建立一種基于BAS化學(xué)發(fā)光技術(shù)檢測血清β-hCG，Prog水平的抗生物素干擾方法

陳 龍，鄭詳武（.通用環(huán)球西安北環(huán)醫(yī)院檢驗科，西安 7003；.山陽縣人民醫(yī)院檢驗科，陜西商洛 76400）

人絨毛膜促性腺激素β 亞基（β-human chorionic gonadotropin，β-hCG）和孕酮（Progesterone，Prog）是育齡期女性最常用的檢測項目，目前主要采用的方法之一是基于生物素-鏈霉親和素（biotin-avidin-streptavidin，BAS）的化學(xué)發(fā)光技術(shù)[1]，但生物素會對該技術(shù)產(chǎn)生干擾，導(dǎo)致檢測結(jié)果假性升高或假性降低[2-5]。妊娠期女性對生物素的需求量較未妊娠期高[6-7]，因此妊娠期女性在采用該技術(shù)檢測β-hCG 和Prog 時，受到生物素干擾的風(fēng)險更高。然而目前人們對此關(guān)注較少，基層實驗室也缺少對此的應(yīng)對方法。有研究報道，采用高濃度鏈霉親和素磁珠（streptavidin coated magnetic micro particles，M）可增強抗生物素干擾能力[8]，本文據(jù)此試圖建立一種針對β-hCG 和Prog 的簡易的抗生物素干擾方法，以減少臨床誤診和漏診的風(fēng)險。

1 材料與方法

1.1 研究對象 采用兩種濃度的M（M1 和M2）檢測添加了不同濃度生物素的高、中、低水平的β-hCG 和Prog 樣品。血清樣品來自于2022年5月1日～9月30日通用環(huán)球西安北環(huán)醫(yī)院檢驗科日常檢測后的標(biāo)本制成的混合血清。

1.2 儀器與試劑 電子分析天平（0.1 mg）（德國賽多利斯集團）；低速離心機（長沙湘智公司）；羅氏E 601全自動電化學(xué)發(fā)光免疫分析系統(tǒng)，β-hCG自動電化試劑（批號45406003），Prog 試劑（批號47811003）均為瑞士羅氏公司產(chǎn)品；M 試劑以羅氏β-hCG 和Prog 試劑盒中的M 試劑為原料進行制備，生物素試劑（99.9%純度，Sigma 公司，批號SLBS8478），PBS 溶液（上海如吉生物科技發(fā)展有限公司，批號1906ZPW02）。

1.3 實驗方法

1.3.1 生物素溶液制備：精確稱量10 mg 生物素，溶于50 ml PBS 溶液中。其生物素濃度為200 000 ng/ml。用PBS 稀釋制備濃度為250，500，1 000，2 000，3 000，4 000，5 000，6 000，7 000，8 000，9 000和10 000 ng/ml 的生物素溶液。另取2 ml PBS 溶液作為生物素濃度為0 ng/ml。4～8℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 混合血清制備：凍存于-80℃的β-hCG 和Prog 高、中、低值血清各10 份（β-hCG 和Prog原始濃度范圍分別為10.3～ 9 855 IU/L 和5.85～180.6 nmol/L）。每份血清各取280 μl，充分混勻，共2 800 μl；分為15 份，每份180 μl，分別標(biāo)識為“β-hCG/Prog 高/中/低值混合血清”。制成的混合血清其高、中、低值濃度分別為：β-hCG：9 721，2 605 和128 IU/L；Prog：138.0，57.5 和13.1 nmol/L。-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 生物素血清制備：取13 份β-hCG 高值混合血清，第一份不添加任何物質(zhì)，從第二份開始分別加入濃度為0，250，500，1 000，2 000，3 000，4 000，5 000，6 000，7 000，8 000，9 000 和10 000 ng/ml 的生物素溶液20 μl，血清中的生物素濃度分別為0，25，50，100，200，300，400，500，600，700，800，900 和1 000 ng/ml。剩余2 份血清留存?zhèn)溆谩０瓷鲜龇椒ǚ謩e制備β-hCG 中、低值和Prog 高、中、低值生物素血清。

1.3.4 高濃度 M(M2)制備：已知羅氏公司生產(chǎn)的M 試劑鏈霉親和素磁珠濃度為0.72 mg/ml，以此為低濃度M（M1）；并以此為原材料，取出12 ml 裝于試管中，1 000 r/min 離心15 min，吸取上清液6 ml 棄去，剩余的6 ml 即為1.44 mg/ml 的M(M2)。標(biāo)識清楚，4～8℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.5 實驗方法：在羅氏E 601 檢測平臺上，分別采用兩種M 檢測血清樣品的β-hCG 和Prog 濃度。通過回收試驗評價兩種M 的抗生物素干擾能力以及M2 檢測β-hCG 和Prog 的準(zhǔn)確度[9]。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析 采用Excel 2013 進行統(tǒng)計分析。回收率計算方法：①抗干擾能力閾值的回收試驗：回收率（%）=（各M 有生物素添加時的檢測結(jié)果/各M 無生物素添加時的檢測結(jié)果）×100%；②M2 檢測準(zhǔn)確度的回收試驗：回收率（%）=（M2有生物素添加時的檢測結(jié)果/M1 無生物素添加時的檢測結(jié)果）×100%。回收率在90%～110%之間為可接受標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1 兩種濃度M 時β-hCG 和Prog 的抗生物素干擾能力 隨著樣品中生物素濃度的增加，β-hCG三個水平的檢測結(jié)果均逐漸下降；而Prog 三個水平的檢測結(jié)果均逐漸升高。與無生物素添加的樣品相比，M1 時β-hCG 和Prog 三個水平的回收率均在90%～110%之間時所對應(yīng)的生物素濃度分別為100 和25 ng/ml 以下。見表1。而M2 時β-hCG 和Prog 三個水平的回收率均在90%～110%之間時所對應(yīng)的生物素濃度分別為500ng/ml 和50 ng/ml 以下。見表2。

表1 低濃度鏈霉親和素磁珠（M1）時β-hCG 和Prog 的回收試驗

表2 高濃度鏈霉親和素磁珠（M2）時β-hCG 和Prog 的回收試驗

2.2 M2 檢測β-hCG 和Prog 的準(zhǔn)確度評價 根據(jù)表1 和表2，在應(yīng)用M1 校準(zhǔn)曲線時，以M1 檢測無生物素添加的結(jié)果為基準(zhǔn)，M2 檢測生物素濃度在500 ng/ml 以下的β-hCG，三個水平的回收率均在90%～110%之間；M2 檢測生物素濃度在50 ng/ml以下的Prog，高、中水平的回收率在90%～110%之間，而低水平的回收率為114.75%。 見表3。

表3 應(yīng)用M1 校準(zhǔn)曲線時M2 檢測β-hCG 和Prog 的回收率（%）

3 討論

生物素(biotin)，又稱為維生素H、維生素B7、輔酶R 等，是水溶性維生素B 族成員之一[10-11]，具有多種生物學(xué)作用，是多種羧化酶的輔酶，也是合成維生素C 的必要物質(zhì)，在脂肪合成、糖質(zhì)新生等生化反應(yīng)途徑中扮演重要角色[12]。盡管目前認(rèn)為高劑量生物素對人體無毒害作用，一般膳食攝入量也不足以影響基于BAS 的化學(xué)發(fā)光項目測定，但是長期大劑量攝入生物素的情況還是會導(dǎo)致在應(yīng)用該技術(shù)時受到干擾的風(fēng)險增加。文獻報道，美國人群生物素的日常攝入?yún)⒖剂繛?0 μg/天[13]，但從1986年以來，美國人群中服用含有生物素補充劑的比例從17%上升至33%，劑量通常在100 μg 左右，最高可達10 000 μg，這導(dǎo)致了近些年來生物素干擾案例增多[14-16]。根據(jù)《中華人民共和國衛(wèi)生行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)WS/T 578.5-2018》[6]，妊娠女性推薦的生物素適宜攝入量為50 mg/天，這更是遠高于美國人群的攝入量。因此，中國妊娠女性在應(yīng)用基于BAS 的化學(xué)發(fā)光檢測β-hCG 和Prog 時，受到生物素干擾的風(fēng)險可能更高，廣大基層實驗室對這兩個項目亟需一種簡易有效的抗干擾方法。

本研究根據(jù)生物素對基于BAS 化學(xué)發(fā)光技術(shù)干擾的機制[17-20]而設(shè)計。該機制提示：干擾的發(fā)生是由于外源性生物素會和試劑中的生物素競爭性地與鏈霉親和素結(jié)合，發(fā)光物質(zhì)不能被鏈接于磁珠上的鏈霉親和素捕獲，導(dǎo)致可被檢測到的光信號下降[19]。由于夾心法模式中待測物濃度與光信號呈正相關(guān)，故表現(xiàn)為檢測結(jié)果的假性降低；而競爭法模式中待測物濃度與光信號呈負相關(guān)，故表現(xiàn)為檢測結(jié)果假性升高[20]。因此，當(dāng)鏈霉親和素足夠多時，即可保證所有的發(fā)光物質(zhì)被捕獲，從而避免干擾。而鏈霉親和素通常是和磁珠鏈接在一起的，因此增加反應(yīng)體系中M 的量可提升抗生物素干擾能力。多位學(xué)者[21-22]已在儀器內(nèi)外通過預(yù)先使用M 試劑對樣品中的生物素進行吸附去除，取得了一定的效果。但也有研究發(fā)現(xiàn)，M 濃度過大可對光信號產(chǎn)生一定的屏蔽作用，M 濃度越大，屏蔽作用越強。當(dāng)M 濃度超過1.44 mg/ml 時，如果要用于項目檢測，則需要建立新的校準(zhǔn)曲線，且其空白檢出限、最低檢出限和定量檢出限均會受到一定的影響[8,23]。因此，本研究中采用了光信號在達到平臺期時的最大M 濃度1.44 mg/ml（M2）[24]。

β-hCG 為夾心法模式而Prog 為競爭法模式，因此隨著生物素干擾的增多，β-hCG 檢測結(jié)果下降，而Prog檢測結(jié)果升高。本研究顯示，對于β-hCG和Prog，M1 的抗生物素干擾能力分別為100 和25 ng/ml（表1），這與羅氏公司試劑說明書中所聲明的干擾閾值大致接近；而M2 的抗生物素干擾能力分別可達到500 和50 ng/ml（表2），這要遠高于M1 的抗干擾閾值。在應(yīng)用M1 校準(zhǔn)曲線時，M2 在其抗干擾閾值以下時，對于高、中、低水平的β-hCG和高、中水平的Prog 均具有較好的準(zhǔn)確度（表3）。盡管對于低水平Prog，在50 ng/ml 的生物素干擾時，其回收率為114.75%，略高于既定的標(biāo)準(zhǔn)，但絕對值差異只有1.8 nmol/L（表1，表2）。對于低水平樣品，通常宜采用更寬的接受標(biāo)準(zhǔn)或采用絕對值差異來表述，血糖儀的比對合格標(biāo)準(zhǔn)即是如此[25]。因此，1.8 nmol/L 的差異也是可以接受的。基于以上，可以認(rèn)為在應(yīng)用M1 校準(zhǔn)曲線時，M2 可增加β-hCG和Prog的抗生物素干擾能力，且具有較好的準(zhǔn)確度。需要注意的是，由于條件限制，本研究未能對血清中真實生物素濃度進行測定，生物素干擾閾值只是根據(jù)所加入的生物素量來計算，這可能導(dǎo)致本文中的生物素干擾閾值偏低。另外，本研究也未對M2的檢出限進行評價，這可能對低值樣品有一定影響。

綜上所述，對于妊娠人群，在應(yīng)用基于BAS化學(xué)發(fā)光技術(shù)檢測β-hCG 和Prog 時，采用M2 可以增強其抗生物素干擾能力，不需要建立新的校準(zhǔn)曲線，可保證一定的準(zhǔn)確度，從而降低生物素干擾帶來的誤診和漏診的風(fēng)險。另外，相較于文獻中已報道的其他方法會增加30～120 min 的周轉(zhuǎn)時間（TAT）[22,26]，本方案幾乎不會延長TAT。對于終端用戶來講，每個試劑盒均有一定的剩余量，可以用來制備少量的M2，也不會增加實驗室的成本負擔(dān)。因此，本方案是一種經(jīng)濟、便捷、有效且較為可靠的抗生物素干擾方法，適合于基層實驗室日常工作中應(yīng)急使用。