蘭州百合鱗莖花青素合成相關MYB與bHLH轉錄因子的篩選分析

范文廣,李保豫,田輝,李欣,任海偉,曹瑩瑩,姜欣彤,柴佳靖,陳少青

(蘭州理工大學 生命科學與工程學院,甘肅 蘭州,730050)

百合(Liliumspp.)是百合科(Liliaceae)百合屬(LiliumL.)植物的統稱,多年生草本植物,地下部分為肉質鱗莖,其花姿綽約、花色多彩、氣味芬芳,是世界上最重要的觀賞花卉之一[1]。全世界已發現百合屬約110種[2],中國作為百合產地之一,野生百合約47種[3]。百合不僅作為觀賞花卉,其地下鱗莖部分也具有多種營養成分,包括多糖、蛋白、皂苷和膳食纖維等[4],具有抗氧化及抗衰老等作用[5]。蘭州百合(Liliumdavidiivar.unicolor),鱗片大、肉質飽滿、味道甘甜、口感好,是我國主要的食用百合之一,近些年來受廣大消費者的喜歡[6]。蘭州百合鱗莖的顏色出土時為白色,但在貯藏運輸過程中,許多鱗片由于花青素的積累而變成紫紅色,極大地降低了百合的商用價值[7]。

國內外針對于百合花青素的研究,大多集中在花瓣部分,對于百合鱗莖花青素的研究非常少。百合中花青素的主要成分為矢車菊素3-O-β-蕓香糖苷,其次是3-O-β-蕓香糖-7-O-β-葡萄糖苷[8]。影響百合花青素生物合成途徑的相關基因分為結構基因與調控基因。亞洲百合雜交品種‘Montreux’中,鑒定出查爾酮合成酶(chalcone synthase,CHS)與二氫黃酮醇還原酶(dihydroflavonol reductase,DFR)基因在百合花青素生物合成過程中發揮關鍵作用[9]。在東方百合‘Sorbonne’中,發現查爾酮異構酶(chalcone isomerase,CHI)和DFR基因與花青素合成緊密相關[10-11]。亞洲雜交百合‘Montreux’中,分離出2個MYB(v-myb avian myeloblastosis viral oncogene homolog)基因:LhMYB6與LhMYB12,參與花青素的生物合成[12]。岷江百合(Lilium.regale)中,LrMYB15在外側花被、葉和苞片上游不同程度的表達,決定了花青素的合成與積累[13]。亞洲百合雜交品種‘Montreux’中,還鑒定有2個bHLH(basic helix-loop-helix)基因:LhbHLH1和LhbHLH2參與了花青素的合成且關系密切[14]。岷江百合(Lilium.regale)中發現,在LrbHLH2與LrMYB15協同作用下調節花青素的合成與積累[13]。

當前對于百合鱗莖花青素的研究較少,且針對百合花青素轉錄因子的研究多是以單個基因的克隆與分析為主,缺乏針對轉錄因子家族的鑒定與分析。本研究基于蘭州百合鱗莖測序的轉錄組學數據鑒定出的MYB與bHLH轉錄因子家族進行篩選分析,并篩選出一些花青素相關的轉錄因子基因作為候選基因,分析結果將為深入研究蘭州百合鱗莖中MYB與bHLH轉錄因子參與花青素生物合成的機制提供基礎理論依據。

1 材料與方法

1.1 植物材料

百合鱗莖樣本選自甘肅省蘭州市西果園街道,大小均勻,無病蟲害,無機械損傷。取百合鱗片第四層和第五層,用蒸餾水洗滌,浸于1 g/L次氯酸鈉水溶液中浸泡1 min,消除潛在微生物,作為實驗處理的植物材料[15]。將鱗片密封在聚乙烯薄膜塑料袋中(200 mm×150 mm,0.03 mm厚)。然后將鱗莖置于人工氣候培養箱中,(20±2) ℃處理5 d(日照12 h,遮陽12 h),相對濕度保持在70%～80%。分別于第0天和第5天取百合鱗莖,用液氮快速冷凍,然后收集在5 mL的低溫保存管中,送至上海百趣生物科技有限公司測轉錄組。每個實驗設置3次生物學重復。

1.2 蘭州百合鱗莖MYB與bHLH轉錄因子家族的理化性質分析、亞細胞定位預測

利用在線ProtParam網站(https://web.expasy.org/protparam/)對轉錄組鑒定出的MYB和bHLH類轉錄因子蛋白性質進行理化性質分析[16]。用在線WOLF PSORT網站(https://wolfpsort.hgc.jp/)對候選MYB與bHLH基因編碼的蛋白進行亞細胞定位預測分析。然后參考DUBOS等[17]的方法,將轉錄組中MYB分類。

1.3 蘭州百合鱗莖與擬南芥中MYB與bHLH轉錄因子進化關系、功能分析及候選轉錄因子的保守結構域分析

在擬南芥信息數據庫TAIR(http://www.arabidopsis.org)獲取擬南芥MYB與bHLH轉錄因子氨基酸序列。使用MEGA X軟件分別構建蘭州百合鱗莖MYB轉錄因子與擬南芥MYB轉錄因子家族系統發育樹,及蘭州百合鱗莖bHLH轉錄因子與擬南芥bHLH轉錄因子家族系統發育樹,選用鄰接(neighbor-joining, NJ)法對序列結果進行比對,選用Poisson模型并將Bootstrap value設置為1 000,缺失值處理方式為配對刪除(pairwise deletion),其他參數使用默認值[18]。利用DNAMANV 6軟件對蘭州百合鱗MYB與bHLH轉錄因子進行多序列比對,并通過CDD v3.17(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi/)與Pfamv32.0(https://pfam.xfam.org/)分析候選MYB與bHLH轉錄因子的保守結構域。

2 結果與分析

在蘭州百合鱗莖轉錄組測序數據中,初步篩選到53個MYB轉錄因子相關序列,73個bHLH轉錄因子相關序列,運用NCBI在線blastp軟件進行轉錄因子氨基酸序列比對篩選,最終鑒定出MYB轉錄因子50個,bHLH轉錄因子73個。

2.1 蘭州百合鱗莖MYB轉錄因子

2.1.1 蘭州百合鱗莖MYB轉錄因子的理化性質分析、亞細胞定位預測

針對鑒定出的蘭州百合鱗莖MYB轉錄因子理化性質進行分析,其中包括蛋白長度、分子質量、等電點和親疏水性。結果如表1所示,蘭州百合鱗莖轉錄組中篩選出的50個MYB轉錄因子蛋白長度為93～1 365 aa,分子質量大小為10.93～152.08 kDa,等電點為4.63～11.63。預測結果還顯示出50個MYB轉錄因子編碼的蛋白不穩定指數均大于40,為不穩定蛋白,且50個蛋白的平均親水指數均小于0,屬于親水性蛋白。亞細胞定位預測結果顯示Cluster-96.0蛋白定位于線粒體,Cluster-4138.2991蛋白定位于細胞質,其余48個MYB蛋白定位于細胞核中。將蘭州百合鱗莖轉錄組中50個MYB蛋白序列逐個進行在線BLAST,MYB分類結果如表1所示,2個1R-MYB類,44個R2R3-MYB類,3個3R-MYB類,1個4R-MYB類。蘭州百合鱗莖轉錄組數據中MYB分類結果表示,1R-MYB占4%,R2R3-MYB占88%,3R-MYB占6%,4R-MYB占2%,不同類別的MYB轉錄因子分布比例與小麥(Triticumaestivum)、楊樹(Populusspp.)、谷子(Setariaitalica)和黑果枸杞(Lyciumruthenicum)等研究結果類似[17]。

2.1.2 蘭州百合鱗莖與擬南芥中MYB轉錄因子進化關系、功能分析及候選轉錄因子的保守結構域分析

利用MEGA X軟件對蘭州百合鱗莖MYB轉錄因子與注釋明確的擬南芥MYB轉錄因子蛋白家族構建系統進化樹,分析進化關系與功能預測。根據DUBOS等[17]針對擬南芥MYB轉錄因子亞族分類,圖1中使用紅色顯著標出的AtMYB75、AtMYB90、AtMYB113和AtMYB114屬于S6亞組,擬南芥中功能明確的調控花青素生物合成晚期基因并促進花青素積累的轉錄因子[19]。擬南芥AtMYB75和AtMYB90對于DFR基因的表達至關重要[20],AtMYB113和AtMYB114影響花青素生物合成后期酶的表達[21]。圖1中Cluster-668.0、Cluster-4138.14450、Cluster-4138.3405、Cluster-4138.19859和Cluster-4138.19860與S6亞組聚集在一起,推測其具有相似的花青素生物合成相關功能。

表1 蘭州百合鱗莖MYB轉錄因子的理化性質以及亞細胞定位預測Table 1 Physicochemical properties and prediction of subcellular localization of MYB transcription factors in Lilium davidii var.unicolor bulbs

圖1 蘭州百合鱗莖MYB轉錄因子與擬南芥AtMYB轉錄因子進化分析Fig.1 Phylogenetic tree of MYB transcription factor in Lilium davidii var.unicolor bulbs and Arabidopsis thaliana AtMYB transcription factor

將上述5個蘭州百合鱗莖MYB轉錄因子作為候選MYB轉錄因子,并利用在線軟件進行蛋白序列保守結構域的預測。預測結果如圖2顯示,5個候選MYB轉錄因子中Cluster-4138.3405僅含有1個 高度保守MYB-binding結構域,屬于1R-MYB轉錄因子,其余4個經預測均含有2個高度保守MYB-binding結構域,屬于R2R3-MYB轉錄因子。該結果與擬南芥MYB轉錄因子的研究中MYB轉錄因子N端存在高度保守DNA-binding結合結構域的結果類似[21]。蛋白保守結構域分析預測還發現MYB-binding結構域的蛋白數量為30～50個氨基酸,該結果與絹毛委陵菜(Potentillasericea)[22]、漆樹(Toxicodendronvernicifluum)[23]和亞洲百合(LiliumAsiatic hybrids ‘Little Kiss’)[24]MYB的研究類似。

圖2 蘭州百合鱗莖花青素相關MYB轉錄因子蛋白保守結構預測Fig.2 Prediction of the conserved structure of anthocyanin-related MYB transcription factor proteins in Lilium davidii var.unicolor bulbs

2.2 蘭州百合鱗莖bHLH轉錄因子

2.2.1 蘭州百合鱗莖bHLH轉錄因子的理化性質分析、亞細胞定位預測

對鑒定出的73個蘭州百合鱗莖bHLH轉錄因子進行理化性質分析。結果如表2所示,73個bHLH轉錄因子的蛋白長度為39～703 aa,分子質量為4.61～79.85 kDa,等電點為3.8～11.47。在線預測結果表明73個蘭州百合鱗莖bHLH轉錄因子編碼的蛋白均為不穩定蛋白(不穩定指數大于40),并且僅有一個Cluster-4138.21820平均親水指數大于0為疏水性蛋白,另外72個bHLH編碼蛋白均為親水性蛋白。亞細胞定位預測結果表明,1個bHLH定位于細胞外,58個定位于細胞核,8個定位于葉綠體,2個定位于線粒體,1個定位于內質網,3個定位于細胞質。轉錄組中73個bHLH經亞細胞定位,在細胞各位置中的分布比例類似于銀杏(Ginkgo)[25]與黑果枸杞(LyciumruthenicumMurr.)[26]。

表2 蘭州百合鱗莖bHLH轉錄因子的理化性質以及亞細胞定位預測Table 2 Physicochemical properties and prediction of subcellular localization of bHLH transcription factors in Lilium davidii var.unicolor bulbs

續表2

2.2.2 蘭州百合鱗莖與擬南芥中bHLH轉錄因子進化關系、功能分析及候選轉錄因子的保守結構域分析

利用MEGAX軟件對蘭州百合鱗莖bHLH轉錄因子與注釋明確的擬南芥bHLH轉錄因子蛋白家族構建系統進化樹,分析進化關系與功能預測。根據擬南芥bHLH亞族分類,圖3中使用紅色顯著標出的分支AtbHLH42、AtbHLH12、AtbHLH1和AtbHLH2屬于IIIf亞族是擬南芥中功能明確的花青素生物合成相關的轉錄因子[27],AtbHLH32可作為花青素的負調節劑影響擬南芥花青素的合成[28],AtbHLH42可與AtMYB75協同作用通過影響DFR基因的表達,進而影響花青素的生物合成[29]。其中Cluster-4138.9158、Cluster-18294.0與IIIf亞族聚集在一起,推測其可能具有較高的親緣性以及相似的花青素生物合成相關功能。

將上述2個蘭州百合鱗莖bHLH轉錄因子作為候選bHLH轉錄因子,并進行蛋白序列保守結構域的預測。預測結果如圖4顯示,2個候選bHLH轉錄因子均在C端預測出螺旋-環-螺旋(helix-loop-helix,HLH)保守域,分別由50個和64個氨基酸構成,這一結果符合bHLH轉錄因子的基本特征,與谷子(SetariaitalicaL.)[30]和黑果枸杞[26]等bHLH研究結果類似。

圖3 蘭州百合鱗莖bHLH轉錄因子與擬南芥AtbHLH轉錄因子進化分析Fig.3 Phylogenetic tree of bHLH transcription factor in Lilium davidii var.unicolor bulbs and Arabidopsis thaliana AtbHLH transcription factor

圖4 蘭州百合鱗莖花青素相關bHLH轉錄因子蛋白保守結構預測Fig.4 Prediction of the conserved structure of anthocyanin-related bHLH transcription factor proteins in Lilium davidii var.unicolor bulbs

2.3 蘭州百合鱗莖花青素相關轉錄因子基因表達分析

基于蘭州百合鱗莖轉錄組數據,本研究對比了第0天和第5天的蘭州百合鱗莖分析花青素相關轉錄因子基因表達量。如表3所示,第0天與第5天各基因的表達量來自于蘭州百合鱗莖轉錄組數據。研究表明,2個候選花青素相關bHLH轉錄因子中,Cluster-18294.0在第5天的表達量略低于第0天,但P值為0.902 95,表示蘭州百合鱗莖第0天VS第5天中該基因無顯著性表達差異,而Cluster-4138.9158表達量顯示出明顯的上升趨勢。5個候選花青素相關MYB轉錄因子中,Cluster-413814450在第5天的表達量呈現下降趨勢,且存在極其顯著的表達差異,其余4個候選MYB轉錄因子在第5天皆呈上升趨勢,并具有顯著性差異。

表3 蘭州百合鱗莖花青素相關轉錄因子基因的表達量分析Table 3 Expression analysis of anthocyanin-related transcription factor genes in Lilium davidii var.unicolor bulbs

植物花青素合成過程中,調控基因通過編碼轉錄因子調控結構基因的表達量,進而影響花青素的合成通路。本課題組關于蘭州百合鱗莖的轉錄組與代謝組研究中[31],花青素合成通路中共發現20個差異表達結構基因。7個候選花青素相關轉錄因子基因中Cluster-18294.0未在第5天與第0天發現差異表達,故推測其在蘭州百合鱗莖花青素合成中并不起調控作用。利用皮爾遜系數法測定候選基因中6個差異表達轉錄因子基因與20個差異表達結構基因的相關性。結果如圖5所示,Cluster-4138.14450與19個高表達花青素相關結構基因呈現負相關關系,推測其在蘭州百合鱗莖花青素積累過程中發揮抑制作用,Cluster-668.0與5個差異表達的結構基因顯示出負相關,與其他15個差異表達結構基因顯示出正相關關系,且皮爾遜系數普遍較低,故推測Cluster-668.0對于蘭州百合鱗莖花青素合成的影響力較弱。其余4個候選花青素相關轉錄因子基因與19個高表達花青素相關結構基因均呈現正相關關系,且部分皮爾遜相關性系數大于0.8,呈現出極正相關關系。因此推測1個bHLH轉錄因子基因(Cluster-4138.9158),3個MYB轉錄因子基因(Cluster-4138.3405,Cluster-4138.19860與Cluster-4138.19859),對蘭州百合鱗莖花青素的合成積累起促進作用。

圖5 蘭州百合鱗莖花青素相關轉錄因子基因與結構基因相關性分析Fig.5 Correlation analysis of anthocyanin-related transcription factor genes and structural genes in Lilium davidii var.unicolor bulbs

3 結論

綜上所述,本研究基于轉錄組數據篩選分析了蘭州百合鱗莖的MYB與bHLH轉錄因子家族,并通過與模式植物擬南芥注釋明確的MYB與bHLH轉錄因子構建系統進化樹分析親緣關系,以及利用皮爾遜系數分析花青素相關差異表達轉錄因子與結構基因的相關性,初步篩選出蘭州百合鱗莖花青素相關的3個MYB基因(Cluster-4138.3405,Cluster-4138.19860與Cluster-4138.19859)和1個bHLH基因(Cluster-4138.9158)發揮促進作用,1個MYB基因(Cluster-4138.14450)起抑制作用,1個MYB基因(Cluster-668.0)影響力較弱,1個bHLH基因(Cluster-18294.0)未起調控作用。以上研究結果為進一步深入研究百合鱗莖花青素相關的分子調控機制提供理論基礎。