膿毒癥患者外周血細(xì)胞因子，PCT和NLR表達(dá)水平及與臨床預(yù)后價(jià)值研究

李 蕊，楊 柳，周 磊，劉家云(空軍軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院，西安 710032)

膿毒癥(sepsis)作為臨床常見(jiàn)的危重癥，發(fā)病過(guò)程復(fù)雜多樣，涉及多種病理生理改變，包括免疫炎癥失調(diào)、代謝紊亂、循環(huán)衰竭等。2016年《美國(guó)醫(yī)學(xué)會(huì)雜志》發(fā)表了《膿毒癥與感染性休克定義的國(guó)際共識(shí)（第三版）》，將膿毒癥的定義從“感染基礎(chǔ)上的全身炎癥反應(yīng)綜合征(systemic inflammatory response syndrome,SIRS)”調(diào)整為“機(jī)體對(duì)感染反應(yīng)失調(diào)而導(dǎo)致危及生命的器官功能障礙”[1]。同時(shí)隨著“細(xì)胞因子風(fēng)暴”概念的提出，人們?cè)絹?lái)越意識(shí)到機(jī)體的促炎/抑炎反應(yīng)失衡在膿毒癥的發(fā)生發(fā)展中扮演著重要的角色。早期、準(zhǔn)確、快速識(shí)別患者免疫狀態(tài)對(duì)改善患者預(yù)后具有重要意義，臨床已有多種生物標(biāo)志物用于協(xié)助膿毒癥的診斷，其中包括中性粒細(xì)胞-淋巴細(xì)胞比值(neutrophil-lymphocyte ratio，NLR)、降鈣素原(procalcitonin，PCT)和白細(xì)胞介素(interleukin，IL)-6 等，然而目前還沒(méi)有特異性的炎性標(biāo)志物用來(lái)反映機(jī)體炎性失調(diào)狀態(tài)和預(yù)后預(yù)警。因此，本研究通過(guò)檢測(cè)膿毒癥患者急性期的IL-1β，IL-2，IL-4，IL-5，IL-6，IL-8，IL-10，IL-12p70，IL-17，腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor，TNF)-α，干擾素(interferon，IFN)-γ，IFN-α，PCT 和NLR 的水平，探討其在膿毒癥早期診斷及預(yù)后中的作用，以期為臨床診療提供幫助。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象 本研究收集2020年1月～2023年1月空軍軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院收治的98 例年齡≥18 歲膿毒癥患者作為研究對(duì)象，依照《膿毒癥與感染性休克定義的國(guó)際共識(shí)(第三版)》[1]標(biāo)準(zhǔn)納入病例，其中男性52 例，女性46 例，平均年齡48.33±8.17 歲。膿毒癥患者均根據(jù)《中國(guó)膿毒癥/膿毒性休克急診治療指南(2018)》[2]接受治療，根據(jù)膿毒癥患者是否發(fā)生休克分為休克組(n=16)和非休克組(n=82)。以患者入院當(dāng)天為研究起始點(diǎn)，根據(jù)患者28 天的生存情況，將其分為生存組(n=82)和死亡組(n=16)。另選取同期95 例非膿毒癥感染者作為對(duì)照，對(duì)照組患者均有感染但未達(dá)到膿毒癥診斷標(biāo)準(zhǔn)，其中男性48 例，女性47 例，平均年齡41.57±5.28 歲。兩組患者年齡和性別比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=1.89，χ2=0.12，均P＞ 0.05)，具有可比性。排除標(biāo)準(zhǔn)：①惡性腫瘤者；②免疫系統(tǒng)疾病者；③血液系統(tǒng)疾病者；④近期使用刺激或抑制炎性介質(zhì)釋放藥物者；⑤外傷或術(shù)后者。本研究獲醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)及患者知情同意。

1.2 儀器與試劑 流式細(xì)胞儀(美國(guó)碧迪公司，型號(hào)：BD CantoII)，血液分析儀(日本希森美康公司，型號(hào)：SYSMEX XN-3000)，熒光免疫分析儀(瑞士羅氏公司，型號(hào)：Cobas E 601)，12 項(xiàng)細(xì)胞因子檢測(cè)試劑盒(青島瑞斯凱爾生物科技有限公司，貨號(hào)：R7011002)。

1.3 方法 采集膿毒癥組和對(duì)照組患者入院24h 內(nèi)靜脈血6ml，分裝為3 管。2 管注入EDTA 抗凝試管，其中一管3 000 r/min 離心10min，分離出上層血漿，利用流式細(xì)胞術(shù)對(duì)IL-1β，IL-2，IL-4，IL-5，IL-6，IL-8，IL-10，IL-12p70，IL-17，IFN-α，IFN-γ 和TNF-α 的濃度進(jìn)行多參數(shù)檢測(cè)和分析；另一管不離心，全自動(dòng)血液分析儀檢測(cè)中性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞數(shù)量，計(jì)算 NLR(NLR= 中性粒細(xì)胞絕對(duì)值/淋巴細(xì)胞絕對(duì)值)；第3 管采用ELISA 熒光免疫分析儀對(duì)PCT 水平進(jìn)行測(cè)定。所有操作均嚴(yán)格按照儀器和配套試劑盒說(shuō)明書(shū)由專(zhuān)業(yè)人員進(jìn)行。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 軟件22.0 版進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示；不符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以中位數(shù)(范圍)表示。比較細(xì)胞因子的血漿濃度，使用Mann-WhitneyU檢驗(yàn)。診斷能力通過(guò)受試者工作特征(receiver operator characteristic，ROC)曲線(xiàn)獲得，曲線(xiàn)下面積(area under curve，AUC)＞0.5 且95%CI均大于0.5 為有預(yù)測(cè)意義，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 膿毒癥組與非膿毒癥感染組的炎性指標(biāo)比較及預(yù)測(cè)效能分析 見(jiàn)表1。膿毒癥患者細(xì)胞因子檢測(cè)除IL-1β 和IFN-γ 外，其余細(xì)胞因子水平均高于非膿毒癥感染患者，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P＜0.05)。ROC 曲線(xiàn)進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)IL-2，IL4，IL-5，IL-8，IL-10，IL-12p70，IL-17，TNF-α，IFN-α 的AUC 分別是0.71(95%CI：0.63～0.78)，0.73(95%CI：0.65～ 0.80)，0.74(95%CI ：0.65～0.80)，0.78(95%CI：0.71～0.84)，0.63(95%CI：0.56～0.72)，0.68(95%CI：0.61～0.76)，0.86(95%CI：0.81～0.92)，0.67(95%CI：0.60～0.75)和0.67(95%CI：0.60～0.76)， 顯示這些細(xì)胞因子分別具有預(yù)測(cè)感染的能力。目前臨床常用的炎性指標(biāo)白細(xì)胞計(jì)數(shù)(white blood count，WBC)，NLR，IL-6 和PCT 在膿毒癥組和非膿毒癥感染組之間差異也具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P＜0.05)，AUC 分別為0.70(95%CI：0.63～0.77)，0.81(95%CI：0.75～0.87)，0.75(95%CI：0.68～0.82)和0.83(95%CI：0.78～0.88)，所有炎性檢測(cè)指標(biāo)中IL-17，PCT，NLR 和IL-8 具有相對(duì)較高的預(yù)測(cè)價(jià)值，四者聯(lián)合檢測(cè)可以有效提高膿毒癥的診斷效能，見(jiàn)表2。

表1 膿毒癥組與非膿毒癥感染組的炎性指標(biāo)比較[M(范圍)]

表2 IL-17，PCT，NLR，IL-8 及四者聯(lián)合檢測(cè)診斷效能分析

2.2 膿毒癥血培養(yǎng)陽(yáng)性組與陰性組炎性指標(biāo)比較見(jiàn)表3。在98 例膿毒癥患者中，血培養(yǎng)陽(yáng)性患者30 例，陰性患者68 例，陽(yáng)性率約為30.61%。兩組間炎性指標(biāo)比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，提示這些炎性指標(biāo)檢測(cè)不受血培養(yǎng)檢測(cè)結(jié)果影響。

2.3 膿毒癥休克組與非休克組炎性指標(biāo)比較及預(yù)測(cè)效能分析 見(jiàn)表4。與非休克組比較，膿毒癥休克組IL-6 水平明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.01)。ROC 分析顯示其敏感度和特異度分別為75%和63%，AUC 為0.73(95%CI：0.59～0.87)。

表4 膿毒癥休克組與非休克組的炎性指標(biāo)比較[M(范圍)]

2.4 膿毒癥死亡組與生存組患者炎性指標(biāo)比較及預(yù)測(cè)效能分析 見(jiàn)表5。本研究納入膿毒癥患者98 例，其中死亡患者16 例，死亡率16.33%，比較兩組的炎性指標(biāo)發(fā)現(xiàn)死亡組IL-5，IL-2 和IL-10 的水平高于生存組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P＜0.05)。三者聯(lián)合檢測(cè)可以有效提高膿毒癥不良預(yù)后的預(yù)測(cè)效能，見(jiàn)表6。

表5 膿毒癥生存組與死亡組的炎性指標(biāo)比較[M(范圍)]

表6 IL-5，IL-2，IL-10 及三者聯(lián)合檢測(cè)對(duì)不良預(yù)后預(yù)測(cè)效能分析

3 討論

膿毒癥是一種免疫反應(yīng)失調(diào)的危重癥，嚴(yán)重影響全球人類(lèi)生命健康。美國(guó)PIRO[易感性（predisposition），損傷（insult）、反應(yīng)（response）、器官功能障礙（organ）]概念提倡使用更容易測(cè)量的生物學(xué)指標(biāo)作為評(píng)估膿毒癥患者病情嚴(yán)重程度及預(yù)測(cè)死亡的附加手段[3]。膿毒癥時(shí)內(nèi)毒素進(jìn)入血液循環(huán)，刺激血管內(nèi)皮系統(tǒng)，釋放一氧化氮(nitric oxide，NO)，TNF，IL 等多種炎性細(xì)胞因子。據(jù)報(bào)道，膿毒癥患者在不同階段機(jī)體免疫系統(tǒng)可處于抑制、激活、紊亂等不同的狀態(tài)[4]，炎癥早期檢測(cè)細(xì)胞因子對(duì)于膿毒癥有很高的臨床價(jià)值[5]。

病原體侵入人體引起機(jī)體特異性免疫過(guò)程，分化決定簇抗原4 陽(yáng)性(cluster of differentiation 4，CD4+)T 淋巴細(xì)胞在其中扮演重要角色，CD4+T 淋巴細(xì)胞主要分為輔助 T 細(xì)胞(helper T cell，Th)1，Th2 兩個(gè)亞群。Th1 細(xì)胞也稱(chēng)為炎癥性T 細(xì)胞，主要分泌IL-2，IFN-γ 和TNF-α，介導(dǎo)與細(xì)胞毒和局部炎癥相關(guān)的免疫應(yīng)答；Th2 則以分泌IL-6 和IL-10 為主，主要參與體液免疫[6]。本研究中膿毒癥組與非膿毒癥感染組比，多種炎性指標(biāo)的升高表明膿毒癥患者體內(nèi)有高水平炎癥因子活化現(xiàn)象，存在明顯的免疫狀態(tài)紊亂。IL-6 是一種多效細(xì)胞因子，同時(shí)具有抗炎和促炎的雙向作用，是炎癥介質(zhì)網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵因子。有研究[7]證實(shí)膿毒癥患者IL-6水平明顯高于非感染引起的全身炎癥反應(yīng)綜合征（SIRS）患者，可用于兩者的鑒別。本研究結(jié)果顯示，IL-6 對(duì)膿毒癥診斷有一定的意義，但診斷價(jià)值不如IL-17，PCT，NLR 和IL-8。IL-17 作為T(mén)h17細(xì)胞的特征性細(xì)胞因子，具有很強(qiáng)的招募中性粒細(xì)胞的作用，可誘導(dǎo)產(chǎn)生炎癥因子和趨化因子，如IL-6，IL-8。IL-6 本身又是IL-17 細(xì)胞的分化因子，在此過(guò)程形成正反饋。在某些感染的急性期，Th17細(xì)胞的免疫反應(yīng)可能對(duì)機(jī)體具有保護(hù)作用，若病原體不能被及時(shí)完全清除，那么IL-17 使感染進(jìn)入慢性階段可能性增大[8]。IL-8 除由Th2 細(xì)胞產(chǎn)生外，最主要來(lái)源于單核-巨噬細(xì)胞，作為T(mén) 淋巴細(xì)胞和中性粒細(xì)胞的強(qiáng)效趨化因子，可以促進(jìn)T 細(xì)胞的增殖和浸潤(rùn)，也可以作用于中性粒細(xì)胞，引起氣道內(nèi)中性粒細(xì)胞的聚集、活化，促進(jìn)炎癥反應(yīng)進(jìn)程[9]。有研究表明在炎癥發(fā)展過(guò)程中，IL-8 的上調(diào)提示疾病惡化和更高的死亡傾向[10-11]。本次研究未發(fā)現(xiàn)IL-1β 和IFN-γ 在膿毒癥組和非膿毒癥感染組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，可能是由于不同研究采用的膿毒癥診斷標(biāo)準(zhǔn)不一以及病原體感染在體內(nèi)的免疫過(guò)程不同所導(dǎo)致。

盡管血培養(yǎng)是血流感染診斷的金標(biāo)準(zhǔn)，但其檢測(cè)結(jié)果受多種因素影響[12]。本研究發(fā)現(xiàn)膿毒癥患者細(xì)胞因子，PCT 和NLR 的水平與血培養(yǎng)檢測(cè)結(jié)果無(wú)明顯相關(guān)性，可以作為膿毒癥的獨(dú)立危險(xiǎn)預(yù)警指標(biāo)。有研究證實(shí)IL-6 和IL-10 可用于膿毒癥不同病原菌感染的早期鑒別[13]，有助于指導(dǎo)臨床血培養(yǎng)結(jié)果未出或者血培養(yǎng)陰性患者的抗生素選擇。

膿毒癥期間的免疫反應(yīng)經(jīng)過(guò)兩個(gè)不同的階段，由最初的高炎性反應(yīng)轉(zhuǎn)向由于淋巴細(xì)胞損傷引發(fā)的嚴(yán)重免疫抑制[14]。膿毒癥進(jìn)展時(shí)CD4+T 細(xì)胞會(huì)發(fā)生Th2 方向的漂移，這預(yù)示著疾病的惡化。本研究發(fā)現(xiàn)IL-2，IL-5 和IL-10 對(duì)于膿毒癥患者預(yù)后具有提示作用。IL-4 和IL-10 是機(jī)體關(guān)鍵的抗炎性細(xì)胞因子，有臨床試驗(yàn)顯示IL-4 與膿毒癥的預(yù)后無(wú)明顯的相關(guān)性，限制了IL-4 的臨床應(yīng)用。IL-10 是由Th2 細(xì)胞產(chǎn)生的強(qiáng)效抗炎細(xì)胞因子，可從源頭上抑制TNF-α，IL-6 等促炎因子的釋放，從而阻止膿毒癥病情持續(xù)惡化和遠(yuǎn)處臟器損傷，但如果體內(nèi)抗炎癥遞質(zhì)過(guò)量釋放，導(dǎo)致機(jī)體抗炎反應(yīng)增強(qiáng)，引起炎癥/抗炎癥遞質(zhì)失衡，可導(dǎo)致患者免疫功能紊亂。有研究表明持續(xù)高表達(dá)的IL-10 使膿毒癥患者處于免疫抑制狀態(tài)[15]，與膿毒癥患者器官功能障礙密切相關(guān)[16]，提示IL-10 可能是其預(yù)后不佳的因素之一。IL-5 是調(diào)控嗜酸性粒細(xì)胞生物學(xué)功能的關(guān)鍵性細(xì)胞因子[17]，與膿毒癥的相關(guān)性研究并不多，有研究提示其可能是臨床預(yù)防膿毒癥相關(guān)心臟損傷的潛在靶點(diǎn)[18]。朱德勝等[19]人的研究表明膿毒癥患兒體內(nèi)存在顯著高水平的IL-2，并且與治療時(shí)間以及心功能的損傷程度關(guān)系密切。綜上推測(cè)IL-2 和IL-5 可能參與了心臟衰竭的過(guò)程，進(jìn)而導(dǎo)致患者的不良預(yù)后。值得一提的是本研究結(jié)果并未發(fā)現(xiàn)IL-6 與患者不良預(yù)后有明顯的相關(guān)性，但是卻發(fā)現(xiàn)其與膿毒癥休克的發(fā)生有關(guān)。王小軍等[20]人的研究結(jié)果指出相較于膿毒癥非休克組，休克組的IL-6 水平明顯升高，但I(xiàn)L-6 水平與序貫器官衰竭（SOFA）評(píng)分之間沒(méi)有相關(guān)性，與本文研究結(jié)果一致，推測(cè)不同的細(xì)胞因子在膿毒癥的不同階段發(fā)揮著不同的作用，具體的機(jī)制值得后續(xù)深入研究。

降鈣素原（PCT）是膿毒癥診斷的重要指標(biāo)之一[21]，當(dāng)發(fā)生細(xì)菌感染時(shí)機(jī)體內(nèi)毒素和炎性因子可抑制PCT 的降解，致使其水平增高。膿毒癥過(guò)程中，中性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞對(duì)于感染的反應(yīng)迅速，中性粒細(xì)胞顯著增加，而各種抗炎細(xì)胞因子可誘導(dǎo)免疫抑制，進(jìn)而導(dǎo)致大量淋巴細(xì)胞凋亡，NLR 綜合反應(yīng)了這兩種炎性細(xì)胞的狀態(tài)，是反映機(jī)體全身性的炎癥及免疫狀態(tài)的有效指標(biāo)[22-23]。

鑒于PCT 在非感染情況下(如嚴(yán)重創(chuàng)傷、某些自身免疫性疾病)其水平也會(huì)升高，而NLR 作為一個(gè)新型炎癥指標(biāo)，目前尚缺乏公認(rèn)的NLR 最佳閾值，所以在膿毒癥患者病情比較復(fù)雜時(shí)，可考慮細(xì)胞因子作為協(xié)助診斷的標(biāo)志物。本次研究中也存在一定的局限性，首先，該研究是單中心研究，選擇偏倚的影響無(wú)法排除；其次，僅記錄了患者入院24h 內(nèi)的指標(biāo)濃度，動(dòng)態(tài)檢測(cè)指標(biāo)的變化可能更有意義；最后，本研究?jī)H根據(jù)28 天生存情況劃分生存組及死亡組，未對(duì)患者進(jìn)行動(dòng)態(tài)隨訪(fǎng)，無(wú)法獲得具體生存期限，需要在后續(xù)研究中進(jìn)一步補(bǔ)充納入時(shí)間變量的回歸分析結(jié)果。