不同果型西瓜單倍體誘導技術優化

戴玉娟 龔詩琦 孫翔宇 陳浩杰 熊程 孫小武 戴思慧

摘? ? 要：西瓜未受精子房離體培養是誘導單倍體的有效方法，可縮短育種時間。為建立高效穩定的單倍體誘導體系，提高單倍體誘導率，以大果型品種雪龍1號、雪龍3號，中果型品種早蜜、紅都2號和小果型品種小玉9號和黃小玉的6個雜交一代（2n=2x=22）西瓜的未受精子房為試驗材料，研究不同植物生長調節劑種類和質量濃度對西瓜單倍體誘導率的影響。結果表明，6個不同基因型品種在2 mg·L-1 6-BA+1 mg·L-1 NAA和2 mg·L-1 6-BA+2 mg·L-1 NAA的誘導培養基中均能誘導出胚狀體，除黃小玉以外，均獲得了單倍體再生植株；其中，紅都2號的胚狀體誘導率最高，達63.89%；其次是早蜜，誘導率為55.56%。

關鍵詞：西瓜；植物生長調節劑；單倍體誘導

中圖分類號：S651 文獻標志碼：A 文章編號：1673-2871（2024）01-018-07

Optimisation of haploid induction techniques in watermelon with different fruit types

DAI Yujuan， GONG Shiqi， SUN Xiangyu， CHEN Haojie， XIONG Cheng， SUN Xiaowu， DAI Sihui

（Engineering Research Center for Horticultural Crop Germplasm Creation and New Variety Breeding， Ministry of Education/College of Horticulture， Hunan Agricultural University ， Changsha 410128， Hunan， China）

Abstract： Unfertilized ovary culture of watermelon is an effective method to induce haploids， which can shorten the breeding time. In order to establish an efficient and stable haploid induction system and improve the haploid induction rate， the unfertilized ovaries of six watermelon hybrids（2n=2x=22）of large-fruited variety Xuelong 1 and Xuelong 3， medium-fruited variety Zaomi， Hongdu 2， and small-fruited variety Xiaoyu 9， Huangxiaoyu were used as experimental materials. The effects of different plant growth regulators on the haploid induction rate of watermelon were studied . The results showed that six different genotypes of watermelon were induced in the induction medium 2 mg·L-1 6-BA+1 mg·L-1 NAA， 2 mg·L-1 6-BA + 2 mg·L-1 NAA， and haploid regeneration plants were obtained except for Huangxiaoyu. Among them， Hongdu 2 had the highest induction rate of 63.89%， followed by Zaomi with an induction rate of 55.56%.

Key words： Watermelon; Plant growth regulator; Haploid induction

西瓜（Citrullus lanatus）是中國重要的園藝作物，也是夏季主要的消暑果品之一，在全世界廣泛種植。傳統的西瓜育種周期長，很難產生突破性品種，獲得純合自交系需要6代以上，而雙單倍體育種只需要2代。利用單倍體技術還能迅速獲得個體完全純合的雙單倍體群體，為遺傳分析、分子標記和數量性狀分析提供理想材料。但西瓜單倍體的自然發生率低[1]，雌核離體培養是一個有效的途徑。

目前單倍體誘導技術已在黃瓜[2-3]、南瓜[4-5]、大蔥[6]、洋蔥[7]等蔬菜作物上廣泛應用，在西瓜[8-13]上的應用也有報道，并已建立完整的誘導體系。Zou等[9]以中果型西瓜品種早佳為供體，通過雌核發育途徑獲得了西瓜單倍體植株，胚狀體誘導率最高為20.67%，并選取了50株再生植株進行倍性鑒定，單倍體率為96%，二倍體率為4%，未發現四倍體與嵌合體。龔思等[10]以中果型西瓜早佳的未受精子房為試材，對影響西瓜未受精子房離體培養的條件進行了研究，發現單倍體胚狀體誘導率為21.33%；其中單倍體率97%、二倍體率3%，這與Zou等[9]在西瓜單倍體培養試驗中再生植株的倍性鑒定結果基本一致。李玲等[11]以大果型西瓜品種西農9號和小果型西瓜品種早春紅玉、小綠黃為供體，芽點誘導率最高為17.2%，僅早春紅玉獲得了再生植株。李迎迎[12]以3個大果型和1個特大果型西瓜品種為試材，胚狀體誘導率最高僅1.67%，且未獲得單倍體再生植株。目前未見到以大、中、小3種果型在相同植物生長調節劑配方中均能誘導出單倍體植株的報道，且西瓜未受精子房誘導單倍體的研究所采用的主要材料大多為單一果型品種，雖已獲得再生單倍體植株，但誘導率仍然較低[8-13]。

針對上述問題，筆者以6個不同基因型的大、中、小果型西瓜品種為試材，研究不同植物生長調節劑種類和質量濃度對西瓜單倍體誘導率的影響，并對獲得的再生植株進行了倍性鑒定，以期篩選到能夠誘導大、中、小3種果型的誘導培養基，建立高效穩定的西瓜單倍體誘導體系，為西瓜單倍體育種提供技術支持。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗材料包括大果型西瓜品種雪龍1號、雪龍3號，中果型西瓜品種早蜜、紅都2號和小果型西瓜品種小玉9號、黃小玉，品種均為雜交一代材料（2n=2x=22），由湖南雪峰種業責任有限公司提供，材料特點見表1和圖1。試驗于2022年3月至2023年6月在湖南農業大學園藝學院實驗室及金山基地進行。

1.2 方法

1.2.1 未受精子房離體培養與植株再生 參照Zou等[9]的方法進行子房處理。在第2朵雌花開放后采收子房，開花前一天17：00套袋，開花當天08：00前取回，取回的材料立即處理或放在4 ℃冰箱保存。首先去掉子房的花蕾和花莖，并沖洗干凈表面的絨毛；然后用75%的乙醇消毒1 min、蒸餾水沖洗3次后，將子房去皮，切成1 mm左右的切片；再用1%的次氯酸鈉溶液消毒1 min，蒸餾水沖洗4次；最后將切片放在無菌濾紙上吸干水分，接種至誘導培養基中培養。將中果型早蜜的子房切片接種到M1～M10誘導培養基上，研究不同培養基配方對早蜜胚狀體誘導率的影響。將6個不同基因型的子房切片接種到M1、M7、M8、M9、M10等5個誘導培養基上，研究不同基因型對胚狀體誘導率的影響。每個處理接種3瓶并設置3次重復，每瓶接種20片。

前4 d將接種后的培養瓶放在33 ℃的黑暗環境下進行熱激處理，第5 天轉至培養室中培養，溫度為25 ℃，光周期為16 h/8 h（光/暗）。經過14 d的誘導培養，將子房切片轉至分化培養基中，大約35 d誘導出胚狀體，胚狀體誘導率/%=出胚數/接種片數×100。最后將有明顯形態學上端和下端的胚狀體轉至MS培養基中，直至生長成完整的再生植株。再生植株率/%=完整再生植株數/出胚數×100。

單倍體誘導過程中的具體培養基配方見表2。

1.2.2 流式細胞儀檢測 用刀片取0.5 cm2的再生植株幼葉，置于培養皿中，取400 μL Partec CyStain UV Precise P裂解沖液涂在葉片周圍，用刀片將葉片切碎，充分提取出完整的細胞核，提取時間約為10 s，隨后用后30 μm濾網過濾至樣品管中，再用1600 μL的Partec CyStain UV Precise P染液染色10 s，最后用Partec CyFlow Space檢測懸浮液的核DNA相對含量。樣本峰值的熒光強度X-Mean（橫坐標）與細胞DNA含量成正比，所以由各樣本X-Mean之間的比例關系判斷倍性。用二倍體（2n=2x=22）的西瓜植株為參考標準，將對照的二倍體峰調整在橫坐標100位置，則單倍體峰值會出現在50，而峰值在200位置的則為四倍體。圖形的縱坐標代表細胞數量，峰的高低反映了細胞比例的不同。

1.3 數據處理

采用SPSS 26.0與Excel 2019軟件進行試驗數據處理和統計分析。

2 結果與分析

2.1 胚狀體發育及誘導成苗過程

子房切片在33 ℃的黑暗環境下熱激4 d后，胚珠明顯膨大（圖2-a），再經過5 d的光照培養，膨大的胚珠變綠（圖2-b）。培養35 d左右，胚狀體長出明顯的形態學上端和下端（圖2-c）時轉接至MS生根培養基中，生長成完整的再生植株（圖2-d）。

2.2 不同培養基配方對早蜜胚狀體誘導率的影響

由表3可知，早蜜在不同培養基配方中胚狀體誘導率由高到低依次為M9>M10>M1>M7>M8>M2>M3、M4>M5、M6，其中M9配方胚狀體誘導率最高，達49.44%，與其余9個配方呈顯著差異；選用5個誘導效果較好的培養基配方進行下一步試驗，即M1、M7、M8、M9、M10。

2.3 不同基因型對西瓜未受精子房胚狀體誘導率的影響

由表4可知，所選用的6個不同基因型材料都能誘導出胚狀體，但不同基因型之間的胚狀體誘導率存在較大差異，在0～63.89%之間。大果型雪龍1號和雪龍3號胚狀體誘導率最高分別為6.11%和8.89%；中果型紅都2號和早蜜的誘導率最高分別為63.89%和55.56%；小果型小玉9號和黃小玉的胚狀體誘導率最高分別為1.11%和2.22%。整體來看，中果型品種胚狀體誘導率較高，其次是大果型品種，小果型品種的誘導率最低，其中黃小玉僅在M9和M10培養基上成功誘導出胚狀體。

2.4 不同植物生長調節劑配方對西瓜未受精子房胚狀體誘導率的影響

由表4可知，5種誘導培養基均能誘導出胚狀體，其中M9和M10能誘導出大、中、小3種果型的胚狀體，但胚狀體誘導率差異大。大果型品種雪龍1號在M10中胚狀體誘導率最高（6.11%），雪龍3號在M9中胚狀體誘導率最高（8.89%），但均與其他誘導培養基之間無顯著差異。中果型品種紅都2號在M10中胚狀體誘導率最高，達63.89%，M9中誘導率為43.80%，均與M1、M7、M8培養基呈顯著差異；中果型品種早蜜在M9中胚狀體誘導率最高，達55.56%，M10中胚狀體誘導率為35.56%，均與其他誘導培養基呈顯著差異。小果型品種小玉9號、黃小玉在M9中的胚狀體誘導率分別為1.11%和2.22%，均與其他誘導培養基無顯著差異。

2.5 胚狀體成苗情況

通過對胚狀體后期生長狀況的觀察與記錄，發現部分發育不完全的胚狀體（圖3），包括無生長點植株、黃化苗、玻璃化植株和生長緩慢植株4種類型。共成功誘導胚狀體517個，產生完整再生植株233株，再生植株率為45.07%，見表5。整體來看，2個中果型品種在5個再生培養基上均能獲得完整的再生植株，再生植株率較高，其中早蜜的再生植株率在36.36%～52.00%，紅都2號的再生植株率在11.11%～60.00%；大果型和小果型品種雖有一定的再生植株率，但本身出胚數較少，再生植株率沒有統計學上的意義。

2.6 流式細胞儀倍性鑒定

對得到的233株再生植株，利用流式細胞儀對其中的50株進行倍性鑒定（圖4）。結果表明，47株為單倍體，3株為二倍體，單倍體率為94%。

3 討論與結論

基因型已被證明是許多植物未受精子房離體培養的關鍵因素，如黃瓜[14-17]、南瓜[5、18]、西葫蘆[19-21]等。在西瓜中，也有研究表明，基因型是影響雌核發育的關鍵[10-12]，不同基因型的西瓜胚狀體誘導率在1.67%～21.33%。在本研究中，筆者所選用的6個不同的基因型都誘導出了胚狀體，但不同基因型之間的胚狀體誘導率差異較大。在M9誘導培養基中，大果型西瓜品種雪龍1號和雪龍3號的誘導率分別為4.44%和8.89%，雪龍3號的誘導率是雪龍1號的2倍；中果型西瓜品種早蜜的誘導率最高（55.56%），紅都2號次之（43.80%），早蜜的誘導率比紅都2號高11.76個百分點；但小果型品種小玉9號和黃小玉的誘導率均偏低，分別為1.11%和2.22%。由此可見，中果型西瓜品種的胚狀體誘導率均比大果型和小果型高，不同基因型的胚狀體誘導率存在顯著差異，也進一步說明基因型是影響西瓜未受精子房培養誘導胚狀體的關鍵因素，與前人的研究結果一致。龔思等[10]以中果型西瓜早佳未受精子房為試材，對西瓜未受精子房的胚狀體誘導率進行了研究，最高胚狀體誘導率為21.33%；而本研究中紅都2號的胚狀體誘導率最高為63.89%，是早佳的3倍。

前人研究結果表明，不同誘導培養基的胚狀體誘導率差異顯著，植物生長調節劑在胚狀體誘導中發揮了重要作用[9-10，22-23]。Zou等[9]在西瓜未受精子房培養中選用中果型西瓜品種早佳和黑媚娘，在MS+3 mg·L-1 2， 4-D+2 mg·L-1 6-BA+0.5 mg·L-1 NAA誘導培養基中培養，早佳的胚狀體誘導率最高，為20.67%，黑媚娘的誘導率為14.72%，而在MS+3 mg·L-1 2，4-D+1 mg·L-1 6-BA+0.5 mg·L-1 NAA中，早佳和黑媚娘胚狀體誘導率僅為1.67%和6.94%，說明不同植物生長調節劑的添加量是重要因素。在筆者的研究中，M9（MS+2 mg·L-1 6-BA+1 mg·L-1 NAA）和M10（MS+2 mg·L-1 6-BA+2 mg·L-1 NAA）是西瓜未受精子房誘導單倍體的最佳誘導培養基，6個不同基因型的西瓜品種在M9和M10誘導培養基中都能誘導出胚狀體，當使用不同的誘導培養基時，胚狀體誘導率有顯著差異。以中果型為例，紅都2號在M10誘導培養基中胚狀體誘導率最高，達63.89%，誘導率是M1的10倍；而早蜜在M9誘導培養基中效果最好（55.56%）。本研究中，紅都2號在M7（MS+1 mg·L-1 2，4-D+2 mg·L-1 6-BA+1 mg·L-1 NAA）誘導培養基的培養下，胚狀體誘導率僅為6.67%，可能是添加了2，4-D的原因，這與榮文娟等[13]在未受精胚珠培養萌發的研究結果一致，認為2，4-D能有效促進愈傷組織生長，但得到的愈傷組織難以分化。

在筆者的研究中，共獲得了233株再生植株，這是西瓜單倍體育種的一個很大突破。筆者利用流式細胞儀對50株再生植株進行倍性鑒定，結果表明，47株為單倍體，3株為二倍體，單倍體率為94%。在研究過程中，盡管篩選到了能夠誘導大、中、小果型胚狀體的培養基，但大果型和小果型品種的胚狀體誘導率和再生植株率偏低，可能與基因型、誘導培養基所添加的植物生長調節劑的種類和濃度有關，且小果型品種黃小玉未獲得再生單倍體植株。下一步，筆者一方面將調整植物生長調節劑的種類和濃度，以提高大、小果型品種的胚狀體誘導率；另一方面，根據流式細胞儀倍性鑒定的結果，筆者將利用化學藥劑（秋水仙素、氨磺樂靈等）對獲得的西瓜單倍體再生植株進行染色體加倍，以獲得雙單倍體植株。

綜上所述，筆者篩選到了適合大、中、小果型的西瓜單倍體誘導培養基，提高了西瓜單倍體誘導率，并獲得了除黃小玉外的單倍體再生植株。研究結果對提高西瓜育種效率具有重要意義，有助于推進西瓜育種發展，為西瓜單倍體育種提供技術支持。

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