肝細胞肝癌患者血清LG2m和hPG80表達水平及臨床價值研究

劉 宏,張春華,陽 宏,王萬琴（成都市雙流區第一人民醫院/四川大學華西空港醫院消化內科，成都 610200）

肝癌(liver cancer)是常見的消化系統惡性腫瘤，全球每年有100 萬新發病例，死亡達74 萬例[1]。肝細胞肝癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是肝癌最常見的病理類型。目前HCC 的治療以手術、化療、靶向治療及免疫治療等綜合治療為主，但HCC 易復發和轉移，患者預后不佳[2]。層黏連蛋白γ2 單體(laminin gamma 2 monomer,LG2m)是層黏連蛋白的多肽鏈組成成分，參與細胞黏附、分化、增殖和遷移等生理過程。研究發現，LG2m 在膀胱癌、卵巢癌等[3-4]惡性腫瘤中表達上調，能促進腫瘤細胞的侵襲和遷移，是新的評估腫瘤患者預后的生物標志物。人循環前胃泌素（human circulating gastrin，hPG80）是胃竇G 細胞合成的胃泌素前體。研究發現，神經內分泌癌、腎細胞癌等惡性腫瘤中hPG80表達升高，其能促進腫瘤的增殖及侵襲，導致患者不良預后。目前，HCC 患者血清LG2m，hPG80 表達及臨床意義尚不清楚。本研究通過檢測HCC 患者血清LG2m 和hPG80 水平，探討兩者的臨床意義。

1 材料與方法

1.1 研究對象 選擇2016年1月～2018年1月成都市雙流區第一人民醫院收治的128 例HCC 患者作為HCC 組。納入標準：①均接受根治性或姑息性肝切除術，術后病理明確為HCC；②首次診治；③臨床及病理資料完整；④患者及家屬已簽署知情同意書。排除標準：①并發膽管細胞癌或混合細胞型肝癌；②并發急性病毒性肝炎、肝膿腫等感染性疾病；③并發其它系統惡性腫瘤；④并發胃炎、胃潰瘍及胃泌素瘤等疾病；⑤并發類風濕關節炎等免疫性疾病。HCC 組中，男性70 例，女性58 例；年齡29～78(63.18±8.25)歲；腫瘤直徑≤5 cm者52 例，＞5 cm 者76 例；TNM 分期I～Ⅱ期67例，Ⅲ期61 例；腫瘤分化程度：低分化55 例，高中分化73 例；血清甲胎蛋白（alpha-fetoprotein，AFP）＜400 μg/L 58 例，≥400 μg/L 70 例；并發乙肝病毒感染（hepatitis B virus，HBV）78 例；脈管浸潤39 例。以同期診治的70 例肝臟良性病變患者為良性病變組。其中男性40 例，女性30 例；年齡27～79(64.02±8.17)歲；肝囊腫33 例，肝臟局灶性結節性增生24 例，肝臟血管平滑肌脂肪瘤13 例。以同期體檢的70 例健康人為對照組，其中男性37 例，女性33 例；年齡25～80(63.52±7.97)歲。三組患者性別、年齡差異無統計學意義(χ2/t=0.110，0.061，0.260；0.687，0.281，0.367，均P＞0.05)。本研究經醫院倫理委員會批準。

1.2 儀器與試劑 LG2m 試劑盒（重慶智選生物科技有限公司，貨號ZX15987）；hPG80 試劑盒（武漢菲恩生物科技有限公司，貨號EH4077）；imark 酶標儀（美國伯樂公司）。

1.3 方法

1.3.1 檢測方法：采集HCC 組和良性病變組患者入院次日清晨空腹及對照組體檢當日清晨空腹靜脈血5ml，3 500 r/min 離心30 min，分離血清。采用酶聯免疫吸附實驗（雙抗體夾心法）檢測血清LG2m 和hPG80 水平。實驗步驟按照試劑盒說明書進行，根據標準品繪制標準曲線，計算樣品的濃度值。

1.3.2 隨訪：HCC 患者出院后采用門診或電話進行隨訪，第1年每3 個月隨訪1 次，第2年每6 個月隨訪1 次，第3～5年每年隨訪1 次。記錄患者生存時間。隨訪截止時間至2023年2月1日。隨訪的終點為隨訪時間截止或患者死亡。

1.4 統計學分析 采用SPSS25.0 統計軟件對數據進行分析。計量資料以均數±標準差（±s）表示，組間比較采用兩獨立樣本t檢驗，三組間比較采用F檢驗,兩兩比較采用LSD-t檢驗。采用受試者工作特征曲線（receiver operating curve，ROC）分析血清LG2m，hPG80 對HCC 患者生存預后的評估價值。采用Kaplan-Meier 法繪制生存曲線，Log-Rank 檢驗比較曲線間差異。采用單因素和多因素COX 回歸分析HCC 患者預后的影響因素。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組血清LG2m，hPG80 水平比較 見表1。HCC 組血清LG2m，hPG80 水平較良性病變組和對照組顯著升高，差異具有統計學意義(t=73.015，76.635；68.240，70.468，均P＜0.05)。

表1 各組血清LG2m，hPG80 水平比較（±s，ng/L）

表1 各組血清LG2m，hPG80 水平比較（±s，ng/L）

項 目HCC 組(n=128)良性病變組（n=70）對照組（n=70）FP LG2m28.14±3.109.18±1.748.24±1.652 070.7390.000 hPG8084.83±11.3925.10±4.1123.15±3.261 777.7840.000

2.2 血清LG2m，hPG80 水平與HCC 臨床病理參數的關系 見表2。TNM 分期Ⅲ期、低分化程度、血清AFP＞400μg/L 患者血清LG2m，hPG80水平高于TNM 分期I～Ⅱ期、高中分化程度，AFP ≤400μg/L 患者，差異均具有統計學意義(均P＜0.05)。

表2 血清LG2m，hPG80 水平與HCC 臨床病理參數的關系（±s，ng/L）

表2 血清LG2m，hPG80 水平與HCC 臨床病理參數的關系（±s，ng/L）

類 別nLG2mtPhPG80tP年齡（歲）＜605427.76±3.04 0.1190.905 83.20±12.50 1.4050.162≥607428.42±3.5886.02±10.18性別男性7028.45±2.99 1.2460.215 85.06±10.24 0.2510.802女性5827.77±3.1784.55±12.74腫瘤直徑(cm)≤55227.61±3.56 84.02±12.60 0.6450.520＞57628.50±3.0385.38±11.06 1.5190.131 TNM 分期I～Ⅱ6125.38±3.04 80.20±12.34 4.4650.000Ⅲ6730.65±3.2389.05±10.05 9.4810.000腫瘤分化程度高中分化7323.58±3.04 81.88±11.39 13.5520.000 3.2160.002低分化5531.19±3.2888.74±12.65血清AFP(μg/L)≤4005826.11±3.10 6.8120.000 80.03±12.57 4.3360.000＞4007029.82±3.0488.81±10.34 HBV 感染有7828.55±3.08 85.03±10.25 0.2600.795無5027.50±3.1584.52±11.68 1.8650.064脈管浸潤有3928.44±3.24 85.51±12.20 0.4480.655無8928.01±3.0584.53±11.04 0.7200.473

2.3 血清LG2m，hPG80 對HCC 的預后評估價值見表3，圖1。以HCC 患者隨訪中是否死亡為因變量（是=1，0=否），ROC 曲線分析結果，血清LG2m，hPG80 聯合對HCC 患者預后評估的曲線下面積為0.934，大于單項指標檢測的0.813 和0.896。

圖1 時間依賴ROC 曲線分析血清LG2m，hPG80 對HCC 的預后評估價值

表3 血清LG2m，hPG80 對HCC 的預后評估價值

2.4 不同血清LG2m，hPG80 水平HCC 患者生存預后比較 HCC 患者隨訪中，2 例失訪，63 例死亡，五年總體生存率為50.78%（65/128）。以表3 中血清LG2m，hPG80 診斷HCC 預后的最佳截斷值為臨界值，將HCC 患者分為LG2m 高表達組（＞29.69ng/L，n=65）和低表達組（≤29.69ng/L，n=63），hPG80 高表達組（＞85.81ng/L，n=62）和低表達組（≤85.81ng/L，n=66）。

血清LG2m 高表達組和低表達組HCC 患者的五年總體生存率分別為33.33%（21/63），67.69%（44/65）。與血清LG2m 低表達HCC 患者相比，血清LG2m 高表達HCC 患者五年累積生存率更低(Log-Rankχ2=19.522，P=0.000)。血清hPG80 高表達和低表達組HCC 患者的五年總體生存率分別為35.48%（22/62），65.15%（43/66）。 與血清hPG80 低表達HCC 患者相比，血清hPG80 高表達HCC患者五年累積生存率更低(Log-Rankχ2=12.546，P=0.000)。見圖2。

圖2 Kaplan-Meier 生存分析血清LG2m，hPG80 水平對HCC 患者預后影響

2.5 血清LG2m，hPG80 水平與HCC 預后關系的單因素、多因素分析 見表4，5。結果顯示TNM分期Ⅲ期、低分化程度、血清AFP ≥400μg/L 和LG2m 高表達，hPG80 高表達是HCC 患者不良生存預后的獨立危險因素。

表4 HCC 患者預后的單因素COX 回歸分析

表5 HCC 患者預后的多因素COX 回歸分析

3 討論

我國肝癌發病率約14.80/10 萬，死亡率約9.51/10 萬，嚴重威脅人民健康[7]。HCC 的治療方案包括手術治療、介入治療、化療等，但HCC 腫瘤惡性程度高，腫瘤容易復發轉移，患者生存預后較差[8]。目前臨床上主要根據TNM 分期系統、巴塞羅那臨床分期系統對HCC 患者的預后進行評估。但由于HCC 腫瘤的異質性和復雜性等因素，各預后評估系統尚不能準確評估所有患者的臨床預后。深入研究HCC 的疾病機制，尋找能夠有效評估HCC 患者臨床預后的生物標志物，具有重要的臨床意義。

層黏連蛋白γ2 單體(LG2m)是層黏連蛋白的構成成分，其作為基底膜中細胞外基質蛋白，在細胞黏附、遷移等過程中發揮重要的調控作用。研究發現，多聚體形式的層黏連蛋白可水解為單體形式的LG2m，在胃癌等惡性腫瘤中發揮促進腫瘤細胞遷移和侵襲作用[9]。本研究中，HCC 患者血清LG2m 升高，這與既往在HCC 組織中通過免疫組織化學方法檢測的結果一致[9]。HCC 患者血清LG2m 升高與基質金屬蛋白酶對層黏連蛋白蛋白酶解有關。研究表明，HCC 中基質金屬蛋白酶-14 表達升高[10]，基質金屬蛋白酶-14 能夠裂解層黏連蛋白的LG2m 鏈的結構域，導致血清游離LG2m 水平升高[11]。本研究中,血清LG2m 與HCC 患者不良臨床病理特征有關，提示LG2m 參與HCC 的腫瘤進展。研究表明，LG2m 含有層黏連蛋白-表皮生長因子樣基序樣結構域，通過結合表皮生長因子受體，激活下游AKT 信號傳導，促進腫瘤細胞惡性增殖、侵襲轉移，導致腫瘤進展[12]。尚有學者在卵巢癌中發現，分泌的LG2m 能夠與核受體亞家族6A 組成員1 形成融合蛋白，激活表皮生長因子信號通路，促進卵巢癌腫瘤細胞的增殖、侵襲和轉移[4]。本研究中，血清LG2m 對HCC 患者的生存預后具有較高的診斷價值，LG2m 高表達的HCC患者生存預后更差，表明血清LG2m 是評估HCC患者生存預后的血清標志物。分析其機制，一方面是LG2m 能夠促進HCC 的腫瘤惡性進展，導致患者不良預后。研究表明，HCC 腫瘤細胞中LG2m的表達升高能夠結合腫瘤細胞表面跨膜整合素受體α3β1，激活轉錄因子Snail 的表達，促進腫瘤細胞發生上皮間質轉化，腫瘤細胞的侵襲和遷移能力增強，容易形成微小轉移病灶及脈管內癌栓，術中難以徹底切除，導致術后腫瘤復發和轉移[13]。另一方面是LG2m 的表達上調能夠降低腫瘤對化療等治療的敏感性，導致不良生存預后。有學者報道能夠上調胰腺癌中三磷酸腺苷結合盒轉運蛋白表達，促進吉西他濱等化療藥的外排，增強腫瘤細胞對鉑類化療藥物的耐藥性[14]。因此，HCC 中LG2m 的表達升高促進腫瘤的發生發展，是新的HCC 預后相關腫瘤標志物。

人循環前胃泌素（hPG80）是由GAST 基因編碼的80 個氨基酸的蛋白。胃竇G 細胞中hPG80 翻譯后在內質網中折疊，由高爾基體包裝、切割加工形成成熟的胃泌素，并以囊泡形式轉運分泌到細胞外[15]。近年來發現，乳腺癌等惡性腫瘤患者血清hPG80 水平升高，并增加腫瘤復發和轉移的風險，是新的腫瘤診斷及預后評估的血清標志物[16]。本研究中，HCC 患者血清hPG80 水平升高，這與DUPUY 等[17]學者在早期HCC 中發現的血清hPG80 水平升高的研究結果一致。HCC 患者血清hPG80 水平升高與腫瘤中Wnt 通路的過度激活有關。研究表明，HCC 中存在WNT/β-連環蛋白/T細胞因子4 激活的現象，T 細胞因子4 活化后進入細胞核，結合hPG80 的編碼基因GAST 的啟動子區域，在轉錄水平激活hPG80 的表達，引起HCC 患者血清hPG80 水平升高[18-19]。本研究中，hPG80 與HCC 患者不良臨床病理特征有關，提示hPG80 促進HCC 的腫瘤進展。分析其機制，hPG80 能夠通過上調腫瘤干細胞標志物如性別決定區Y 框蛋白4的表達，增強腫瘤細胞的侵襲和轉移能力，導致腫瘤惡性進展[20]。有學者利用hPG80 單克隆抗體對結直腸癌、食管癌及肝癌等腫瘤細胞系進行體外孵育，發現其能夠明顯抑制腫瘤細胞的增殖及干細胞樣特征，減弱腫瘤細胞的侵襲和轉移能力[21]。因此，HCC 中hPG80 的表達升高促進腫瘤發生發展，是潛在的HCC 預后及治療靶點。本研究發現，血清hPG80 對評價HCC 患者的生存預后具有較高的診斷價值，提示hPG80 是新的評估HCC 預后相關血清標志物。研究發現，腫瘤細胞分泌的hPG80 可作用于腫瘤微環境中的成纖維細胞，促進其向腫瘤相關成纖維細胞分化，抑制腫瘤微環境中腫瘤殺傷性CD8+T 淋巴細胞的浸潤，導致腫瘤免疫逃逸的發生[21]。另外，hPG80 的升高亦能夠增加HCC 腫瘤復發及轉移的風險，導致患者不良預后。研究發現，腫瘤細胞中hPG80 的表達上調能夠增強腫瘤干性標志物表達，促進腫瘤細胞對化療藥物耐藥性形成，降低化療治療有效性，導致患者不良預后[6]。

本研究中，TNM 分期Ⅲ期、低分化程度和血清AFP ≥400μg/L 是HCC 患者不良生存預后的獨立危險因素，這與既往研究報道一致[22]。筆者分析，對于高TNM 分期、低分化程度及血清AFP 水平較高的HCC 患者，腫瘤惡性程度高，易發生血管侵犯及病灶周圍微小轉移灶，術中腫瘤切除難度大，這些因素均會增加患者治療后腫瘤復發和轉移率，影響HCC 患者遠期生存預后。

綜上所述,HCC 患者血清LG2m 和hPG80 水平升高，兩者表達與TNM 分期、腫瘤分化程度、AFP 水平有關，均參與HCC 的腫瘤發生發展過程。血清LG2m，hPG8 高表達的HCC 患者臨床預后較差，是HCC 患者不良生存預后的獨立危險因素，兩項聯合能有效評估HCC 患者生存預后。因此，血清LG2m 和hPG8 可作為新的評價HCC 患者臨床預后的生物標志物，同時結合傳統的腫瘤TNM分期及腫瘤分化程度等臨床病理因素，綜合評估HCC 患者的生存預后。但本研究也存在一定的局限，本研究樣本量有限，未能動態監測血清LG2m和hPG8 水平變化，有待今后設計多中心大樣本臨床實驗，進一步研究HCC 患者血清LG2m 和hPG8水平變化的臨床意義。