牛羊毛發中3種β-受體激動劑藥物殘留測定的EMR-Lipid方法研究

李文輝，于寒冰，倪香艷，張晶晶，魏紫嫣，王樂宜，趙雅妮，趙瑩，方芳，孫志文

(北京市農產品質量安全中心，北京 102600)

克倫特羅、沙丁胺醇、萊克多巴胺等是最常見的β-受體激動劑類藥物，具有促進動物快速生長、降低脂肪含量、提高瘦肉率的作用[1-2]，在我國常被違規作為促生長添加劑使用而被廣泛關注。政府多次發布牛羊養殖過程非法使用β-受體激動劑類藥物的情況，藥物在動物體內殘留通過食物鏈進入人體后會使人產生肌肉震顫、心悸、惡心等中毒癥狀，危害人類健康[1-3]。歐盟和國際食品法典委員會(CAC)制定了藥物的限制使用規定，我國早在1997年明令禁止克倫特羅作飼料添加劑，農業農村部250號公告[4]已經對克倫特羅等β-受體激動劑類藥物在所有可食用動物組織中做出明確的禁用規定，但現實養殖過程中，為了縮短上市周期，獲得高回報收益，特別是在牛羊等長養殖周期動物上的使用仍然存在。

目前通常選用可食性組織或者血液和尿液作為監測目標，動物可食性組織的采集需在屠宰之后，存在時滯性和局限性，即使檢出不合格，對于已流入市場的不合格樣品因追溯困難也難以做到及時有效的管控；同時藥物在血液和尿液中代謝速度快，停藥一段時間后已檢測不到藥物殘留，此時動物組織中仍可能有藥物殘留，容易造成漏檢，嚴重威脅著動物性食品安全，使監管面臨巨大挑戰[1-2]。多項研究表明動物毛發中可以蓄積多種獸藥，包括興奮劑類、激素類等藥物[3，5-8]，同時，β-受體激動劑藥物在動物毛發中代謝活性低，動物毛發消除規律研究表明藥物在毛發中可以穩定存在，因此可作為β-受體激動劑藥物在畜禽養殖環節違法添加監測監管的靶標，也成為評價動物性產品中藥物殘留量的重要參考組織[1-2]。為了解決上述問題，本研究提供了一種牛羊毛發樣品中β-受體激動劑類藥物殘留檢測方法，利用動物毛發實現無需宰殺動物檢測β-受體激動劑類藥物并可以對牛羊養殖屠宰整個周期持續監測，結合高效的強化基質去除技術(EMR-Lipid)獲取出色的待測藥物回收率，提高多種藥物同時定量分析的效率，滿足高效率測定的需求，準確度、靈敏度和精密度高，為動物性產品中β-受體激動劑類藥物殘留量測定提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 主要儀器設備和耗材

Waters Xevo TQ-S超高效液相色譜串聯質譜儀(配有MassLynx V4.1軟件處理系統，美國沃特世公司)；TTL-DCII氮吹儀(美國Jnc公司)；Vortex 3000 Elite旋渦振蕩器(德國艾卡公司)；JM-03D-80超聲波清洗器(潔盟清洗設備公司)；A11球磨機(德國艾卡公司)；Captiva EMR-Lipid凈化柱、QuEChERS凈化柱和萃取鹽包(美國安捷倫公司)；HLB和MCX固相萃取柱(美國沃特世公司)；GCB石墨化炭黑(美國賽默飛公司)；溶劑過濾器(孔徑 0.22 μm，美國頗爾公司)。

1.2 主要試劑和標準品

試劑：乙腈、甲醇和甲酸(色譜級和質譜級，美國賽默飛公司)；十二烷基磺酸鈉和鹽酸(分析純，國藥集團化學試劑有限公司)。

標準品：克倫特羅(C11668560)，萊克多巴胺(C16805000)，沙丁胺醇(C16903000)，含量均≥98.0% (美國Dr.E公司)?？藗愄亓_-D9同位素標記物(C11668561)，萊克多巴胺-D6同位素標記物(A16805010)，沙丁胺醇-D3同位素標記物(XA16903001)，含量均≥98.0%(美國Dr.E公司)。

1.3 溶液和標準溶液的配制

0.01 g/mL十二烷基磺酸鈉溶液：稱取十二烷基磺酸鈉10 g，加水溶解并稀釋至1 000 mL，混勻。0.1 mol/L鹽酸溶液：取鹽酸8.3 mL，加水稀釋至1 000 mL，混勻。5%氨化乙腈溶液：取氨水5 mL，加入乙腈95 mL，混勻。0.1%甲酸溶液：取甲酸1 mL，加水稀釋至1 000 mL，混勻。

標準儲備液：取約10 mg標準品(精密稱定)，分別置于10 mL棕色容量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，配成濃度為1 mg/mL的標準儲備液，-18 ℃以下保存，有效期12個月?；旌蠘藴使ぷ饕海何』旌蠘藴手虚g液0.1 mL，置于10 mL棕色容量瓶中，用0.1%甲酸溶液溶解并稀釋至刻度，配成濃度為100 ng/mL混合標準工作液，現配現用。

1.4 試樣的制備與保存

1.4.1 樣品采集

選取牛羊皮膚毛發，毛發從根部剪斷，保存備用，單只動物采集毛發的量應不少于4 g。

1.4.2 樣品制備和保存

取2 g毛發加入50 mL燒杯中，加入20 mL 0.01 g/mL的十二烷基磺酸鈉溶液[2]，超聲清洗30 min，后用水洗凈毛發，放在40 ℃的干燥箱中烘干，用球磨機將其粉碎至粉末，置于干燥器中保存備用。

1.5 試樣的提取和凈化

1.5.1 提取

取試樣(0.50±0.02)g(精確至0.01 g)置于離心管內，樣品中添加適量同位素標記物標準工作液(100 ng/mL)25 μL，取5 mL 0.1 mol/L鹽酸溶液于離心管中，渦旋混勻。于60 ℃水浴中水解4 h，7 000 r/min離心10 min，取上清液加入10 mL 5%氨化乙腈，加萃取鹽包，渦旋混勻5 min，8 000 r/min離心10 min，上清液取5 mL氮氣吹至2.5 mL左右備用。

1.5.2 凈化

將提取后的上清液和0.5 mL超純水加入到Captiva EMR-Lipid凈化柱中，收集濾液后，加入50 mg GCB，用渦旋混合器混勻1 min，然后在4 ℃，9 000 r/min離心10 min，得到的凈化溶液過0.22 μm的微孔濾膜，得到待測樣品溶液供儀器測定分析。

1.6 測定方法條件

1.6.1 液相色譜參考條件

色譜柱：Waters UPLC BEH C18柱，規格50 mm×2.1 mm，填料粒徑1.7 μm；柱溫：40 ℃；進樣量：2 μL；流動相A：乙腈；流動相B：0.1%甲酸水；流速：0.3 mL/min，梯度洗脫。具體程序見表1。

表1 梯度洗脫程序

1.6.2 質譜參考條件

離子源：電噴霧ESI+離子源；檢測方式：MRM質譜多反應監測信號采集；毛細管電離電壓：3.00 kV；離子源溫度：150 ℃；霧化溫度；450 ℃；錐孔氣流速：150 L/h；霧化氣流速：800 L/h。待測藥物及同位素內標定性/定量離子對、錐孔電壓及碰撞能量的參考值見表2。

表2 藥物及同位素內標定性定量離子對、錐孔電壓及碰撞能量

1.7 標準曲線的制備

精密量取混合標準工作液、混合內標工作液適量，用流動相稀釋成濃度為0.1、1、5、10、50和100 ng/mL的系列標準工作液(含內標溶液均為5.00 ng/mL)，供液相色譜-串聯質譜儀測定。以待測分析物特征離子質量色譜峰的峰面積與內標物特征離子質量色譜峰的峰面積比值為縱坐標，相應的濃度為橫坐標，繪制標準曲線，求回歸方程和相關系數。

1.8 靈敏度

參照文獻[9-11]中關于方法學考察的操作，采用空白基質中添加目標化合物的方法，依據特征離子質量色譜峰信噪比S/N≥3的濃度為方法的檢出限，S/N≥10的濃度為方法的定量限，在0.5 g空白試樣中添加適量標準混合溶液，制備得到添加樣品，經前處理過程后上機檢測，在相應的保留時間，空白試樣對所測的藥物無干擾，以評價方法的靈敏度。

1.9 準確度和精密度

參照文獻[9-10]，采用標準添加法，分別準確稱取空白樣品0.5 g，添加一定體積的標準工作溶液，使牛羊毛中β-受體激動劑類藥物濃度分別為1、20和100 μg/kg，按上述樣品前處理方法處理后進行測定，每個添加濃度設6個平行，重復測定3 d，內標法定量，計算待測藥物的回收率和計算批內、批間相對標準偏差以評價方法的準確度和精密度。

1.10 基質效應

基質(樣品組織)對待測分析物的檢測過程一般都會有干擾，會對待測分析物的離子化有很大的影響，并在一定程度上影響結果的準確性。采用基質(牛羊毛發)添加標準品方法添加，用目標物的相對響應值來考察基質效應(ME)，計算公式：ME=(空白樣品基質中添加同等含量目標分析物的響應值/在純溶劑中目標分析物的響應值)×100%。若ME<100%，則基質呈現抑制效應；若ME>100%，則基質呈現增強效應[11]；若ME=100%，則不存在基質效應。參照“1.5”方法進行試樣制備操作，配制1、10、100 μg/L 3個添加濃度的空白樣品標準溶液與對應濃度的溶劑標準溶液，通過目標分析物響應值的比較，計算ME值。

2 結果與分析

2.1 標準曲線

由表3可以看出，在0.1～100 ng/mL的濃度范圍內3種待測藥物呈現出良好的線性相關性，且相關系數R2均大于0.995。

表3 牛羊毛發基質線性標準曲線方程及相關系數

2.2 方法的靈敏度

在對應的保留時間內，空白試樣中基質對待測藥物無明顯干擾，響應強，峰型好，母離子和子離子完全匹配。當牛羊毛發中3種藥物添加量為0.2 μg/kg時，信噪比S/N大于3；添加量為0.5 μg/kg時，信噪比S/N大于10。3種藥物的檢測限(LOD)為0.2 μg/kg，定量限(LOQ)為0.5 μg/kg。10 μg/kg的3種β-受體激動劑的標準溶液離子色譜見圖1。牛毛空白樣品和加標樣品(添加量為10 μg/kg)離子色譜見圖2。羊毛空白樣品和加標樣品(添加量為10 μg/kg)離子色譜見圖3。

圖1 10 μg/kg的3種β-受體激動劑的標準溶液離子色譜

2.3 方法的準確度和精密度

由表4可見，在3個添加濃度下，牛毛中3種藥物的批內和批間回收率范圍為 80.2%～110.0%；批內變異系數為1.23%～8.00%，批間變異系數為2.13%～10.10%。羊毛中3種藥物的批內和批間回收率范圍為79.3%～105.0%；批內變異系數為2.04%～7.80%，批間變異系數為3.31%～12.60%。該方法穩定性和重現性好，回收率高，精密度符合殘留檢測的基本要求。

表4 牛羊毛發基質添加回收率和變異系數試驗結果

2.4 基質效應

按公式計算，克倫特羅、萊克多巴胺、沙丁胺醇的ME平均值分別為 74.8%、65.7%、71.2%，證明牛羊毛發對3種β-受體激動劑存在基質抑制效應?；|抑制效應很強，選則添加內標物消除基質抑制效應，有助于提高檢測的回收率。

3 討論

本研究中牛羊毛發樣品的處理，使用十二烷基磺酸鈉清洗劑可以在保證毛發清理徹底的前提下，去除毛發表面的雜質[2]；采用酸水解方式，可以使毛發中的藥物充分釋放進而提高藥物檢測的準確性和回收率。使用酸溶液和堿溶液水解對比，結果發現堿溶液水解后，測得藥物回收率低，經查閱文獻發現，堿溶液雖然能夠充分水解毛發，但極易造成藥物降解損失，需要調節pH值[12]。本研究采用鹽酸溶液提取后回收率明顯高，準確度高。

對比了Captiva EMR-Lipid凈化柱、QuEChERS凈化柱、HLB和MCX固相萃取柱4種快速高效凈化方式和常規固相萃取柱方法，結果發現，MCX固相萃取柱回收率穩定，但同等處理條件下，需要試劑種類多，過程繁瑣，過柱時間長，回收率明顯偏低；使用Captiva EMR-Lipid凈化柱和QuEChERS凈化柱明顯對脂質類物質作用效果明顯，無需活化和平衡直接過濾樣品，目標藥物的準確度和靈敏度高，線性關系好。因此本方法選用Captiva EMR-Lipid作為主要凈化物質，該吸附劑技術可以通過尺寸排阻和吸附劑化學兩種機制有效捕獲脂質，較好地去除脂肪、磷脂和蛋白，獲得良好的方法穩定性[13]。針對毛發多是深色的屬性，加入石墨化炭黑可以較好地清除毛發顏色，便于觀察，同時有利于保護儀器。

待測分析物的成分影響離子化的效率容易導致質譜分析中出現基質效應，因此，對色譜分離條件進行合理的優化，使待測目標物和干擾物有效分離，可以在一定程度上有效改善基質效應對測定結果的影響[14]。流動相的pH值變化可影響物質的保留時間，而且影響電離程度，本研究發現延長梯度時長，可改善基質效應的影響，待測物分離度好，保留時間居中，靈敏度高。

色譜柱的選擇也會對分離效果產生影響，同樣會產生不同的基質效應，本研究對比使用BEH C18100 mm的長色譜柱與50 mm的短色譜柱，結果發現100 mm的長色譜柱可以有效延長待測藥物的保留時間，峰型尖銳，但實驗室應用短色譜柱也可以收獲足夠穩定的回收率和高靈敏度，同時極大程度上節省了檢測時間，因此選用BEH C1850 mm的短色譜柱。

質譜條件的設置會影響方法的靈敏度。在儀器條件和方法合理的情況下，選擇合適的離子源，也可以消除基質效應的影響。本研究選擇ESI離子源模式，優化質譜參數，結合分子式結構和電噴霧信號強度，最終選擇ESI+掃描模式。

關于牛羊毛發中β-受體激動劑類的檢測方法鮮有報道，僅有部分應用于法醫學檢測人毛發中藥物殘留的方法[15-16]。閔佳玲等[3]的方法中，前處理采用常規的固相萃取柱操作復雜，耗時長，靈敏度不夠；Zhang 等[17]的方法中，適用組織和檢測藥物種類范圍有限，靈敏度低；Font等[18]的方法中，采用堿水解方式易造成藥物損失，檢測結果準確性不高。無論是尿液、血液還是可食性組織，在動物停藥一段時間后，由于新陳代謝，獸藥殘留量會低于檢測方法的檢出限，導致無法檢出，成為了不法養殖逃避監管的漏洞[19]。本研究中的方法與現有的檢測動物產品的國家標準方法進行對比[20]，前處理過程操作簡單、回收率高，靈敏度相當，完全滿足檢測需求，重要的是牛羊毛發是易于采集、轉運、貯存和提取的樣本，采集毛發樣品是非破壞性的，不會引起動物的任何傷害和疼痛，監測期長，可有效控制養殖屠宰上市全過程的藥物殘留狀況，而且本研究中應用的Captiva EMR-Lipid吸附技術可以通過尺寸排阻和吸附劑化學兩種機制有效捕獲脂質，較好地去除脂肪、磷脂和蛋白，獲得良好的方法回收率和穩定性[21]。

同位素內標法和基質匹配標準曲線法是基質效應消除的常見方法，因此本方法研究選擇這兩種方法進行對比。選擇樣品中一定量的純物質作為對照物加入待測的樣品中，然后對比待測物和標準對照物的色譜信號響應值，對待測物含量進行測定的方法稱為內標法[22]。內標法能夠在很大程度上消除試驗條件變化而產生的誤差，確保方法精密度和準確度[23]。當樣品的基質復雜時，可以采用此方法，但內標物價格比較高且不容易獲得，不適合大批量操作，但能收獲高而穩定的回收率?；|標準溶液校正也可以消除基質效應的干擾，通過比較本研究中內標法收到了滿意的結果。

4 結論

本研究建立了一種以牛羊毛發為靶組織結合EMR-Lipid技術檢測β-受體激動劑藥物殘留的高效檢測方法。該方法打破了傳統以動物可食用組織作為殘留檢測靶組織的常規思路，選取更能穩定長期存在并不需要破壞活體的毛發作為靶組織，前處理方法操作簡便，無需經過液-液萃取，采用強化除雜質技術，回收率穩定，靈敏度和準確度高。本方法對牛和羊毛發中興奮劑類藥物的檢測限為0.2 μg/kg，定量限為0.5 μg/kg，在0.1～100 ng/mL添加濃度范圍有良好的線性擬合關系，R2≥0.995。綜上，該方法具有樣品易獲取、靈敏度高、精密度好等特點，為牛羊毛發中β-受體激動劑類藥物的篩查與定量檢測提供了參考，便于開展日常檢測和保障監測。