不同誘導劑和誘導方法對西瓜單倍體染色體加倍效果的比較研究

李海倫 高寧寧 李曉慧 康利允 常高正 王琰 王慧穎 趙衛星

摘? ? 要：為探究不同誘導劑和誘導方法對西瓜單倍體染色體加倍的效果，以西瓜花藥離體培養獲得的單倍體植株為材料，利用不同質量濃度的秋水仙素和氟樂靈進行培養基加倍、浸芽加倍、滴生長點加倍3種方法研究單倍體植株誘導二倍體植株的效果。結果表明，不同加倍方法對單倍體加倍的誘導率存在很大差異。秋水仙素誘導加倍，植株的存活率均達到100%，氟樂靈誘導加倍，加倍植株的致死率最高達到100%。組培法誘導加倍時，秋水仙素和氟樂靈均在質量濃度為60 mg·L-1時，加倍誘導率最高，分別是50.00%和41.67%。浸芽法誘導加倍時，600 mg·L-1秋水仙素浸芽4 h加倍誘導率最高為75.00%；300 mg·L-1氟樂靈浸芽2 h加倍誘導率最高為50.00%。滴生長點誘導加倍時，600 mg·L-1秋水仙素誘導的加倍率最高為50.00%；500 mg·L-1氟樂靈誘導加倍率最高為27.78%。因此，秋水仙素誘導西瓜單倍體植株加倍效果優于氟樂靈，且浸芽法誘導加倍效果最佳。

關鍵詞：西瓜；單倍體；秋水仙素；氟樂靈；染色體加倍

中圖分類號：S651 文獻標志碼：A 文章編號：1673-2871（2024）01-025-07

Comparative study on chromosome doubling effect of watermelon haploid with different inducers and induction methods

LI Hailun， GAO Ningning， LI Xiaohui， KANG Liyun， CHANG Gaozheng， WANG Yan， WANG Huiying， ZHAO Weixing

（Institute of Horticulture， Henan Academy of Agricultural Sciences， Zhengzhou 450002， Henan， China）

Asbtract： In order to investigate the effect of different inducers and induction methods on chromosome doubling of watermelon haploid， the haploid plants obtained from watermelon anther culture in vitro were used as materials. Different concentrations of colchicine and fluralin were used to study the effect of inducing diploid plants from haploid plants by three methods： medium doubling method， germination doubling method and droplet growing point doubling method. The results showed that the induction rate of haploid doubling by different doubling methods varied. The survival rate of plants induced by colchicine doubling reached 100%， and the mortality rate of plants induced by fluralin doubling reached 100%. When induced by tissue culture， the doubling induction rates of colchicine and trifluralin were the highest at a mass concentration of 60 mg·L-1， with 50.00% and 41.67%， respectively. When inducing doubling by soaking the buds with 600 mg·L-1 colchicine for 4 hours， the highest doubling induction rate was 75.00%; the highest doubling induction rate of 300 mg·L-1 fluralin soaking buds for 2 hours was 50.00%. When inducing doubling at the droplet growth point， the highest doubling rate induced by 600 mg·L-1 colchicine was 50.00%; the highest induction doubling rate of 500 mg·L-1 trifluralin was 27.78%. Therefore， the effect of inducing haploid watermelon plants to double with colchicine is better than that with trifluralin， and the soaking method has the best effect on inducing doubling.

Key words： Watermelon; Haploid; Colchicine; Fluralin; Chromosome doubling

西瓜是世界十大水果之一，具有甘甜多汁、清爽解渴的特點，夏季廣受消費者的喜愛，使其市場需求量大大增加。西瓜栽培周期短、上市快且經濟效益高，已經成為廣大農民致富的重要產業[1]。目前優異西瓜品種更新滯后，加上西瓜遺傳基礎狹窄，常規育種周期長，現有品種已不能滿足市場需求，所以擴寬西瓜遺傳基礎，發掘優異種質，提高西瓜品種改良效率是西瓜育種的首要任務。單倍體育種是一條縮短育種年限、加快育種進程的有效途徑。花粉輻射[2]、花藥培養[3-4]、大孢子培養[5-6]等都是較為常用的單倍體誘導技術。從20世紀80年代初期起，薛光榮等[7-8]、袁萬良等[9]、魏瑛[10]、李娟等[11]、緱艷霞等[12]、朱迎春等[13]研究者就不斷地探究西瓜花藥離體培養技術，且獲得了單倍體植株。單倍體植株需要通過加倍才能用于育種材料和新種質的創制，常用的誘導單倍體加倍的方法有浸芽、浸種、浸根、浸苗、滴生長點和組培法等[14-18]，常采用的誘導劑有秋水仙素、氟樂靈、炔苯酰草胺和氨磺靈等，及輔助添加劑二甲基亞砜（DMSO）、吐溫等，有助于提高加倍效率。高寧寧等[14]研究表明，輔助添加劑DMSO可以提高甜瓜單倍體的加倍率。適量的誘導劑配合適宜的加倍方法，將有效地提高加倍率。玉米[19]、黃瓜[20]、蘿卜[21]、南瓜[22]等作物在不同誘導劑和不同方法的誘導下，均得到很好的加倍效果。目前對西瓜單倍體加倍技術的研究較少，還未見成熟的西瓜單倍體加倍技術的報道。筆者總結了前人研究成功的經驗，利用秋水仙素和氟樂靈誘導劑，采用組培法、浸芽法、滴生長點法3種方法對利用西瓜花藥離體培養獲得的單倍體植株進行加倍，以期建立高效的西瓜單倍體加倍體系，以便快速、高效地獲得純合的自交系優異種質材料，縮短育種年限，加快西瓜優異新品種的選育進程。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗材料為小果型西瓜斯維特。試驗于2022年5—9月在河南省農業科學院園藝研究所組培分子實驗室進行，利用西瓜花藥離體培養獲得的單倍體植株進行擴繁，然后挑選長勢一致的擴繁苗來研究不同誘導劑對西瓜單倍體植株加倍的效果。試驗材料由河南省農業科學院園藝研究所西甜瓜研究室提供。

1.2 方法

1.2.1 西瓜單倍體植株擴繁 把西瓜花藥離體培養獲得的單倍體植株接入芽增殖培養基MS+0.15 mg·L-1KT+10%椰汁+30 g·L-1蔗糖+6 g·L-1瓊脂（pH 5.80～5.85）中，放入每天光照時間16 h、光照度3000～4000 lx、溫度在（25±2） ℃的培養間中進行增殖擴繁培養，用于快速獲得大量的單倍體植株，為研究不同誘導劑對西瓜單倍體加倍的效果提供充足的試驗材料。

1.2.2 培養基添加法誘導 以培養基MS+0.15 mg·L-1 KT +10%椰汁為基礎培養基，在基礎培養基中分別添加不同質量濃度的秋水仙素（0、40、60、80、100 mg·L-1）和不同質量濃度的氟樂靈（0、40、60、80、100 mg·L-1）配制成加倍培養基，然后將擴繁的單倍體植株接入加倍培養基中，再在上述培養條件下培養21 d，之后轉接到基礎培養基中做植株的倍性鑒定。試驗共9個處理，每個處理接入4株西瓜單倍體植株，每個處理3次重復，并統計加倍植株存活率。加倍植株存活率/%=成活植株數/處理植株數×100。

1.2.3 浸芽法誘導 先配制不同質量濃度的秋水仙素（0、200、400、600、800 mg·L-1）和不同質量濃度的氟樂靈（0、100、300、500、700 mg·L-1），均以1.5%的DMSO（二甲基亞砜）作為助溶劑，然后過濾滅菌，再將單倍體植株分別在不同質量濃度的秋水仙素中浸泡2、4、6 h和在不同質量濃度的氟樂靈中浸泡2、3、4 h，以1.5%的DMSO浸芽6 h和4 h分別作為秋水仙素和氟樂靈浸芽的對照，浸芽結束后，用無菌水沖洗3遍，每遍1 min，最后控干水分，接入基礎培養基中（MS+0.15 mg·L-1 KT +10%椰汁），在上述培養條件中培養21 d。試驗共30個處理，每個處理接入4株西瓜單倍體植株，每個處理3次重復，并統計加倍植株存活率。

1.2.4 滴生長點法誘導 用1.5%的DMSO（二甲基亞砜）配制無菌的不同質量濃度的秋水仙素（200、400、600、800 mg·L-1）和不同質量濃度的氟樂靈（100、300、500、700 mg·L-1），然后分別滴加2滴到西瓜單倍體植株的生長點，在1、3、5 d各滴加1次，以滴加1.5%的DMSO作為對照，在上述培養條件中培養28 d。試驗共9個處理，每個處理4株植株，每個處理3次重復，并統計加倍植株的存活率。

1.3 植株倍性鑒定

取待測植株最新長出的嫩葉約0.2 g，用細胞裂解液與細胞染色液以體積比1∶4制作細胞懸浮液，用德國PARTEC公司的CyFlowRCube8流式細胞儀上機檢測植株的倍性，以斯維特種子苗為參照。統計植株的加倍率，加倍率/%=加倍植株數/處理存活植株數×100。

1.4 數據處理

采用Excel 2016進行數據統計分析，采用SPSS 21進行方差分析，采用Duncan檢驗法進行多重比較，采用FCS Express V3對流式細胞儀數據進行作圖。

2 結果與分析

2.1 植株倍性鑒定

西瓜花藥離體培養獲得的單倍體植株通過秋水仙素和氟樂靈誘導加倍，將獲得加倍的存活植株進行流式細胞儀倍性鑒定分析，鑒定結果如圖1所示，以單倍體植株首個呈正態分布的最高峰的熒光強度100為對照，對誘導加倍存活的植株進行鑒定，共得到二倍體和混倍體2種倍性植株。

2.2 培養基添加法對染色體加倍效果的影響

將西瓜花藥離體培養誘導的單倍體植株進行增殖培養，把獲得的單倍體植株接種到含有不同質量濃度的秋水仙素或氟樂靈的培養基中誘導加倍，鑒定的加倍效果如表1所示。

利用秋水仙素作為誘導劑時，植株的存活率達到100%，生長良好（圖2-A），隨著秋水仙素質量濃度的增加，二倍體的加倍率呈倒“V”形，先增后降，混倍體的加倍率呈線性增加。當秋水仙素質量濃度為60 mg·L-1時，二倍體加倍率達到最大值50.00%；當質量濃度為100 mg·L-1時，混倍體加倍率最高達到58.33%。利用氟樂靈作為誘導劑時，植株的存活率隨著氟樂靈質量濃度的增加而降低，長勢較弱（圖2-B），當氟樂靈質量濃度為100 mg·L-1時，植株存活率降至75.00%，二倍體和混倍體加倍率的變化趨勢與秋水仙素加倍效果一致，二倍體和混倍體最高加倍率的質量濃度與秋水仙素一樣，其最高加倍率分別為41.67%和44.44%。試驗結果表明，秋水仙素的加倍效果優于氟樂靈，加倍植株的致死率為0，而氟樂靈加倍植株的致死率最高達到25.00%，而且二倍體最高加倍率高出氟樂靈8.33個百分點，所以質量濃度為60 mg·L-1的秋水仙素作為最佳誘導加倍濃度，同時還發現在不添加誘導劑時，二倍體的加倍率也能達到8.33%。

2.3 浸芽法對染色體加倍效果的影響

利用不同質量濃度的秋水仙素或氟樂靈對獲得的西瓜單倍體芽進行浸芽處理，經流式細胞儀鑒定植株倍性的結果如表2和表3所示，植株的長勢如圖3所示。秋水仙素誘導二倍體的最高比例（75.00%）高于氟樂靈誘導的最高比例（50.00%）。利用秋水仙素誘導加倍，植株的存活率均達到100.00%，而氟樂靈誘導加倍時植株的致死率最高達100.00%，表明氟樂靈對植株有一定的毒害作用。

由表2可知，當秋水仙素浸芽2 h時，二倍體的加倍率隨著秋水仙素質量濃度的增加呈先降低后升高的變化趨勢，最高加倍率為58.33%，其中400 mg·L-1秋水仙素浸芽處理未得到二倍體，其混倍體比例高達75.00%；浸芽4 h時，600 mg·L-1秋水仙素浸芽處理二倍體加倍率最高為75.00%；浸芽6 h時，二倍體加倍率與秋水仙素質量濃度的增加呈反比，200～800 mg·L-1秋水仙素浸芽處理使二倍體加倍率由50.00%降至33.34%。

由表3可知，當氟樂靈質量濃度為100 mg·L-1時，二倍體加倍率隨著浸芽時間的增加呈現出先升高后降低的變化趨勢，浸芽3 h時二倍體加倍率達到最大值50.00%；當質量濃度為300 mg·L-1時，二倍體加倍率與時間的增加呈反比，浸芽2 h時二倍體加倍率最高，為50.00%；當質量濃度為500 mg·L-1時，浸芽2 h時沒有獲得二倍體，只得到72.22%混倍體；當質量濃度為700 mg·L-1時，只有浸芽2 h的處理有存活植株，得到二倍體加倍率為33.33%。

同時發現在1.5%的DMSO溶液中浸芽6 h也能得到16.67%二倍體，植株的加倍率得到提高，表明DMSO輔助劑對植株加倍具有一定的促進作用。綜合植株存活率和加倍率分析可知，秋水仙素誘導加倍效果好于氟樂靈，最佳誘導方法為600 mg·L-1的秋水仙素浸芽4 h。

2.4 滴生長點法對染色體加倍效果的影響

利用不同質量濃度的秋水仙素和氟樂靈對西瓜單倍體植株的生長點滴加誘導劑進行加倍，通過流式細胞儀鑒定的結果如表4所示，加倍植株的生長情況如圖4所示。二倍體的最高加倍率只有50.00%，由600 mg·L-1的秋水仙素處理所得。利用秋水仙素誘導液加倍時，植株的存活率都達到了100.00%，而500 mg·L-1的氟樂靈處理時植株的存活率只有58.33%，700 mg·L-1的氟樂靈處理時植株的存活率為0，說明氟樂靈對植株的毒害作用較大。隨著秋水仙素質量濃度的增加，二倍體加倍率呈先升高后降低的變化趨勢，600 mg·L-1時達到最大值，為50.00%；混倍體一直保持遞增的變化趨勢，800 mg·L-1時達到最大值，為58.33%。隨著氟樂靈質量濃度的增加，二倍體和混倍體加倍率均呈先升高后降低的變化趨勢，但二倍體的加倍率低于秋水仙素處理，最高加倍率只有27.78%，500 mg·L-1時混倍體的加倍率最高，達到61.11%。試驗結果表明，滴生長點加倍的最佳方案為600 mg·L-1秋水仙素。

3 討論與結論

多倍體誘導時常用的誘導劑主要有秋水仙素、除草劑類物質（氟樂靈）、植物激素（激動素）等化學誘變劑，這些誘導劑對處在分裂旺盛期的細胞都具有一定的影響，能抑制細胞有絲分裂，從而使染色體加倍，同時添加DMSO等輔助劑，將會有效地提高植株加倍率。其中秋水仙素是典型的誘導劑，在蘋果[23]、黃瓜[20]、非洲菊[24]等很多種作物上都取得了一定成果，而氟樂靈作為誘導劑的使用范圍相對狹隘。筆者利用秋水仙素和氟樂靈2種化學誘變劑對單倍體西瓜進行誘導加倍，結果表明，秋水仙素誘導加倍的植株存活率均達到100.00%，且長勢良好；氟樂靈誘導的加倍植株致死率最高達到100.00%，且呈現出一種病態的長勢。秋水仙素誘導二倍體的最高加倍率為75.00%，高于氟樂靈誘導二倍體的最高加倍率50.00%。李麗[25]在誘導萱草多倍體的研究中，發現秋水仙素和氟樂靈的誘導率沒有明顯區別，而褚麗紅等[26]對安祖花的研究結果表明，氟樂靈的誘導效果好于秋水仙素，可能與不同的植物對不同誘導劑的敏感程度存在差異有關，但具體原因還有待進一步研究。筆者還發現在不添加任何誘導加倍劑的條件下，在含有激素KT、椰汁等基礎培養基中誘導也能得到8.33%的二倍體，在通過1.5%DMSO處理后再接入基礎培養基誘導，二倍體的誘導率能達到16.67%，說明KT具有一定的加倍功效，DMSO具有輔助提高植株加倍率的功能，朱惠琴[27]在煙草上的研究也表明DMSO對加倍具有促進作用。

多倍體誘導的效果與誘導方法有著直接的關系。常用的有浸芽、浸種、浸根、浸苗、滴生長點和組培法等多種誘導方法。筆者利用不同質量濃度的秋水仙素和氟樂靈2種誘導劑通過不同的誘導方法，誘導的二倍體加倍率在0～75.00%。在培養基添加法誘導加倍過程中，二倍體的加倍率隨著2種誘變劑質量濃度的增加均表現先升高后降低的變化趨勢，均在60 mg·L-1時達到最大值，分別為50.00%、41.67%，均高于高寧寧等[14]的培養基添加法（37%）。浸芽法誘導加倍時，600 mg·L-1秋水仙素浸芽4 h時達到二倍體最高加倍率75.00%，300 mg·L-1氟樂靈浸芽2 h得到最高二倍體加倍率50.00%。從最佳誘導效果上來看，秋水仙素在質量濃度和浸芽時長上都要高于氟樂靈，而氟樂靈在植株長勢和誘變率上都低于秋水仙素，在李麗[25]的研究中秋水仙素處理時長同樣高于氟樂靈處理，但誘導率卻沒有明顯的差異，可能是不同作物的倍性與誘變劑的劑量和處理時間有關。滴生長點誘導加倍法的研究比較少，在李勤菲等[17]對蕓薹屬3種單倍體染色體加倍中有研究報道，在筆者的研究中不同質量濃度的秋水仙素滴生長點誘導二倍體加倍率均高于氟樂靈，誘導率最高為50.00%，但2種誘變劑的誘導率均高于李勤菲等[17]的17.54%的加倍率，可能是不同的作物對不同質量濃度的誘變劑的敏感程度不同。

植物染色體倍性的改變是一個復雜的生理生化變化過程，受植物基因型、誘變劑類型和外界環境條件等多種因素的影響。因此，還需要進一步利用基因工程技術探討染色體加倍的分子機制，以提高西瓜單倍體的加倍率，加快雙單倍體育種的進程。筆者通過利用培養基添加法、浸芽法和滴生長點法3種不同的加倍技術對西瓜單倍體加倍的效果進行研究，結果表明，浸芽法加倍效果最佳，秋水仙素誘導劑效果好于氟樂靈誘導劑，其二倍體誘導率和植株長勢均優于其他。600 mg·L-1秋水仙素浸芽4 h，二倍體加倍率達到最高，為75.00%。研究結果為西瓜單倍體快速獲得純合的雙單倍體提供了技術參考，同時獲得的西瓜多倍體種質豐富了育種材料，對加快育種進程、提高育種效率具有重要意義。

參考文獻

[1] 馬超，曾劍波，朱莉，等．北京西瓜產業發展40年來回顧及展望[J]．中國瓜菜，2022，35（2）：112-117．

[2] 楊紅，顧妍，張朝陽，等．輻射花粉授粉誘導西瓜單倍體[J]．江蘇農業科學，2017，45（22）：159-161．

[3] 李慧，趙林姝，古佳玉，等．小麥花藥培養體系優化及高再生力基因型的篩選[J]．植物遺傳資源學報，2022，23（3）：738-745．

[4] ALI J，NICOLAS K L C，AKTHER S，et al．Improved anther culture media for enhanced callus formation and plant regeneration in rice（Oryza sativa L．）[J]．Plants-Basel，2021，10（5）：839．

[5] SORNTIP A，POOLSAWAT O，KATIVAT C，et al．Gynogenesis and doubled haploid production from unpollinated ovary culture of cucumber（Cucumis sativus L．）[J]．Canadian Journal of Plant Science，2018，98（2）：1-29．

[6] 曹冰東，付文苑，唐兵，等．黃瓜未授粉子房離體培養條件的優化及植株再生[J]．中國瓜菜，2022，35（5）：8-16．

[7] 薛光榮，費開偉．西瓜花藥培養獲得花粉植株簡報[J]．中國果樹，1982（2）：51-52．

[8] 薛光榮，余文炎，費開偉，等．西瓜花藥離體培養獲得花粉植株[J]．植物生理學通訊，1983（4）：40-42．

[9] 袁萬良，付潤民，雷保林，等．西瓜花培試驗初報[J]．陜西農業科學，1995（1）：29-30．

[10] 魏瑛．低溫預處理對西瓜花藥愈傷組織誘導的影響[J]．甘肅農業科技，1999（9）：34-36．

[11] 李娟，張麗，李煥秀，等．西瓜花藥培養技術研究[J]．中國瓜菜，2008，21（4）：8-10．

[12] 緱艷霞，張明方．西瓜花藥離體培養影響因子研究[J]．北方園藝，2013（10）：117-120．

[13] 朱迎春，劉君璞，鄧云，等．不同因素對西瓜花藥愈傷組織誘導的影響[J]．河南農業科學，2015，44（12）：104-111．

[14] 高寧寧，李曉慧，康利允，等．單倍體甜瓜染色體加倍技術研究[J]．中國瓜菜，2021，34（6）：28-32．

[15] 成鍇，蘇曉慧，栗建枝，等．不同加倍技術加倍玉米單倍體的研究[J]．玉米科學，2019，27（4）：42-46．

[16] 魏昌松，許貴明，譚澍，等．兩種藥劑對玉米單倍體加倍效果研究[J]．農業科技通訊，2016（3）：55-58．

[17] 李勤菲，向竹清，梅家琴，等．秋水仙堿對蕓薹屬三種單倍體染色體加倍效率[J]．中國油料作物學報，2011，33（4）：409-411．

[18] 朱惠琴，張憲銀，薛慶中．開發實用的染色體加倍體系構建成煙草DH群體[J]．分子植物育種，2004，2（5）：643-648．

[19] CHAIKAM V，GOWDA M，MARTINEZ L，et al．Improving the efficiency of colchicine-based chromosomal doubling of maize haploids[J]．Plants-Basel，2020，9（4）：459．

[20] 付文苑，唐兵，鄧英，等．輻射花粉授粉誘導黃瓜單倍體及染色體加倍[J]．分子植物育種，2019，17（21）：7150-7155．

[21] LE C T，姜二花，王康，等．利用氟樂靈進行同源四倍體蘿卜種質創制研究[J]．基因組學與應用生物學，2012，31（3）：276-281.

[22] 章鵬，孫守如，陳解放，等．氟樂靈誘導南瓜染色體加倍初步研究[J]．河南農業大學學報，2011，45（1）：42-45．

[23] 張春芬，鄧舒，肖蓉，等．單倍體蘋果染色體加倍技術[J/OL]．分子植物育種，2023，1-17[2023-11-02]．https：//kns.cnki.net/kc ms/detail//46.1068.S.20230201.1546.005.html．

[24] 單芹麗，王繼華，李紳崇，等．秋水仙素對非洲菊單倍體加倍效果研究[J]．西南農業學報，2017，30（10）：2230-2234．

[25] 李麗．不同試劑離體誘導萱草多倍體的研究[D]．山西太谷：山西農業大學，2016．

[26] 儲麗紅，彭佳佳，王釗，等．氨磺靈、氟樂靈和秋水仙素誘導安祖花多倍體的研究[J]．園藝學報，2014，41（11）：2275-2280．

[27] 朱惠琴．二甲基亞砜（DMSO）對煙草單倍體植株的染色體加倍效應[J]．青海師范大學學報（自然科學版），2004（2）：54-56．