蛋雞脂肪肝出血綜合征對肝臟及腹脂轉錄組的影響研究

易昕睿，馬金虎，王毅，王玉潔，朱枚子，李鑫宇，唐云書，薛敏，黃建珍，朱亞玲，3*

(1. 安徽醫科大學基礎醫學院，安徽 合肥 230032；2. 江西農業大學動物科學技術學院，江西 南昌 330045；3. 安徽醫科大學P2級動物實驗中心，安徽 合肥 230032)

脂肪肝出血綜合征(fatty liver hemorrhagic syndrome，FLHS)是由于蛋雞肝臟脂肪代謝紊亂導致脂質異常積累而引起的一種營養代謝性疾病，以肝臟腫大、質地松脆易碎、表面伴出血點或出血斑、大量腹脂沉積為主要臨床特征[1]。FLHS是籠養蛋雞死亡的主要原因，給蛋雞養殖業造成巨大經濟損失[2]，然而其發病機制尚不清晰。

肝臟是家禽脂代謝的主要場所，幾乎承擔了90%～95%的脂質合成壓力[3-4]。Aziza等[5]闡釋脂肪酸在肝臟內合成后與載脂蛋白結合，運輸至血液后經脂蛋白脂肪酶水解為脂肪酸，由腹脂組織攝取并儲存。而腹脂沉積過多則會反向影響肝臟功能，使得肝臟受損[6-8]。同時，郭連營等[9]發現蛋雞肝臟受損，也會導致游離脂肪酸沉積于肝細胞中，進一步誘發炎癥級聯反應，造成FLHS。Wang等[10]表明腹脂組織可通過分泌多種細胞因子如瘦素調控機體脂代謝的動態平衡；Sun等[11]揭示腹脂組織大量分泌促炎因子如白細胞介素6(IL-6)、腫瘤壞死因子α(TNF-α)等可調節炎癥反應，促進肝臟代謝疾病的發生發展。劉春凌等[12]進一步表明降低FLHS患雞血清中IL-6、TNF-α水平可減輕FLHS患病程度。前人研究表明肝臟和腹脂是反映脂質代謝過程的重要組織，而針對FLHS機制的探索，前期研究多關注肝臟或腹脂單個組織，組織間調控FLHS病程進展的互作性及差異性仍有待闡明。因此，本研究基于轉錄組測序(RNA-Seq)靶向研究肝臟和腹脂，進一步揭示高能低蛋白日糧通過肝臟和腹脂誘發蛋雞FLHS的分子機制，為預防和治療FLHS提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗設計與材料

選取30只150日齡健康依薩褐蛋雞(江西農業大學動物科學技術學院實驗室種蛋孵化)，平均體重約1.5 kg，隨機分成對照組和試驗組，每組各15只。對照組給予普通飼料，試驗組飼喂高能低蛋白日糧(表1)，自由采食和飲水，光照14～16 h/d。60 d后，采用苯巴比妥心臟麻醉，頸動脈放血處死，保存血清測量甘油三酯(TG)，總膽固醇(TC)；分別取2組蛋雞同一部位新鮮肝臟稱量肝濕重，以肝濕重/體重計算肝指數，取腹部脂肪組織置-80 ℃冰箱保存備用。

表1 日糧成分及營養水平

1.2 組織病理學觀察

每只蛋雞分別取黃豆粒大小肝臟和腹脂組織固定于4%甲醛溶液中24 h，然后進行常規脫水包埋[13]。切片厚5 μm，隨后利用蘇木精-伊紅(HE)染色，使用蔡司正置光學顯微鏡分別觀察比較肝臟和腹脂組織形態學變化并拍照。切片制作及HE染色過程由武漢塞維爾生物科技有限公司完成。采用Image-Pro Plus 6.0分析軟件測量并統計每組腹脂組織切片中100個脂滴直徑。

1.3 RNA建庫測序及數據處理

利用TRIzol試劑盒(Invitrogen，USA)從肝臟和腹脂中分別提取RNA，隨后將成功提取的RNA樣本送至諾禾致源公司進行建庫，并采用HiSeq 4000(Illumina)平臺測序。獲得原始數據后，進行基本的數據處理：去除接頭、N堿基比例超過10%及低質量測序序列(reads)(Qphred ≤ 20 的堿基數占整個reads長度的50%以上的序列)，過濾后得到高質量測序序列(clean reads)。其次使用FastQC軟件(http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/)對clean reads進行質量檢測。然后使用STAR-2.5.3a(https://github.com/alexdobin/STAR)軟件將clean reads比對到雞Gallus_gallus-5.0版本(Ensembl)基因組上[14]。使用StringTie(http://ccb.jhu.edu/software/stringtie/)軟件分兩步對轉錄本進行組裝：第一步為序列初組裝，第二步為轉錄本合并組裝。最后使用featureCounts軟件(http://subread.sourceforge.net/)對轉錄本進行定量[15]。

1.4 差異表達分析

利用DESeq2 R包軟件(http://www.bioconductor.org/packages/release/bioc/html/DESeq2.html)對定量后的基因表達量進行標準化，轉化為每千個堿基的轉錄每百萬映射讀取的片段(FPKM)。隨后繼續根據基因表達量的差異倍數(fold change，FC)利用DESeq2進行差異分析[16]，設定篩選差異表達基因(DEGs)閾值為|log2FC|≥ 1，P<0.05。

1.5 DEGs注釋和富集分析

利用PANTHER(http://www.pantherdb.org/)和DAVID(https://david. ncifcrf. gov/summary.jsp#)對DEGs進行基因本體(GO)功能注釋、京都基因組百科全書(KEGG)通路富集分析，利用基因集富集分析(GSEA)軟件對DEGs進行分析。

1.6 RT-PCR驗證

利用Molony小鼠白血病病毒轉錄酶(Promega，USA)和Oligo(dT)(TaKaRa，Japan)將2 μg總RNA反轉錄成cDNA第一鏈，使用LightCycler 480儀器和LightCycler 480 SYBR Green I Master Mix(Roche，USA)進行RT-PCR，擴增條件：95 ℃預變性10 min；95 ℃ 30 s，60 ℃ 1 min，40 個循環。隨后根據2-ΔΔCt算法計算靶基因相對管家基因β-actin的相對表達量。

1.7 數據統計與分析

使用Student’st檢驗進行顯著性分析。結果以“平均值±標準差”表示。

2 結果與分析

2.1 肝臟解剖學、組織病理學和血清變化

利用正常和高能低蛋白日糧分別喂養對照組和試驗組蛋雞。結果顯示，對照組肝臟未見異常變化，呈正常棕紅色，表面光滑、質地緊密、大小正常，肝臟下有不明顯脂肪墊(圖1A)；而試驗組肝臟呈土黃色，表面油潤腫大，邊緣厚鈍，質地松脆易碎，肝臟下可見厚脂肪墊且肝臟表面有針尖狀大小出血點(圖1B)。HE染色顯示，與對照組相比，試驗組蛋雞肝臟組織有較多脂質空泡(圖1D)，腹脂細胞腫脹明顯(圖1F)且腹脂細胞脂滴直徑明顯高于對照組(圖1G)。同時，試驗組肝指數、血清TG和TC的濃度顯著高于對照組(P<0.01，表2)。該結果表明高能低蛋白日糧可成功誘發蛋雞FLHS。

A.對照組肝臟大體觀；B. 試驗組肝臟大體觀，箭頭指示出血點和肝下厚脂肪墊；C. 對照組肝臟組織HE染色；D. 試驗組肝臟組織HE染色，箭頭指示脂質空泡；E. 對照組腹脂組織HE染色；F. 試驗組腹脂組織HE染色；G. 對照組與試驗組的腹脂細胞脂滴直徑比較(**表示P<0.01)。

表2 FLHS對蛋雞肝指數、血清TG和TC濃度的影響

2.2 蛋雞肝臟和腹脂RNA-Seq數據分析與質量控制

RNA-Seq序列進行質控和過濾后，從肝臟和腹脂樣本中分別平均得到4 620萬個和4 010萬個 clean reads，利用STAR-2.5.3a(https://github.com/alexdobin/STAR)軟件將clean reads比對到雞Gallus_gallus-5.0基因組，分別鑒別到4 260萬個和3 620萬個唯一匹配reads，唯一匹配率高達92.4%和90.2%，表明該數據質量較好，可用于進一步分析。

2.3 RNA-Seq挖掘FLHS蛋雞肝臟和腹脂的關鍵DEGs

進一步利用RNA-Seq分析在肝臟和腹脂中分別鑒定出443個和526個DEGs(|log2FC|≥1，P<0.05)。其中，在試驗組蛋雞肝臟中，DEGs有151個表達上調，292個表達下調(圖2A)；而在腹脂中，DEGs有409個表達上調，117個表達下調(圖2B)。ENSGALG00000048882等為肝臟相關的差異顯著性前20的DEGs(圖2C)，IL-6等為腹脂相關的差異顯著性前20的DEGs(圖2D)。

肝臟前10個極顯著上調基因(表3)與氨基酸的代謝與轉運、膽固醇穩態和脂質代謝密切相關，表明高能低蛋白日糧可能通過影響肝臟中營養物質代謝調節FLHS發生發展；而腹脂前10個極顯著上調基因(表4)則與免疫調節、炎癥反應及B細胞的成熟等過程密切相關，揭示了患雞腹脂組織可能通過調節免疫、炎癥反應影響FLHS發生發展。

A. 對照組(n=151)和試驗組(n=292)肝臟DEGs火山圖；B. 對照組(n=295)和試驗組(n=203)腹脂DEGs火山圖(|log2FC| ≥1，P<0.05)；C.前20個肝臟極顯著DEGs熱圖；D.前20個腹脂極顯著DEGs熱圖(|log2FC| ≥ 1，P<0.05)。黃色和綠色點分別表示上調基因和下調基因。

表3 FLHS蛋雞肝臟組織RNA-Seq中前10個極顯著DEGs

表4 FLHS蛋雞腹脂組織RNA-Seq中前10個極顯著DEGs

2.4 FLHS蛋雞肝臟及腹脂DEGs的富集分析

為進一步探究肝臟及腹脂DEGs影響的生物學功能，對2個組織DEGs進行GO功能注釋。結果顯示肝臟DEGs顯著富集于代謝過程(GO：0008152)，腹脂DEGs顯著富集于免疫系統過程(GO：0002376)。該結果提示試驗組蛋雞肝臟DEGs可能通過影響代謝過程，腹脂組織DEGs可能通過影響免疫系統過程，共同參與蛋雞FLHS的發生發展(圖3)。

圖3 肝臟(A)和腹脂(B)中DEGs的GO功能注釋結果

此外，DEGs的KEGG通路富集分析結果顯示，肝臟中磷酸烯醇丙酮酸羧激酶(PCK1)、載脂蛋白a-1(APOA1)等基因顯著富集于PPAR信號通路(圖4A、4C)；而腹脂中IL-6、細胞因子信號通路抑制因子3(SOCS3)等基因顯著富集于JAK-STAT信號通路(圖4B、4D)。該結果提示，肝臟PCK1、APOA1等DEGs與腹脂IL-6、SOCS3等DEGs可能分別通過PPAR信號通路、JAK-STAT 信號通路影響蛋雞FLHS的發生發展。為進一步確定蛋雞FLHS發生發展的關鍵通路，本研究對肝臟和腹脂組織DEGs進行了GSEA富集分析。結果顯示，試驗組蛋雞肝臟中PPAR信號通路活性和腹脂中JAK-STAT信號通路活性均顯著上調(圖5E、5F)。該結果與KEGG富集分析結果一致，進一步提示試驗組蛋雞肝臟和腹脂組織分別上調PPAR信號通路和JAK-STAT信號通路活性共同參與FLHS的發生發展。

A. 肝臟DEGs顯著富集的信號通路；B.腹脂DEGs顯著富集的信號通路；C. 肝臟DEGs極顯著富集的信號通路及其相關基因；D.腹脂DEGs極顯著富集的信號通路及其相關基因；E. GSEA富集分析提示試驗組蛋雞肝臟中PPAR信號通路的活性改變；F. GSEA富集分析提示試驗組蛋雞腹脂中JAK-STAT信號通路的活性改變。

A. PCK1、APOA1基因在肝臟樣本RNA-Seq數據中的基因表達水平；B. IL-6、SOCS3基因在腹脂樣本RNA-Seq數據中的基因表達水平；C. 肝臟PCK1 mRNA表達水平；D. 肝臟APOA1 mRNA表達水平；E. 腹脂IL-6 mRNA表達水平；F. 腹脂SOCS3 mRNA表達水平。*表示P<0.05，**表示P<0.01，n=3。

2.5 關鍵基因差異表達水平的驗證

為驗證RNA-Seq數據分析的DEGs及富集分析結果的準確性，選取肝臟中脂質代謝關鍵DEGs(PCK1、APOA1)和腹脂中炎癥反應關鍵DEGs(IL-6、SOCS3)利用RNA-Seq數據和RT-PCR技術進行驗證。患雞肝臟PCK1、APOA1基因表達水平和腹脂IL-6、SOCS3基因表達水平均顯著高于對照組(圖5A、5B)；RT-PCR結果也與RNA-Seq結果保持高度一致(圖5C、5D、5E和5F)。上述數據進一步證實前期結果的可靠性。

3 討論

FLHS是由多重因素相互作用導致的營養代謝性疾病，好發于產蛋高峰期的籠養蛋雞，嚴重損害了蛋雞的生產性能，給養殖業造成了巨大的損失[2，17]。FLHS主要表現為肝臟脂肪變性，家禽體內90%～95%的脂類來源于肝臟脂肪酸的從頭合成[18]，在機體中，少量的腹脂能夠保護肝臟，但過多的腹脂堆積則會反向影響肝臟功能[19]，從而誘發FLHS。因此，肝臟和腹脂是反映脂質代謝的重要組織。前期針對FLHS的研究忽略了肝臟和腹脂重要的相互作用，往往造成其應用及治療效果不佳。本研究針對肝臟和腹脂組織，在轉錄水平上系統性揭示了2種組織參與高能低蛋白日糧所致蛋雞FLHS發生發展的關鍵基因及其潛在分子機制。

基于肝臟RNA-Seq數據，我們發現FLHS患病蛋雞肝臟中PCK1、APOA1等基因出現明顯組織特異性表達上調。PCK1基因所編碼的磷酸烯醇丙酮酸羧基激酶是糖異生的限速酶[20]，前人研究在高脂日糧喂養的肥胖小鼠中，PCK1水平顯著提高，與脂質合成與代謝密切相關[21]；APOA1是高密度脂蛋白中主要的載脂蛋白，逆向膽固醇轉運調節外周組織膽固醇含量，同時可以激活卵磷脂膽固醇酰基轉移酶(LCAT)促進細胞內膽固醇的運出、酯化和轉移[22]；同時，本研究發現，PCK1、APOA1等基因明顯富集于PPAR信號通路，該通路被廣泛認為調控脂質代謝，通過干預脂肪酸穩態導致肝臟脂質代謝紊亂，參與脂肪性肝病的發生[23]。該結果提示高能低蛋白日糧可能通過影響載脂蛋白合成、糖異生等途徑來影響蛋雞肝臟脂質轉運代謝，造成TG過度蓄積進而造成肝臟脂肪變性；因載脂蛋白合成被影響，導致肝外游離脂肪酸增多，易被腹脂攝取造成腹脂沉積。在腹脂組織中，本研究鑒定出關鍵組織特異性DEGs，IL-6、SOCS3等。IL-6，由脂肪細胞分泌的重要炎性因子，其表達水平在一定程度上與脂肪組織炎癥反應正相關[24]，同時高表達的IL-6可以協同STAT3促進肝臟脂質合成[25]；而SOCS3已被證明是IL-6/JAK/STAT3信號轉導的關鍵調節因子，與炎癥性疾病密切相關[26]；同時，IL-6、SOCS3高度富集的信號通路JAK-STAT信號通路已被廣泛報道參與炎癥反應、脂質代謝等生物學過程，其活性失調可加重肝臟脂質代謝紊亂[27-28]。有意思的是，PPAR與JAK-STAT信號通路均可參與脂質代謝相關過程，提示高能低蛋白日糧同時作用肝臟及腹脂，分別通過PPAR及JAK-STAT信號通路導致肝臟及腹脂代謝紊亂，加重脂質蓄積造成肝細胞損傷。此外，PPAR與JAK-STAT信號通路的失調不僅影響肝臟脂質代謝過程，也可誘發腹脂組織分泌炎性因子，反向引起肝細胞氧化應激從而對肝細胞造成更大損傷，進一步表明脂質代謝及炎癥反應在FLHS病程中發揮重要作用。

綜上，上述結果揭示高能低蛋白日糧所致FLHS蛋雞轉錄譜特征與正常蛋雞間存在顯著差異，患雞肝臟可通過特異性高表達APOA1、PCK1等基因上調PPAR信號通路活性，加重肝臟脂質沉積；腹脂可通過特異性高表達IL-6、SOCS3等基因，上調JAK-STAT信號通路，誘發炎癥反應。肝臟和腹脂協同促進高能低蛋白日糧所致蛋雞FLHS的發生發展。因此，APOA1、PCK1、IL-6、SOCS3等基因可能是蛋雞FLHS發生發展的關鍵靶基因，PPAR及JAK-STAT信號通路作為調節脂質代謝和炎癥反應的關鍵信號通路，提供靶向肝臟和腹脂聯合用藥的新思路，為優化FLHS的預防和治療提供更為有效精準的新方法。