之一，急性腎損傷（acute kidney injury，AKI）是膿毒癥患者常見(jiàn)的并發(fā)癥，導(dǎo)致患者出現(xiàn)腎內(nèi)血流重組、腎臟低灌注、腎小管損傷、細(xì)胞凋亡、纖維化、炎癥反應(yīng)等，甚至可能會(huì)導(dǎo)致腎功能衰竭，與極高的死亡率相關(guān)[2-3]。研究表明，大多數(shù)膿毒癥就醫(yī)時(shí)，已經(jīng)發(fā)生AKI[4]。因此，早期準(zhǔn)確識(shí)別膿毒癥并發(fā)AKI 的生物標(biāo)志物，并積極采取有效干預(yù)措施，對(duì)患者的臨床治療具有重要意義。微小核糖核酸（microRNA，miR）可以靶向多個(gè)基因，通過(guò)調(diào)控細(xì)胞增殖、分化、凋亡、發(fā)育，調(diào)節(jié)多種蛋白質(zhì)的表達(dá)，參與多種信號(hào)途徑，幾乎涉及身體所有系統(tǒng)[5]。miR-181位于19 號(hào)染色體上，在核基因組中編碼，在細(xì)胞質(zhì)中成熟，然后易位到心肌細(xì)胞的線粒體基質(zhì)中，通過(guò)調(diào)節(jié)線粒體基因表達(dá)并改變線粒體功能，改善不同器官中細(xì)胞的凋亡，在調(diào)節(jié)燒傷膿毒癥誘導(dǎo)的AKI 中發(fā)揮重要作用[6-7]。miR-578 是一種功能性miRNA，抑制癌細(xì)胞的生長(zhǎng)、侵襲、血管生成，增強(qiáng)細(xì)胞放射敏感度，在骨肉瘤、乳腺癌、肺癌等癌癥中發(fā)揮抑癌基因的作用，在膿毒癥患者中表達(dá)下調(diào)[8-9]。盡管有研究表明miR-181c 和miR-578 在膿毒癥患者的作用，然而在膿毒癥并發(fā)AKI 患者血清中的表達(dá)及臨床意義，尚不明晰。因此，本研究通過(guò)檢測(cè)膿毒癥并發(fā)AKI 患者血清miR-181c 和miR-578 表達(dá)水平，分析二者與膿毒癥并發(fā)AKI 的關(guān)系，為膿毒癥并發(fā)AKI 患者的早期診斷和治療提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象 收集2022年1～12月在國(guó)藥葛洲壩中心醫(yī)院住院治療的80 例膿毒癥并發(fā)AKI 患者（AKI 組），其中男性48 例，女性32 例，年齡54.21±6.68 歲，BMI 24.23±6.68 kg/m2和80 例單純膿毒癥患者（非AKI 組），其中男性53 例，女性27 例，年齡53.37±6.54 歲，BMI 23.96±3.14 kg/m2。兩組性別、年齡、BMI 比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=0.671，t=0.804，0.534，P=0.413，0.423，0.594）。納入標(biāo)準(zhǔn)：①兩組患者均符合膿毒癥[10]相關(guān)診斷標(biāo)準(zhǔn)；②AKI 組患者符合急性腎損傷[11]相關(guān)診斷標(biāo)準(zhǔn)；③發(fā)病時(shí)間≤發(fā)病時(shí)；④研究對(duì)象本人詳知此項(xiàng)研究?jī)?nèi)容，并自愿簽署同意書(shū)。排除標(biāo)準(zhǔn)：①慢性腎臟疾病或腎功能不全患者；②妊娠期或哺乳期婦女；③其他因素導(dǎo)致的AKI；④惡性腫瘤患者；⑤免疫系統(tǒng)疾病患者；⑥病例資料不完整者。本研究遵循《世界醫(yī)學(xué)協(xié)會(huì)赫爾辛基宣言》。

1.2 儀器與試劑 RNA 提取試劑盒（德國(guó)Qiagen公司）；逆轉(zhuǎn)錄和ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix 試劑盒（南京諾唯贊生物科技股份有限公司）。qRT-PCR 儀器ABI 7500 Fast 系統(tǒng)；cobasb123 型全自動(dòng)血?dú)夥治鰞x，全自動(dòng)生化分析儀（羅氏公司），引物序列由上海生工生物工程有限公司合成。

1.3 方法

1.3.1 臨床資料收集及樣本采集：收集兩組膿毒癥患者的年齡、性別、體質(zhì)指數(shù)（BMI）、高血壓史、糖尿病史、肺部感染等基本資料。所有患者入院次日清晨，空腹采血約3～5 ml 于干燥試管，離心半徑為12 cm，時(shí)間為10 min，分離血清后，放入-20℃冰箱中保存，待檢。

1.3.2 血清miR-181c，miR-578 水平檢測(cè)：采用RNA 提取試劑盒提取血清樣品中總RNA，使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，按其說(shuō)明書(shū)逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，反應(yīng)條件：25℃ 5 min，37℃ 45min，85℃ 5s。實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction，qRT-PCR）檢測(cè)血清中miR-181c 和miR-578 的相對(duì)表達(dá)量。根據(jù)ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix 試劑盒說(shuō)明書(shū)配置反應(yīng)體系。PCR 反應(yīng)：50℃2min，95℃10min，95℃15min， 60℃ 60min，溶解曲線：95℃ 10 min 1 個(gè)循環(huán)，95℃ 15s，60℃ 60s，40 個(gè)循環(huán)進(jìn)行qRT-PCR。以U6 作為內(nèi)參，根據(jù)2-ΔΔCt計(jì)算miR-181c，miR-578 基因的相對(duì)表達(dá)量。引物序列見(jiàn)表1。

表1 qRT-PCR 引物序列

1.3.3 血清指標(biāo)的檢測(cè)以及APACHE Ⅱ評(píng)分：采用cobasb123 型全自動(dòng)血?dú)夥治鰞x檢測(cè)血乳酸、氧合指數(shù)；采用全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)血清尿素氮、血肌酐水平。

采用APACHE Ⅱ評(píng)分[12]對(duì)患者病情進(jìn)行評(píng)估，APACHE Ⅱ評(píng)分值與患者病情嚴(yán)重程度呈正相關(guān)，分值越高則患者病情越嚴(yán)重。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 數(shù)據(jù)以SPSS 25.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，經(jīng)正態(tài)性檢驗(yàn)，符合正態(tài)分布，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）描述，采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)進(jìn)行組間計(jì)量資料比較，計(jì)數(shù)資料以百分率（%）表示，采用卡方（χ2）檢驗(yàn)；多因素Logistic 回歸分析影響膿毒癥患者并發(fā)AKI 的因素；ROC 曲線分析血清miR-181c，miR-578 水平預(yù)測(cè)膿毒癥患者并發(fā)AKI 的價(jià)值，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組疾病史、APACHE Ⅱ評(píng)分、血清指標(biāo)的比較 見(jiàn)表2。AKI 組肺部感染所占比例、動(dòng)脈血乳酸、血肌酐、尿素氮水平以及APACHE Ⅱ評(píng)分均高于非AKI 組，氧合指數(shù)低于非AKI 組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。

表2 兩組疾病史、APACHE Ⅱ評(píng)分、血清指標(biāo)的比較[±s，n（%）]

表2 兩組疾病史、APACHE Ⅱ評(píng)分、血清指標(biāo)的比較[±s，n（%）]

項(xiàng)目n非AKI 組（n=80）AKI 組（n=80）t/χ2 值P 值高血壓史有4628（60.87）18（39.13）3.0510.081無(wú)11452（45.61）62（54.39）糖尿病史有4121（51.22）20（48.78）0.0330.856無(wú)11959（49.58）60（50.42）肺部感染是9137（40.66）54（59.34）7.3640.007否6943（62.32）26（37.68）氧合指數(shù)（mmHg）-258.17±34.59196.38±26.5412.6760.000動(dòng)脈血乳酸（mmol/L）-0.84±0.252.69±1.1314.2980.000血肌酐（μmol/L）-89.96±24.65264.77±53.1426.6910.000尿素氮（mmol/L）-8.31±2.2425.58±8.3217.9250.000 APACHE Ⅱ評(píng)分（分）-14.57±3.6919.41±4.857.1040.000

2.2 兩組血清miR-181c，miR-578 水平比較 AKI組患者血清miR-181c 水平（1.47±0.36）高于非AKI組（1.03±0.28），血清miR-578水平（0.76±0.19）顯著低于非AKI 組（1.05±0.31），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=8.629，7.134，均P=0.000）。

2.3 多因素Logistic 回歸分析膿毒癥患者并發(fā)AKI的影響因素 見(jiàn)表3。以膿毒癥患者并發(fā)AKI（并發(fā)=1，未并發(fā)=0）為因變量，以肺部感染（有=1，無(wú)=0）、動(dòng)脈血乳酸、APACHE Ⅱ評(píng)分、氧合指數(shù)、miR-181c，miR-578（連續(xù)變量）為自變量，進(jìn)行多因素Logistic 回歸分析，結(jié)果顯示miR-181c[OR（95%CI）：2.984（1.628～5.468）]、肺部感染[OR（95%CI）：1.946（1.250～3.031）]、動(dòng)脈血乳酸[OR（95%CI）：1.457（1.073～1.978）]、APACHE Ⅱ評(píng)分[OR（95%CI）：2.283（1.393～3.741）]是膿毒癥患者并發(fā)AKI 的危險(xiǎn)因素（均P＜0.05）；miR-578[OR（95%CI）：0.742（0.631～0.873）]、氧合指數(shù)[OR（95%CI）：0.342（0.130～0.904）]為保護(hù)因素（均P＜0.05）。

表3 多因素Logistic 回歸分析膿毒癥患者并發(fā)AKI 的影響因素

2.4 血清miR-181c，miR-578 水平對(duì)膿毒癥患者并發(fā)AKI 的預(yù)測(cè)價(jià)值 見(jiàn)表4 和圖1。血清miR-181c 預(yù)測(cè)膿毒癥患者并發(fā)AKI 的曲線下面積（area under curve，AUC）為0.854；血清miR-578 預(yù)測(cè)膿毒癥患者并發(fā)AKI 的AUC 為0.803；二者聯(lián)合預(yù)測(cè)膿毒癥患者并發(fā)AKI 的AUC 為0.915。二者聯(lián)合預(yù)測(cè)膿毒癥患者并發(fā)AKI 優(yōu)于miR-181c，miR-578各自單獨(dú)預(yù)測(cè)（Z=3.118，3.460，P=0.002，0.001）。

圖1 血清miR-181c，miR-578 水平預(yù)測(cè)膿毒癥患者并發(fā)AKI 的ROC 曲線

表4 血清miR 181c，miR 578 水平對(duì)膿毒癥患者并發(fā)AKI 的預(yù)測(cè)價(jià)值

3 討論

急性腎損傷（AKI）是住院和重癥膿毒癥患者易發(fā)生的危及生命的并發(fā)癥，使患者的死亡率增加6～8 倍，患慢性腎病的風(fēng)險(xiǎn)增加三倍，多達(dá)四分之一的患者需要腎臟替代治療[13]。但是，通過(guò)及時(shí)干預(yù)和有效治療，AKI 可以在早期得到逆轉(zhuǎn)，從而降低膿毒癥并發(fā)AKI 患者的死亡率[14]。因此，識(shí)別膿毒癥患者并發(fā)AKI 對(duì)于患者的治愈至關(guān)重要。

miRNA具有高度的序列保守性和組織特異性，其表達(dá)譜隨疾病類(lèi)型發(fā)生特定的變化，其表達(dá)失調(diào)與多種疾病發(fā)生、發(fā)展和預(yù)后密切相關(guān)[15]。miR-181c 影響細(xì)胞的增殖、存活和遷移，其在乳腺癌、胃癌、胰腺癌、肺癌、結(jié)腸癌等多種癌癥中表達(dá)上調(diào)[16]。SUN 等[17]發(fā)現(xiàn)miR-181c 通過(guò)與3’UTR中的靶位點(diǎn)結(jié)合，直接抑制細(xì)胞周期B1 蛋白的翻譯，引起成骨細(xì)胞的細(xì)胞增殖異常以及細(xì)胞周期停滯，同時(shí)參與炎癥和免疫反應(yīng)，導(dǎo)致骨質(zhì)流失。ROMAN 等[18]發(fā)現(xiàn)miR-181c 在心臟中協(xié)調(diào)著獨(dú)特的核-線粒體機(jī)制，肥胖誘導(dǎo)的miR-181c 過(guò)表達(dá)通過(guò)介導(dǎo)下游基因的表達(dá)，導(dǎo)致心臟損傷，在心肌細(xì)胞中抑制miR-181c 的表達(dá)，可以通過(guò)改善線粒體功能來(lái)保持肥胖期間的心臟功能。張宇峰等[19]發(fā)現(xiàn)miR-181c 在急性腦梗死患者血清中高表達(dá)，與患者神經(jīng)缺損程度相關(guān)，且高表達(dá)患者預(yù)后差。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，AKI 組患者血清miR-181c 水平顯著高于非AKI 組，提示miR-181c 可能通過(guò)介導(dǎo)患者下游基因的表達(dá)，影響細(xì)胞生物學(xué)行為、炎癥因子水平，與膿毒癥患者并發(fā)AKI 密切相關(guān)。

miR-578 是一種目前研究較少的miRNA，在多種癌癥中抑制腫瘤的發(fā)展。王維學(xué)等[20]發(fā)現(xiàn)，miR-578 在類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者滑膜組織中表達(dá)顯著降低，其高表達(dá)可抑制類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎滑膜成纖維細(xì)的增殖、遷移及轉(zhuǎn)移，從而減輕纖維化，減緩類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的病情發(fā)展。YAN 等[21]發(fā)現(xiàn)，椎間盤(pán)退變患者miR-578 表達(dá)顯著降低，上調(diào)miR-578 表達(dá)可通過(guò)抑制細(xì)胞生長(zhǎng)、促炎細(xì)胞因子的表達(dá)和維持細(xì)胞外基質(zhì)降解，改善患者癥狀。GAO 等[8]發(fā)現(xiàn)，miR-578 可以調(diào)節(jié)脂多糖誘導(dǎo)的HK2 細(xì)胞模型，其高表達(dá)可以抑制膿毒癥并發(fā)AKI 患者的炎癥反應(yīng)、細(xì)胞凋亡、腎組織嚴(yán)重纖維化。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，AKI 組患者血清miR-578 水平顯著低于非AKI 組，提示miR-578 高表達(dá)可能通過(guò)抑制炎癥因子水平、細(xì)胞凋亡、腎組織纖維化，抑制病情的發(fā)生，miR-578 在膿毒癥患者并發(fā)AKI 患者血清中顯著低表達(dá)可能是病情惡化的重要原因，miR-578 可作為膿毒癥患者并發(fā)AKI 的生物標(biāo)志物。進(jìn)一步ROC 曲線分析顯示，miR-181c，miR-578 二者聯(lián)合預(yù)測(cè)膿毒癥患者并發(fā)AKI 的效能優(yōu)于miR-181c，miR-578各自單獨(dú)預(yù)測(cè)，提示miR-181c，miR-578 二者對(duì)預(yù)測(cè)膿毒癥并發(fā)AKI 患者具有重要指導(dǎo)價(jià)值，豐富了miR-181c，miR-578 在膿毒癥患者并發(fā)AKI 中的研究，為感染類(lèi)疾病提供一定的依據(jù)。研究表明，肺部感染、氧合指數(shù)、動(dòng)脈血乳酸、APACHE Ⅱ評(píng)分與膿毒癥并發(fā)AKI 患者病情的發(fā)生、發(fā)展和預(yù)后密切相關(guān)[22-23]。本研究進(jìn)一步多因素Logistic 回歸分析結(jié)果顯示，miR-181c，肺部感染、動(dòng)脈血乳酸、APACHE Ⅱ評(píng)分是膿毒癥患者并發(fā)AKI 的危險(xiǎn)因素；miR-578，氧合指數(shù)是保護(hù)因素，提示及時(shí)關(guān)注上述因素，對(duì)患者治療措施的調(diào)整具有重要意義，可有效改善膿毒癥患者并發(fā)AKI 的病情進(jìn)展。

綜上所述，膿毒癥并發(fā)AKI 患者血清miR-181c 表達(dá)顯著上調(diào)、miR-578 表達(dá)顯著下調(diào)，二者聯(lián)合對(duì)預(yù)測(cè)膿毒癥患者并發(fā)AKI 有較好參考價(jià)值。然而，miR-181c，miR-578 參與膿毒癥患者并發(fā)AKI 發(fā)生發(fā)展的具體機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。