類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者關(guān)節(jié)滑液及滑膜組織中CCP/AST表達(dá)水平及臨床意義

朱玉光，方麗佳，黃素玲（石家莊市中醫(yī)院檢驗(yàn)科，石家莊 050011）

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）是一種以侵蝕性關(guān)節(jié)炎癥為主要臨床表現(xiàn)的自身免疫病，其基本病理表現(xiàn)為滑膜炎，并逐漸出現(xiàn)關(guān)節(jié)軟骨和骨破壞，最終導(dǎo)致關(guān)節(jié)畸形和功能喪失[1]。目前關(guān)于RA 的發(fā)病機(jī)制尚不明確，多認(rèn)為與自身抗原刺激機(jī)體產(chǎn)生自身抗體從而導(dǎo)致機(jī)體調(diào)節(jié)功能紊亂有關(guān)，研究發(fā)現(xiàn)[2]，RA 患者由于免疫系統(tǒng)功能紊亂，常發(fā)生免疫應(yīng)答，使得機(jī)體中產(chǎn)生多種自身特異性抗體，進(jìn)而引起各種促炎細(xì)胞因子的釋放，引起關(guān)節(jié)滑膜慢性炎癥、炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)、軟骨和骨骼破壞，最終導(dǎo)致關(guān)節(jié)組織的破壞。早期診斷、達(dá)標(biāo)治療是控制病情和改善預(yù)后的關(guān)鍵，自身抗體對(duì)RA 患者的診斷與鑒別診斷以及病情嚴(yán)重程度和預(yù)后的判斷有著重要作用。類風(fēng)濕因子（rheumatoid factor，RF）是RA 中首個(gè)檢測(cè)到的自身抗體，與RA 患者疾病活動(dòng)度密切相關(guān)，陽(yáng)性率約為70%，但RF 在其它疾病（干燥綜合征、血液病等）中均呈現(xiàn)陽(yáng)性，因此其缺乏特異性[3-4]。抗環(huán)瓜氨酸多肽（anticyclic citrulline peptide，anti-CCP）是一類以瓜氨酸類蛋白為靶抗原的自身抗體，是由RA 患者B 淋巴細(xì)胞自發(fā)分泌，而其他疾病患者和正常人群B 淋巴細(xì)胞并不自發(fā)分泌CCP，因此認(rèn)為診斷RA 具有較高的靈敏度和特異度[5-6]。有學(xué)者認(rèn)為CCP 可能作為早期致病靶抗原參與RA 的發(fā)病機(jī)制，誘導(dǎo)抗原特異性T 細(xì)胞的產(chǎn)生并引發(fā)一系列自身免疫反應(yīng)，即在患病早期患者體內(nèi)可能出現(xiàn)CCP抗原特異性T 淋巴細(xì)胞（CCP/AST）[7-8]。基于此，本研究通過檢測(cè)RA 患者關(guān)節(jié)滑液及滑膜組織中CCP/AST 表達(dá)水平，為探究RA 發(fā)病的免疫學(xué)機(jī)制以及臨床治療提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象 納入石家莊市中醫(yī)院2021年1～12月收治的128 例RA 患者作為RA 組，根據(jù)關(guān)節(jié)功能分類標(biāo)準(zhǔn)將患者分為輕度組（I～I(xiàn)I 級(jí)，n=46），中度組（III 級(jí)，n=52）和重度組（IV 級(jí)，n=30）。納入標(biāo)準(zhǔn)：①所有患者均根據(jù)美國(guó)風(fēng)濕病學(xué)會(huì)標(biāo)準(zhǔn)[9]診斷為RA，嚴(yán)重程度I～I(xiàn)V 級(jí)；②近期無(wú)免疫性藥物或抗體治療。排除標(biāo)準(zhǔn)：①其他風(fēng)濕性疾病；②嚴(yán)重肝腎功能障礙患者；③有精神疾病史、妊娠哺乳期患者。選取同時(shí)期在石家莊市中醫(yī)院行關(guān)節(jié)鏡檢查的關(guān)節(jié)疼痛患者50 例作為對(duì)照組，其中男性18 例，女性32 例，年齡30～75（53.65±5.43）歲。RA 組患者男性43 例，女性85 例，年齡30～75（55.24±6.19）歲。RA組和對(duì)照組性別、年齡比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2/t=0.092，1.592，P=0.761，0.113）。本研究通過倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)，研究對(duì)象均提供知情同意書。

1.2 儀器與試劑 膠原酶 A，DNAse（Roche 公司，瑞士）；Pierce? BCA 蛋白質(zhì)檢測(cè)試劑盒（賽默飛世爾科技公司，美國(guó)）；兔抗人RF 多克隆抗體、兔抗人β-ACTIN 多克隆抗體（Abcam 公司，美國(guó)）；兔抗人ACPA 多克隆抗體（CST 公司，德國(guó)）；辣根過氧化物酶偶聯(lián)二抗（上海碧云天公司）；Clarity? Western ECL Substrate，ChemiDoc?MP 成像系統(tǒng)（BIO-RAD 公司，美國(guó)）；SYBRGREEN 化學(xué)實(shí)時(shí)PCR（海德堡科技公司，德國(guó)）；StepOnePlus? Real-Time PCR System，ABI 7500 Prism 系統(tǒng)軟件（應(yīng)用生物系統(tǒng)公司，美國(guó)）；BD LSRII 流式細(xì)胞儀（BD 公司，美國(guó)）。

1.3 方法

1.3.1 樣本采集：RA 組及對(duì)照組通過超聲引導(dǎo)關(guān)節(jié)鏡檢查獲得滑膜組織和關(guān)節(jié)滑液，F(xiàn)icoll-Hypaque 梯度離心制備滑液?jiǎn)魏思?xì)胞（synovial fluid mononuclear cells，SFMC），將細(xì)胞離心收集后，用細(xì)胞凍存液重懸，取1ml 細(xì)胞至凍存管中，放入凍存盒，將凍存盒置于-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 蛋白質(zhì)印跡分析：使用裂解緩沖液提取滑膜組織中蛋白質(zhì)并通過Pierce? 二喹啉甲酸(bicinchoninic acid，BCA)蛋白質(zhì)檢測(cè)試劑盒（賽默飛世爾科技公司，美國(guó)）進(jìn)行定量。在每孔細(xì)胞中加入200μl 含100mmol/L 苯甲基磺酰氟(phenylmethanesulfonyl fluoride，PMSF)和1 mol/L二硫蘇糖醇(DL-dithiothreitol，DTT)的細(xì)胞裂解緩沖液RIPA，吹打細(xì)胞進(jìn)行重懸，超聲裂解 20～30次，冰上裂解30min，100℃金屬浴 5 min，然后進(jìn)行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)電泳、轉(zhuǎn)膜，5ml/dl 脫脂奶粉進(jìn)行封閉，孵育一抗[抗RF（Abcam，ab106646；稀釋度1∶1 000），抗ACPA（CST，3598S；稀釋度1∶1 000）和抗 β-ACTIN（Abcam，ab8227；稀釋1∶5 000）]，孵育二抗（辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG），電化學(xué)發(fā)光(electro chemiluminescence，ECL)plus 試劑檢測(cè)蛋白。用洗膜緩沖液沖洗后，使用Clarity? Western ECL Substrate（BIO-RAD 公司，美國(guó)）進(jìn)行可視化，使用ChemiDoc? MP 成像系統(tǒng)（BIO-RAD 公司，美國(guó)）進(jìn)行條帶檢測(cè)。

1.3.3 關(guān)節(jié)滑液中CCP/AST 表達(dá)分析：標(biāo)記來(lái)自RA 患者和對(duì)照組中可溶性纖維蛋白單體復(fù)合物（soluble fibrin monomer complex,SFMC）樣本。樣品在BD LSRII 流式細(xì)胞儀上運(yùn)行，并使用FlowJo軟件版本9.3.3 分析數(shù)據(jù)。抗原特異性細(xì)胞的頻率計(jì)算為結(jié)合部分中CD3+T 淋巴細(xì)胞與單核細(xì)胞比值(tlymphocyte-monocyte ratio，TMR)的總數(shù)除以CD4+T 細(xì)胞的總數(shù)。

1.3.4 滑膜組織CCP/AST 染色強(qiáng)度：雙重免疫熒光染色/激光共聚焦掃描觀察滑膜組織中CCP/AST染色強(qiáng)度，陽(yáng)性細(xì)胞為細(xì)胞膜呈清晰紅、黃熒光染色，按陰性、弱、中、強(qiáng)分別評(píng)為 0～3 分。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用軟件SPSS 25.0 進(jìn)行所有數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析，經(jīng)Shapiro-Wilk 檢驗(yàn)是否符合正態(tài)分布，符合正態(tài)分布的計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間數(shù)據(jù)采用單因素方差分析，進(jìn)一步組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料采用例數(shù)和百分比表示，組間比較采用χ2分析；應(yīng)用Pearson 相關(guān)性分析關(guān)節(jié)滑液、滑膜組織中CCP/AST 表達(dá)與RF 和ACPA 的相關(guān)性；采用Logistic回歸分析類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎發(fā)生的危險(xiǎn)因素，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 四組滑膜組織RF 和ACPA 蛋白表達(dá) 對(duì)照組、輕度組、中度組和重度組患者滑膜組織中RF（1.01±0.01，1.53±0.03，2.01±0.08 和2.66±0.12 kDa）和ACPA（1.03±0.01，1.61±0.03，2.04±0.10和2.59±0.13 kDa）蛋白依次升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=14.207，12.446，均P＜0.001）；與對(duì)照組比較，輕度組、中度組、重度組滑膜組織RF 和ACPA 差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=115.816，129.179；87.715，71.064；97.078，84.795，均P＜0.001）。與輕度組比較，中度組、重度組RF 和ACPA 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=38.359,28.054;61.199,49.316,均P＜0.001）。中度組與重度組比較，RF 和ACPA 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=29.399,21.456,均P＜0.001）。

2.2 關(guān)節(jié)滑液和滑膜組織中CCP/AST 表達(dá)分析 對(duì)照組、輕度組、中度組和重度組患者關(guān)節(jié)滑液中CCP/AST表達(dá)（8.26%±1.68%，22.46%±3.28%，33.58%±4.37%和46.15%±5.44%）、滑膜組織CCP/AST 染色強(qiáng)度（1.05±0.26，1.35±0.89，2.04±0.56 和2.78±0.15 分）依次升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=25.306，70.670，均P＜0.05）。與對(duì)照組比較，輕度組、中度組、重度組關(guān)節(jié)滑液和滑膜組織中CCP/AST 表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=27.011，3.674；38.331，12.504；47.129，18.741，均P＜0.05），與輕度組比較，中度組、重度組CCP/AST 表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=14.097，4.648；23.702，8.701，均P＜0.05）。中度組與重度組比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=11.457，7.076，均P＜0.05）。

2.3 相關(guān)性分析 輕度組、中度組和重度組患者關(guān)節(jié)滑液、滑膜組織中CCP/AST 表達(dá)與RF 和ACPA呈明顯正相關(guān)（r=0.840，0.934；0.802，0.913，均P＜ 0.001）。

2.4 RA 發(fā)生的危險(xiǎn)因素分析 見表1。Logistic 回歸分析結(jié)果顯示，高血壓、糖尿病以及關(guān)節(jié)滑液、滑膜組織中CCP/AST 表達(dá)均為RA 發(fā)生的獨(dú)立危險(xiǎn)因素（均P＜0.05）。

表1 Logistic 回歸分析RA 的危險(xiǎn)因素

3 討論

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（RA）是一種與滑膜炎和關(guān)節(jié)破壞相關(guān)的復(fù)雜炎癥性疾病，其特征是滑膜關(guān)節(jié)慢性炎癥、血管翳形成、進(jìn)行性骨侵蝕和關(guān)節(jié)破壞，患者通常會(huì)出現(xiàn)關(guān)節(jié)腫脹和壓痛，嚴(yán)重可導(dǎo)致殘疾[10-11]。RA 的發(fā)展是一個(gè)持續(xù)的、進(jìn)行性的、全身性的病理過程，在RA 發(fā)病前或早期即可在血清中檢測(cè)到RF，ACPA 等多種自身抗體。 隨著各種免疫、成纖維細(xì)胞和細(xì)胞因子的逐漸相互作用，滑膜組織逐漸產(chǎn)生慢性炎癥，并伴有骨侵蝕和破壞，導(dǎo)致各種臨床癥狀和損傷[12-13]。此外，許多器官系統(tǒng)可能會(huì)因全身性炎癥而受損，例如心臟組織、血管系統(tǒng)、腎臟、肺組織和神經(jīng)系統(tǒng)等，因此RA 的早診斷、早治療尤為重要。

RA 的臨床特征還在于患者血清中存在特異性自身抗體，這些抗體在臨床常規(guī)中用作疾病診斷的生物標(biāo)志物。類風(fēng)濕因子（RF）是臨床上用來(lái)輔助診斷類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的一個(gè)經(jīng)典指標(biāo)，其可結(jié)合免疫球蛋白G(immunoglobulin G，IgG)的Fc 區(qū)，形成有助于疾病過程的免疫復(fù)合物，其水平升高與持續(xù)活躍的滑膜炎、關(guān)節(jié)損傷、關(guān)節(jié)炎和殘疾密切相關(guān)[14]。但RF 對(duì)已確診RA 的特異度僅在60%～70%之間。CCP 抗體是早期診斷RA 的特異性指標(biāo)，臨床敏感度67%～80%，特異度大于96%，與RF 的診斷敏感度相當(dāng)，但特異度更高[15]。近年來(lái)，有研究發(fā)現(xiàn)，抗CCP 抗體陽(yáng)性的RA 患者的骨破壞比陰性患者更嚴(yán)重，抗CCP 抗體的含量與RA 的病情嚴(yán)重程度及發(fā)展有關(guān)[16]。抗原多肽通過體內(nèi)抗原遞呈細(xì)胞的表達(dá)激活 T 淋巴細(xì)胞，釋放免疫球蛋白、趨化因子和自由基等炎癥介質(zhì)，從而引發(fā) RA 的特征性病理變化[17]。CD4+T 細(xì)胞通過分泌促炎細(xì)胞因子在 RA中發(fā)揮重要作用，可促進(jìn)RA 炎癥反應(yīng)的持續(xù)存在。此外，T 細(xì)胞頻率已被證明可受疾病持續(xù)時(shí)間和治療的影響，這表明 T 細(xì)胞數(shù)量和功能的變化可反映整個(gè)疾病過程的變化[18]。研究發(fā)現(xiàn)[19]，環(huán)瓜氨酸化蛋白與淋巴細(xì)胞人類白細(xì)胞抗原-DR(HLA-DR)分子結(jié)合，通過T 細(xì)胞的抗原遞呈功能，進(jìn)一步刺激RA 患者的T 細(xì)胞增殖，環(huán)瓜氨酸化蛋白是RA病理過程中的致病靶抗原，其可特異性刺激CCP/AST 的克隆增殖，并與患者病情嚴(yán)重程度有關(guān)。本研究結(jié)果顯示，輕度組、中度組和重度組患者關(guān)節(jié)滑液中CCP/AST 表達(dá)較對(duì)照組升高，且隨病情嚴(yán)重程度增加而升高，由此可見CD4+T 細(xì)胞參與了RA 的發(fā)生發(fā)展，其中CD4+T 亞群的失衡及其相關(guān)信號(hào)分子的紊亂在RA 的發(fā)生、發(fā)展中起著重要作用，基于CD4+T 細(xì)胞亞群平衡的免疫調(diào)節(jié)手段有望成為治療RA 的新策略。

本研究還發(fā)現(xiàn)，關(guān)節(jié)滑液、滑膜組織中CCP/AST 表達(dá)與RF 和ACPA 蛋白水平間存在正相關(guān)。且Logistic 回歸分析結(jié)果顯示，關(guān)節(jié)滑液、滑膜組織中CCP/AST 頻率均是RA 發(fā)生的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。由此可見，RA 患者血液和滑膜組織中CD4+T 細(xì)胞被瓜氨酸自身抗原刺激后逐漸激活擴(kuò)增，進(jìn)一步表達(dá)促炎和細(xì)胞溶解介質(zhì)，殺傷靶細(xì)胞，最后導(dǎo)致關(guān)節(jié)組織破壞，加重疾病。這進(jìn)一步證實(shí)了風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者外周血、關(guān)節(jié)滑液及滑膜組織中CCP/AST檢測(cè)具備較好的臨床診斷價(jià)值，并且可以用于預(yù)估病情的預(yù)后。

綜上所述，RA 患者關(guān)節(jié)滑液及滑膜組織中CCP/AST 呈現(xiàn)高表達(dá)，且與疾病活動(dòng)度及關(guān)節(jié)破壞有關(guān)，可用于評(píng)估此類患者臨床關(guān)節(jié)活動(dòng)度及骨破壞程度。本研究的局限性在于：未收集有關(guān)患者治療和就診時(shí)疾病持續(xù)時(shí)間、疾病活動(dòng)性或樣本提取時(shí)可能的關(guān)節(jié)外表現(xiàn)的信息，使得研究結(jié)果可能存在偏倚，后續(xù)研究中需要進(jìn)一步擴(kuò)大納入指標(biāo)及研究范圍，以此證實(shí)研究結(jié)果的真實(shí)性。