PRKCD預測肺腺癌高度轉移有效性及功能研究

韓文舉 楊長春 張鑫 曹愛萍

肺癌是全球癌癥死亡的主要原因,其高死亡率通常歸因于容易發生遠處轉移[1-3]。肺腺癌( lung adenocarcinoma,LUAD)是一種常見的肺癌類型,患者的生存預后堪憂[4-5]。盡管近年來LUAD在診斷和治療方面取得了突破,但對其轉移機制的研究仍然知之甚少[6]。免疫細胞在腫瘤微環境中起著關鍵作用,其在LUAD的進展及轉移中影響同樣不容忽視[7-9]。研究發現免疫系統的細胞群可以更好地探究免疫治療策略,如PD1/PD-L1免疫抑制信號的相互作用[10-12]。近年來,腫瘤組織RNA測序數據被廣泛應用于癌癥分析,以分析腫瘤微環境的變化。本研究通過分析癌癥基因組圖譜(The Cancer Genome Atlas ,TCGA)公共數據庫中的LUAD表達譜[13-14],構建了LUAD預后和診斷模型,篩選出PRKCD基因可能是影響LUAD患者預后和腫瘤轉移的關鍵因素。

資料與方法

一、材料

肺腺癌(LUAD)組織測序數據集從TCGA數據庫(https：//portal.gdc.Cancer.gov/)下載。正常肺上皮細胞BESA-2B和293T細胞購于碧云天公司,LUAD細胞系(A549、95D、H1975和H292)購于ATCC細胞庫。RPMI-1640培養基購于美國HyClone公司,10%胎牛血清購于美國Gibco公司,青霉素和鏈霉素購于美國Invitrogen公司。Trizol試劑購于美國Invitrogen公司。逆轉錄試劑盒RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit購于Thermo Scientific公司。2X Universal SYBR Green Fast Qpcr Mix購于abclonal公司。EcoR I 、BamH I以及T4連接酶購于美國NEB公司。慢病毒載體和包裝質粒( PSPAX2和pMD．2g)購于湖南豐暉生物公司。無內毒素質粒提取試劑盒購于北京天根生化科技公司。Transwell小室和基質膠購于Corning公司。結晶紫染液購于碧云天公司。anti-E-cadherin、anti-N-cadherin和anti-Vimentin抗體購于CST公司。anti-β-actin和辣根過氧化物酶(HRP)標記的二抗購于Abclonal公司。倒置熒光顯微鏡購自德國徠卡集團有限公司。化學發光成像儀Amersham ImageQuant 800購于美國Cytiva公司。

二、方法

1. TCGA中LUAD測序數據分析

ssGSEA算法計算并評估、量化LUAD樣本中29個功能性基因表達特征的分數[15],比較LUAD中轉移組(M1組)和未轉移組(M0組)腫瘤微環境異質性。40個Treg細胞相關的基因矩陣從MsigDB數據庫下載,R語言(4.0.2)中 glmnet軟件包進行LASSO回歸分析,從Treg細胞相關基因中篩選與預后或轉移相關的基因。Kaplan-Meier生存曲線評估數據集中不同風險組的總生存期(OS),時間依賴工作特征ROC曲線評估預后預測特征的準確性和特異性。校準曲線和DCA評估診斷模型的一致性和臨床效用。

2. 細胞培養

人正常肺上皮細胞系(BESA-2B)、工具細胞(293T)以及LUAD細胞系(A549、95D、H1975和H292)細胞經解凍復蘇后在含有10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 mg/mL鏈霉素的RPMI-1640完全培養基中培養。5% CO2恒溫培養箱中 37℃ 條件下培養2天后取對數期細胞用作實驗。

3. RNA提取和RT-qPCR檢測

采用Trizol提取各細胞總RNA, 測定RNA 的濃度和純度并均一化。每組各取1.5μg總RNA 用于逆轉錄。使用逆轉錄試劑將獲得的cDNAs用于實時定量PCR(Real-time quantitative PCR,RT-qPCR)。擴增條件： 95℃預變性30 s,隨后進入42個循環,退火 95 ℃,5 s; 延伸60 ℃,30 s。使用BLAST引物設計工具(https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast)設計和檢查引物的特異性,引物序列如下：PRKCD(正義鏈5′-AACCATGAGTTTATCGCCACC -3′; 反義鏈：5′- AGCGTTACATTGCCTGCATTT -3′);GAPDH(正義鏈5′- CTGGGCTACACTGAGCACC-3′; 反義鏈：5′-AAGTGGTCGTTGAGGGCAATG-3′)。目的基因的Ct值通過GAPDH的Ct值均一化,目的基因mRNA相對豐度值以 2-△△Ct值表示。

4. PRKCD過表達目的載體構建和鑒定

依據NCBI基因序列(PRKCD,NM_001316 327.2)設計基因干擾引物,上游引物：5′-ATTCT AGAGCTA GCGAATTCGCCACCATGGCGCCGTTCCT GCGCAT-3′,下游引物：5′-ATCCTTGCGGCCGCGGATCCTCAATCTTCCAGGAGGTGCTCGAA-3′。經PCR擴增與cDNA純化后,將載體與目的片段經EcoR Ⅰ與BamH Ⅰ雙酶切后,T4連接酶過夜連接得到pCDH-cmv-copGFP2過表達載體。將載體與解凍后的感受態細胞混勻,均勻涂布于含有 AMP 的 LB 固體培養基的篩選板上,37 ℃倒置在恒溫培養箱培養過夜。取陽性克隆抽提質粒,進行EcoR Ⅰ與BamH Ⅰ雙酶切后水平電泳鑒定PRKCD的片段位置。

5. 慢病毒包裝和穩轉細胞系篩選

構建好的pCDH-cmv-copGFP2-PRKCD過表達載體和包裝質粒,三種質粒載體分別進行高純度無內毒素抽提,質粒濃度大于 1 μg/μL。提前1 天將293T細胞按照 5.0×105個/孔的密度接種到孔板中,密度60%～70% 且細胞分布均勻。轉染前2 h給細胞換液為無血清的1640培養基。轉染6 h后觀察細胞狀態并棄去培養基換成新鮮的完全培養基。48～72 h 后收集細胞上清液,4 ℃、3 000 r/min 離心 10 min 去除細胞碎片,0.45 μm 針式濾器過濾,收集后置于4 ℃冰箱保存,用于后續感染實驗。將生長狀態良好的H1975和A549細胞計數后以1×104個/孔鋪板,24 h 后在細胞融合度為 70%～80% 時進行轉染,每孔加入 500 μL 病毒上清液與等體積的完全培養基,感染 12 h 后棄去上清液,加入完全培養基繼續培養傳代。將感染后的細胞鋪于24孔板中,待細胞匯合度達到70%左右,每孔加入終濃度為1 μg /mL的嘌呤霉素,同時未經慢病毒感染的細胞加入嘌呤霉素,條件與實驗組相同。每24 h觀察細胞狀態,直至未感染病毒的對照組細胞被嘌呤霉素全部殺死。

6. 細胞遷移和侵襲實驗

將貼壁的腫瘤細胞H1975和A549消化并收集至離心管,然后將1×105個腫瘤細胞懸浮在含1%BSA無血清培養基中,置于上室進行侵襲測定,并在沒有基質膠膜的情況下進行遷移測定。將完全培養基加入下室分別孵育12h或24h。棄去培養基并輕柔擦拭小室內壁,用4%甲醛固定小室底部的細胞并用0.1%結晶紫染色。在100倍顯微鏡下(×100)觀察遷移或侵襲的細胞。

7. 細胞劃痕實驗

將腫瘤細胞H1975和A549接種在6孔板(5×105細胞/孔)中,等到細胞匯合度達到近100%的時候,使用10uL移液器吸頭在培養皿底部劃出3條平行劃痕。然后用PBS洗滌以盡可能棄去細胞碎片,隨后置于無血清培養基中進行培養。在0h、24h和48h使用倒置熒光顯微鏡拍攝劃痕照片。

8. 免疫印跡

使用含有蛋白酶抑制劑的RIPA緩沖液來收集總蛋白。經SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離后,轉印至PVDF膜(Millipore,#IPVH00010)。等量的細胞總蛋白由十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)分離,然后轉移到PVDF膜上。轉膜后將PVDF膜置于5%脫脂奶粉中室溫封閉1h,分別置于anti-E-cadherin,anti-N-cadherin,anti-Vimentin,anti-β-actin,一級抗體4 ℃ 孵育過夜。次日與辣根過氧化物酶(HRP)標記的二抗室溫孵育60min。最后,使用化學發光HRP底物試劑盒和化學發光成像系統對蛋白條帶進行可視化。采用ImageJ 軟件進行圖像分析。

三、統計學分析

采用對數秩檢驗進行 Kaplan-Meier分析,以檢測不同組之間的生存差異。為了比較兩組,正態分布變量的統計學顯著性用獨立樣本t檢驗估計,非正態分布變量用威爾康秩和檢驗分析。采用 Benjamini-Hochberg 法調整P值。ROC 曲線分析是通過 pROC r 軟件包進行的。所有統計分析均采用 R 軟件(版本4.1.0)或 GraphPad Prism 8進行。每個實驗重復三次或更多次,所有數據以平均值±標準差表示。統計學顯著性描述如下：*P<0.05;**P≤0.01;***P≤0.001。

結 果

一、Treg細胞與肺腺癌轉移密切相關

采用ssGSEA算法量化了LUAD中的29個 功能性基因表達特征評分,并對M0組和M1組內的患者進行了分組比較。結果顯示在M0未轉移組、M1轉移組中4種細胞表達量差異具有統計學意義(P<0.05)。在轉移組中共活化因子、B 細胞、調節性T細胞以及調節性T細胞和輔助性Th2細胞轉運顯著低表達(圖1)。考慮到Treg細胞在M0組和M1組的差異,Treg細胞與LUAD的轉移存在一定的聯系。

圖1 TCGA隊列中M0組和M1組的29個免疫特征活化程度的差異分析

二、LUAD預后預測模型構建

對Treg細胞相關的基因進行LASSO回歸分析(圖2A、B),以篩選出與預后相關的關鍵基因：PRKCD、BTN2A2、IL2、CTLA4、FANCD2和IRF1,并以柱狀圖的形式對關鍵基因的cofe值進行可視化(圖2C)。隨后基于6個關鍵基因構建預后模型,并根據中位數將研究人群分為高低風險組。結果顯示低風險組OS高于高風險組(P<0.05)(圖2D)。時間依賴ROC曲線顯示1、3、5-年預后模型的AUC分別為0.693、0.672、0.707(圖2E),ROC曲線的結果表明預后模型具有良好的預測效果。此外,通過可視化預后模型展示高風險組和低風險組的差異,兩組間風險水平的分布、患者的生存狀態、生存時間以及各基因的相對表達水平(圖2F),進一步證實預后模型對于生存預后的預測作用。

圖2 與T細胞相關的特征基因的預后預測模型/基于與T細胞相關的特征基因構建預后預測模型

三、構建LUAD轉移預測模型

再次對這些Treg相關基因進行LASSO回歸分析,篩選出可以識別轉移的關鍵基因(P<0.05)(圖3A、B)。結果顯示IL2、PRKCD、TNFSF4、FOXP3、FUT7、BCL6、PSG9、TOX和FANCA與LUAD轉移密切相關(圖3C)。隨后基于9個關鍵基因構建轉移預測模型,并通過ROC曲線、校準曲線和DCA曲線評估模型的預測性能。ROC曲線(AUC=0.762)表明所建模型具有良好的預測效果(圖3D)。校準曲線顯示預測轉移率與實際轉移率吻合程度良好,進一步表明該模型在預測LUAD患者轉移風險中的可靠性(圖3E)。在本研究中,通過DCA曲線的分析,模型在一定程度上提高了預測的凈效用。這表明在臨床應用中,該模型是一個有力的工具,能夠為醫生提供更準確、更可靠的診斷結果(圖3F)。

圖3 提取T細胞相關的特征基因構建轉移預測模型

四、篩選預后及轉移基因

為了進一步對基因數量進行降維,對9個轉移基因和6個預后基因取交集,韋恩圖顯示PRKCD和IL2均可以在調控LUAD轉移的同時還影響患者的預后(圖4A)。Kaplan-Meier生存曲線顯示高表達PRKCD和IL2的患者OS顯著高于低表達患者(P<0.05)(圖4B、C)。ROC曲線顯示PRKCD和IL2的AUC分別為0.631和0.642(圖4D、E)。上述結果表明在LUAD的轉移中,PRKCD和IL2發揮著相似的作用。

圖4 與T細胞相關的預后及轉移相關基因

五、過表達PRKCD可以通過EMT通路抑制LUAD轉移

由于IL2在肺癌中已有廣泛研究,而PRKCD在肺癌的研究知之甚少,由此聚焦到PRKCD。基于公共數據集的研究結果,通過RT-qPCR檢測了人正常肺上皮細胞系(BEAS-2B)和包括A549、95D、H1975、H292在內的四種LUAD腫瘤細胞PRKCD的mRNA表達水平。結果顯示,與BEAS-2B相比,腫瘤細胞低表達PRKCD,與公共數據集的研究結果一致(圖5A)。選取LUAD腫瘤細胞中低表達PRKCD的H1975細胞系和高表達PRKCD的A549細胞系,慢病毒過表達H1975和 A549系的PRKCD水平(圖5B)。Transwell實驗表明,與對照組相比,過表達PRKCD會抑制腫瘤細胞的遷移(圖5C)和侵襲(圖5D)。劃痕實驗同樣表明過表達PRKCD會降低A549和H1975細胞的遷移能力(圖5E,F)。Western Blot結果表明,過表達PRKCD的腫瘤細胞表達更高水平的E-cadherin,而N-cadherin和Vimentin的蛋白水平則顯著被抑制(圖5G、H)。

圖5 體外過表達PRKCD可降低LUAD細胞的侵襲轉移及EMT

討 論

骨、腦、淋巴結等遠處轉移的發生是LUAD患者預后不良的主要因素,這導致越來越多的研究者將關注點放在患者精準靶向及免疫治療上[16-18]。

通過生物信息學的方法對公共數據集加以分析,篩選出調節腫瘤免疫微環境的關鍵細胞和基因,這不僅降低了研究成本,而且在很大程度上提高了研究效率。在腫瘤微環中,T細胞通過調節腫瘤細胞的增殖、誘導腫瘤細胞凋亡、清除腫瘤細胞等方式在肺癌治療中發揮著至關重要的作用[19-20]。而腫瘤細胞通過分泌多種細胞因子、調節T細胞的分化和功能等方式,抑制T細胞的活性[21-22]。例如：殺傷性T細胞(CD8+T細胞)是最為直接的腫瘤清除者,通過定向殺傷肺癌細胞并誘導腫瘤細胞凋亡的方式來抑制肺癌的轉移和進展[23]。CD4+T細胞則激活其他T細胞亞型,并促進T細胞在腫瘤局部的遷移,從而發揮重要作用[24]。此外,T細胞活化可以調節免疫檢查點抑制劑的治療效果,如免疫檢查點抑制劑抑制肺癌細胞表面的PD-L1,激活T細胞對腫瘤細胞的清除作用,從而遏制肺癌的轉移和生長[25]。因此T細胞在LUAD腫瘤進展及其轉移中起著關鍵作用。IL2 被稱作 T 細胞生長因子,這是因為它一直被認為是促進 T 細胞增殖和分化的關鍵分子[26]。另一方面也有學者發現腫瘤微環境中的 IL2 可誘導 CD8+T 細胞耗竭,進而抑制抗腫瘤免疫反應[27]。

本研究從TCGA數據庫中篩選出發生腫瘤轉移(M1)和未發生腫瘤轉移(M0)兩組LUAD患者具有差異的免疫T細胞群,并篩選出與T細胞相關的6個預后基因(PRKCD、BTN2A2、IL2、CTLA4、FANCD2和IRF1)及9個轉移基因(IL2、PRKCD、TNFSF4、FOXP3、FUT7、BCL6、PSG9、TOX和FANCA),并據此構建預后模型和診斷模型。發現IL2和PRKCD既可以影響LUAD患者預后也可以影響LUAD患者腫瘤細胞的轉移。進一步聚焦PRKCD,發現過表達PRKCD可以顯著抑制腫瘤細胞遷移、侵襲和EMT。由此,我們得出PRKCD可能通過EMT介導LUAD腫瘤細胞轉移的結論。研究還存在一定的不足和局限。例如,PRKCD調控EMT的生物學機制尚不清楚。此外,PRKCD對遷移侵襲的影響是否特定的針對肺癌,抑或在其他癌癥類型中具有類似的作用,有待進一步研究。

總而言之,本研究為LUAD患者的預后提供了新線索,揭示了PRKCD在轉移治療中的潛力,為探索LUAD轉移提供了新的治療靶點。