蝴蝶輕元素穩定同位素比值的測定

傅慧敏,蘇芝敏,2*,王巧環,孟 齡

(1.中國科學院生態環境研究中心 城市與區域生態國家重點實驗室,北京 100085;2.北京京津冀區域生態環境變化與綜合治理國家野外科學觀測研究站,北京 100085)

蝴蝶對環境的依賴程度較高,其生存環境的氣候變化、食物來源等都會直接影響區域內蝴蝶的種類和數量,因此蝴蝶可作為研究生態環境的指標[1-2]。國內對蝴蝶的研究主要是以采集后分類為主,較少用穩定同位素技術判定蝴蝶的生活習性。研究表明,昆蟲的穩定同位素比值可以直觀地展現昆蟲的遷徙、食物來源、營養級、溯源等信息[3-12]。目前昆蟲的穩定同位素比值檢測,一般選用全蟲[4,12]或者頭部[13]、腿部[14]、翅膀[15]等不同部位進行脫脂或不脫脂處理[8,16],脫脂試劑一般為不同體積比的甲醇-三氯甲烷的混合溶液[4,7-8,17],沒有統一明確的試驗方案,而昆蟲的選擇部位和前處理有可能會影響數據的可靠性。

本工作選用個頭較大的活大帛斑蝶,對其不同部位和經不同配比的脫脂試劑脫脂后的翅膀進行輕元素穩定同位素比值(δ13C、δ15N、δ2H、δ18O值)的測定,考察差異性,從而確定蝴蝶輕元素穩定同位素比值的測定方法。

1 試驗部分

1.1 儀器與試劑

Flash EA 2000 HT型元素分析儀;DELTA V Advangtage型穩定同位素比質譜儀。

甲醇為色譜純;三氯甲烷為分析純;試驗用水為超純水。

5種標準物質見表1(V-PDB表示碳穩定同位素的標準物質;AIR表示氮穩定同位素的標準物質;V-SMOW表示氧、氫穩定同位素的標準物質);5只人工養殖的同批次活大帛斑蝶購自同一網店,編號S1～S5。

表1 標準物質

1.2 儀器工作條件

利用元素分析儀,碳、氮元素經燃燒還原分別轉化成CO2和N2,氫、氧元素經高溫裂解分別轉化為H2和CO。待測元素轉化為目標氣體后,由連續流接口引入穩定同位素比質譜儀;各待測元素穩定同位素比值的儀器工作參數見表2。

表2 儀器工作參數

1.3 試驗方法

1.3.1 樣本預處理

將活蝴蝶樣本用少量水沖洗,自然風干。用鑷子和剪刀將每只蝴蝶分解成6個部分：頭部、左翅、右翅、腿部、胸部、腹部,然后分別放置于干凈的燒杯中。

未脫脂處理：將頭部、左翅、腿部、胸部、腹部樣本放置于60 ℃的烘箱中烘干,研磨并儲存于密封性好的玻璃瓶中,其中左翅部位烘干后先剪碎再研磨。

脫脂處理：用水浸泡右翅樣本30 min,再用體積比2…1的甲醇-三氯甲烷混合溶液(A)或體積比1…2的甲醇-三氯甲烷混合溶液(B)浸泡2 h; 棄去混合溶液,用水清洗兩次并浸泡30 min,再用A或B浸泡2 h,取出,用水清洗3次,置于60 ℃烘箱中烘干,剪碎后研磨,并儲存于密封性好的玻璃瓶中。

1.3.2 穩定同位素比值的測定

考慮到不同元素需要的樣本量可能不同,若選擇一次進樣多元素同時測定,則需要利用氦氣稀釋過量的氣體產物,這會引起測定誤差。為了避免稀釋帶來誤差,預試驗發現測定δ13C值需要0.08 mg樣本,測定δ15N值需要0.40 mg,測定δ2H和δ18O值均需要0.20 mg。因此,分別稱取約0.08,0.40 mg研磨好的樣本包入錫杯中,用于δ13C和δ15N值的測定;稱取約0.20 mg樣本包入銀杯中,用于δ2H和δ18O值的同時測定。

2 結果與討論

2.1 校準曲線

同位素測定數據的校正可采用兩點或多點法(兩個或多個標準物質)[18],因此試驗選用B2203、B2205、CBS這3種標準物質校正δ2H和δ18O值,選用B2157、B2205、IVA33802174這3種標準物質校正δ15N和δ13C值。以儀器測定值為橫坐標,各元素穩定同位素比值的標準值為縱坐標繪制校準曲線,結果見表3。

表3 校準曲線

2.2 樣本分析

按照試驗方法對5只蝴蝶樣本進行預處理和測定,每個樣本取兩份,結果見表4。為了比較不同部位的穩定同位素比值差異,首先對各組數據進行正態分布檢驗。δ13C和δ15N值不滿足正態分布條件,因此采用Kruskal-Wallis(克魯斯卡爾-沃利斯)檢驗判定不同部位之間的差異顯著性,差異達到顯著水平(P<0.05)時采用Tukey法進行多重比較;δ18O和δ2H值滿足正態分布條件,因此采用One way ANOVA(單因素方差分析)判定不同部位之間的差異顯著性,差異達到顯著水平(P<0.05)時采用Holm-Sidak法進行多重比較,結果見表4;其中同一行不含相同字母的部位表示差異達到顯著水平(P<0.05)。

表4 蝴蝶不同部位的穩定同位素比值

由表4可知：蝴蝶不同部位的δ13C和δ2H值差異分別達到顯著(P<0.05)和極顯著(P<0.001)水平;蝴蝶翅膀的δ13C值最高,右翅(B)與頭、胸、腹三個部位之間的δ13C值差異達到顯著水平,頭、胸、腹部位之間的δ13C值沒有顯著差異;蝴蝶腹部的δ2H值最高,且與其他部位的δ2H值均有顯著差異,而其他部位之間的δ2H值沒有顯著差異;左翅和右翅(A、B兩種脫脂處理)的δ13C、δ15N、δ2H、δ18O值的測定結果均無顯著差異,可見對翅膀脫脂與否,以及兩種配比的脫脂試劑對δ13C、δ15N、δ2H、δ18O值的測定結果無影響。這些現象可能是因為內臟器官的存在以及蝴蝶攝取食物的差異而產生的。

當需要利用穩定同位素技術分析蝴蝶的食源、分布以及遷徙活動等信息時,直接將其翅膀或腿部烘干、粉碎研磨后取樣進行檢測,無需進行脫脂處理,以減少有機試劑對環境的污染;若是需要對蝴蝶食源進行研究,建議取其腹部內容物進行檢測。