新型鵝細小病毒徐州分離株NGPV XZ-01的分離和致病性研究

遲蘭，藺輝星

(1. 徐州生物工程職業技術學院，江蘇 徐州 221006；2. 南京農業大學，江蘇 南京 210095)

鴨短喙侏儒綜合征(short beak and dwarfism syndrome，SBDS)是由變異鵝細小病毒或稱變異小鵝瘟病毒所引起鴨的一種新型疫病。該病最早于1971年在法國半番鴨中發現[1-2]，2009年研究人員對其病原進行了分離和鑒定，確定為變異鵝細小病毒或稱變異小鵝瘟病毒[3]。

2014年以前，由于SBDS一直是零星發病，所以不被養殖戶所重視或被認為是營養不良而淘汰，但2015年2月以來，本病在中國的櫻桃谷北京鴨中暴發，此后該病呈地方性暴發流行，陸續在國內的騾鴨、麻鴨等品種發生[4-7]，呈現短時間內迅速擴張的趨勢，養殖場一旦遭到感染，即會造成非常嚴重的經濟損失。2019年，SBDS在埃及和波蘭開始流行，主要感染騾鴨和櫻桃谷北京鴨[8-9]。相關的流行病學調查發現，該病不僅會危害半番鴨，在各地的櫻桃谷肉鴨也有大范圍流行，其發病率可達10%～100%，死亡率為 2%～10%，僵鴨淘汰率或殘鴨率高達20%～80%，給養鴨業造成很大的經濟損失[10]。自2014年開始，在江蘇省徐州市及周邊養殖的商品半番鴨中開始出現一種以喙短、舌長、易骨折、發育障礙為主要臨床特點的疾病[11]，后經有關學者研究確定其病原為變異的小鵝瘟病毒。由于沒有特效的藥物，所以對SBDS的治療主要為對癥治療，可選用阿莫西林配合補充電解質、維生素、鈣及維生素D等營養物質，防止繼發感染的同時提高免疫力[12]。

2021年6月，江蘇徐州某商品半番鴨養殖場養殖肉鴨約6 000只，但飼養過程中發現，該場肉鴨在養殖10多天后出現采食量下降的現象，且死淘率較以往高。飼養20 d部分肉鴨陸續出現上下喙變短、舌頭稍外露、易骨折、發育緩慢等癥狀。據統計6 000只肉鴨中，前期死亡約150只，出現侏儒體質的鴨約有1 500多只，嚴重影響該批次鴨的上市。臨床表現疑似為SBDS，為確定該場所發疾病的病原及其致病性，本研究從該養殖場表現為短喙、侏儒的病鴨體內采集肝臟、脾臟、小腸等樣品送實驗室進行分析檢測。經PCR檢測、鴨胚接種、尿囊液傳代、電鏡檢查、胚體病理學切片、動物接種試驗等實驗室檢測方法，最終診斷該場所發疾病為SBDS，并在此基礎上，分離到1株新型鵝細小病毒徐州分離株。

1 材料與方法

1.1 主要材料

發病鴨場出現侏儒癥狀的病鴨，非免疫種鴨蛋購自于哈爾濱獸醫研究所；非免疫雛鴨由本實驗室孵化所得。

DNA、RNA提取試劑盒均購自Axygen公司；瓊漿糖Agarose購于Agarose公司；反轉錄試劑盒、PremixTaq、 50×TAE Buffer、DNA Maker、EB 染料等均購自寶生物工程(大連)有限公司；引物由寶生物工程(大連)有限公司合成。HE染色劑、甲醛、酒精等試劑購自生工生物工程(上海)股份有限公司。

1.2 病料采集、處理及病原檢測

于超凈工作臺內剖檢侏儒鴨，無菌采集病鴨脾臟、肝臟、腎臟以及十二指腸等組織，在滅菌研缽中進行剪碎，再加入適量滅菌生理鹽水進行充分研磨，勻漿后分裝在1.5 mL的指形管內并放置-70 ℃冰箱中反復凍融3次，于4 ℃ 2 000 r/mim低速離心10 min后吸取上清液至離心管中，4 ℃ 2 000 r/mim離心10 min吸取上清液。將上清液經0.22 μm濾器過濾至滅菌離心管中，備用。

根據Axygen病毒DNA、RNA提取試劑盒說明書分別提取上述濾液的DNA和RNA，按照寶生物反轉錄試劑盒說明書進行RNA的反轉錄，參照文獻[13-14]，分別用番鴨細小病毒(MDPV)、小鵝瘟病毒(GPV)、鴨瘟病毒(DPV)、鴨病毒性肝炎病毒Ⅰ型(DHV-Ⅰ)、鴨坦布蘇病毒(DTMUV)與鴨呼腸孤病毒(DRV)特異性引物對DNA、反轉錄DNA樣品進行PCR或RT-PCR檢測，引物信息見表1。

表1 檢測病毒用相關引物信息

1.3 病毒分離培養

提前孵化非免疫半番鴨種蛋，待鴨胚孵化至12日齡，取上述1.2中所獲無菌上清濾液按照0.1 mL/胚，經尿囊腔接種12日齡非免疫胚10枚，接種后置于37 ℃培養箱培養7 d，棄去24 h內死亡鴨胚，每天上、下午2次照蛋，觀察鴨胚。如有死亡，及時無菌收獲其尿囊液；如沒有死亡則盲傳6～10代，直至出現胚體特異性死亡，收獲其尿囊液，置-70 ℃冰箱保存備用。

1.4 分離培養樣本PCR鑒定

將1.3中出現特異性死亡胚體進行GPV病原鑒定[14]，引物見表1中GPV-F、GPV-R對應序列。

PCR反應體系為DNA模板(25 ng/μL)6 μL，50×TAE Buffer 1 μL，正反向上下游引物(10 pmol/μL)各1 μL，PremixTaq1 μL，加滅菌ddH2O 至50 μL。

反應程序為：95 ℃預變性 5 min；95 ℃變性50 s，62 ℃退火35 s，70 ℃延伸60 s，共30個循環，最后70 ℃終延伸10 min。反應結束后，PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測并觀察。

1.5 尿囊液電鏡檢查

將1.3中收獲的出現特異性死亡胚體尿囊液混合液20 mL，經4 ℃，12 000 r/mim，離心10 min去除雜質，吸取上清液至新的離心管再次經4 ℃，150 000 r/mim超速離心2 h，棄去上清液，將沉淀重懸后經磷鎢酸負染，在電鏡下觀察病毒粒子。

1.6 病毒滴度測定

提前孵化非免疫種蛋至第12天，取1.3中收獲的出現特異性死亡胚體的尿囊液1 mL，使用滅菌生理鹽水對其進行倍比稀釋(10-1～10-7)，取每個稀釋倍數的病毒液經尿囊腔接種非免疫胚(0.1 mL/胚)各10枚，置37 ℃培養箱培養7 d，接種后每天上、下午各照蛋1次，棄去24 h內死亡胚，每天記錄各稀釋度病毒所致鴨胚死亡數，按Reed-Muench法計算病毒的半數鴨胚致死量(ELD50)。

1.7 鴨胚組織的病理學檢查

分別采集1.3中孵化過程中出現特異性死亡胚體的心臟、肝臟、腎臟、脾臟、腦、皮膚等組織，按照病理組織切片的制作方法進行依次進行固定、沖水、脫水、透明、浸蠟、包埋、切片、展片和貼片等，完成組織切片的制作。然后進行脫蠟，使用HE染色劑進行染色，染色完畢進行封片，放在37 ℃溫箱中待中性樹膠干后，在光學顯微鏡下進行觀察，記錄病理檢測結果。

1.8 動物回歸試驗

將購入的非免疫鴨種蛋200枚在孵化箱中進行孵化，出殼后，移至消毒后的隔離器中飼養。將140羽剛出殼的健康非免疫雛鴨隨機分為3組，依次命名為健康對照組(20只)、3日齡攻毒組(60只)和7日齡攻毒組(60只)，分別飼養于不同的隔離器中，由專人負責飼養、觀察并記錄體重增長情況和臨床癥狀等。

分別對3日齡攻毒組、7日齡攻毒組采用皮下注射方式接種病毒0.2 mL，同時對健康對照組皮下注射接種滅菌生理鹽水0.2 mL，攻毒后每天2次觀察試驗鴨的精神狀況，及時記錄臨床癥狀、發病率和死亡情況。分別于14日齡與28日齡測定每只試驗動物的喙長，稱量每只試驗動物的體重。從14日齡開始，每天分別在3個試驗組隨機取10只鴨測量體重變化。飼養至28日齡將所有試驗鴨安樂死并進行剖檢，分別從各組取1只試驗鴨，用于X射線檢測。

1.9 統計分析

試驗原始數據采用 Excel 2013進行處理，然后導入SPSS 22版本軟件進行方差分析。試驗數據用“平均值±標準差”表示。

2 結果與分析

2.1 發病鴨病原學檢測

采集病鴨脾臟、肝臟、腎臟、十二指腸等樣本經處理，PCR、RT-PCR擴增及電泳后，僅GPV呈陽性(見圖1)，MDPV、DPV、DHV-Ⅰ、DTMUV與DRV均為陰性。

M. DL1000 DNA Marker；1. MDPV；2. GPV；3. DPV；4. DHV-Ⅰ；5. DTMUV；6. DRV。

2.2 病毒鴨胚接種

病料研磨、凍融、過濾除菌后接種12日齡非免疫鴨胚，盲傳6代，第7代接種96 h后，鴨胚陸續出現死亡，死亡鴨胚全身廣泛出血、發育遲緩，體型較正常鴨胚明顯減小，出現侏儒胚(圖2)。繼續傳至第8代時，胚體大多數在接種96～160 h內發生死亡，死亡胚體全身多處有明顯出血，喙變短，體型較對照組小很多(圖3)。

A.接種96 h后死亡胚；B.同日齡鴨胚對照。

A.接種96 h后死亡胚；B.同日齡對照。

2.3 接種鴨胚尿囊液PCR鑒定

將盲傳第7、8代(出現特異性死亡)的胚體尿囊液混合、提取DNA后，使用GPV的引物對其進行PCR鑒定，均為GPV陽性(圖4)。

M. DL1000 DNA Marker；1. 第7代；2. 第8代；3. 陽性對照；4. 陰性對照。

2.4 病毒培養液的電鏡檢查

各取第7、8代病毒接種死亡胚的尿囊液10 mL混合，共20 mL，經高速離心、重懸及磷鎢酸復染后，在電鏡下觀察到多個圓形、無囊膜，直徑為15～30 nm的病毒粒子(圖5)，外觀與典型GPV病毒粒子非常相似。將本試驗分離的病毒命名為新型鵝細小病毒徐州分離株NGPV XZ-01。

圖5 鴨胚尿囊液中的病毒粒子

2.5 分離病毒ELD50的測定

將第7代病毒培養液(特異性死亡胚的尿囊液)進行梯度稀釋并接種非免疫鴨后，按Reed-Muench法計算病毒的ELD50，第7代次病毒滴度達5.7 lgELD50/mL。

2.6 死亡胚體的病理學檢查

采集第7、8代死亡胚體的各內臟器官，制作病理切片并觀察，在死亡胚體的肝臟(圖6)、腎臟(圖7)和心臟(圖8)組織中，均可見炎性細胞浸潤和壞死。

紅色箭頭為肝細胞，黑色箭頭為肝竇淤血，綠色箭頭為炎細胞浸潤。

黑色箭頭為腎小球，紅色箭頭為腎小管，綠色箭頭為細胞變性、壞死和脫落，間質出血。

黑色箭頭為心肌纖維排列紊亂，變性、壞死和斷裂，紅色箭頭指示間質可見出血。

2.7 動物回歸試驗

將本試驗分離到的NGPV XZ-01株采用皮下注射的方式分別接種3日齡及7日齡的非免疫雛鴨。3日齡攻毒組試驗鴨在接種的第3天開始逐漸出現精神沉郁、食欲不振、腹瀉、怕冷扎堆、喜臥、羽毛粗亂及運動障礙等臨床癥狀，體型明顯偏小，部分病鴨出現癱瘓及死亡。攻毒后的第16天，試驗鴨出現舌頭外露的癥狀。剖檢發現試驗鴨的病理變化多表現在消化道，肉眼觀察病變主要為泄殖腔腫大，腸道漿膜輕微水腫，腸內容物稀薄。7日齡攻毒組在接種后第5天出現精神稍差、食欲減退、輕微腹瀉，糞便顏色為灰黃色，部分鴨扎堆喜臥，體型較對照組偏小，但優于3日齡攻毒組。少量鴨出現癱瘓及死亡。動物飼養至20日齡后，攻毒組試驗鴨陸續出現上下喙變短、舌頭外露、生長發育緩慢等癥狀。對照組無異常。

根據臨床觀察統計，3日齡攻毒組發病率90%，死亡率11.6%；7日齡攻毒組發病率76.6%，死亡率6.6%；對照組無發病與死亡，詳細結果見表2。

表2 動物回歸試驗臨床結果統計 只

體重測量結果顯示，22日齡時試驗鴨平均體重，3日齡攻毒組較對照組下降55%左右，7日齡攻毒組較對照組下降42%左右，差異顯著(P<0.05)。試驗鴨體重變化數據見表3。

表3 試驗鴨體重變化 g

病鴨腸道病理切片顯示，十二指腸腸絨毛頂端上皮細胞壞死、不同程度脫落，部分腸腺壞死(圖9)。

A.3日齡攻毒組；B.7日齡攻毒組；C.對照組。

3 討論

1970年左右，SBDS最先在法國西南部的半番鴨中出現[15]。之后，在波蘭等地也出現了類似的病例。國內較早的病例則可以追溯到2008年下半年的福建。2008年之后，全國各地的半番鴨養殖中，短喙、長舌的癥狀時有發生，但都未引起嚴重的感染。直至2015年，SBDS在山東、四川、河南等多地暴發，發病率達5%～20%[16]，才引起養殖業的重視。研究顯示，NGPV與經典型GPV之 間擁有特征性的核苷酸和氨基酸差異[17]。直到近幾年才完全獲得感染半番鴨的能力，從而進一步導致了SBDS在全國范圍內的大暴發。傳播方式方面，已有研究表明SBDS可以通過直接接觸(同居)和呼吸道(空氣傳播)感染[18]，而空氣傳播能力則較弱，這一研究結果，使臨床預防效果得以提高。

相關研究表明，野毒感染所導致的SBDS發病率為10%～100%，死亡率2%～10%，僵鴨淘汰或殘鴨率20%～80%[1]，主要導致雛鴨上、下喙變短，舌頭外露、生長不良，易骨折等癥狀[19]。由于本病的病原為一種新型小鵝瘟病毒，患鴨不具備經典小鵝瘟病毒所特有的“腸栓塞”病理變化[20]。本試驗的臨床及動物回歸試驗結果顯示，分離的新型鵝細小病毒徐州分離株(NGPV XZ-01株)在接種非免疫雛鴨后，攻毒試驗鴨的發病率為83.3%，死亡率9.1%，主要癥狀表現為生長發育明顯受阻、大部分的試驗半番鴨成為“僵鴨”，同時伴有喜臥扎堆、拉稀糞、運動障礙、癱瘓、易骨折等癥狀。隨著日齡增長，舌頭外露及上下喙變短的癥狀也逐漸表現，平均體重也顯著下降，與上述研究結果報道一致。

4 結論

針對2021年江蘇徐州某商品半番鴨養殖場的肉鴨所發疾病，本研究通過對病死鴨組織進行PCR檢測，非免疫鴨胚接種、傳代，胚體尿囊液電鏡觀察以及動物回歸試驗等臨床及實驗室診斷，確定導致該場所發疾病為SBDS。分離到1株本地流行毒株 NGPV XZ-01株，該毒株不僅可以導致非免疫鴨胚胚體出血及死亡，在接種非免疫雛鴨后，也會導致新生雛鴨出現短喙、侏儒、腹瀉甚至死亡等癥狀，對1周齡以內非免疫雛鴨的致病率達76%以上，死亡率達6%以上，影響增重達40%以上，且感染年齡越小，發病率、病死率及增重影響越嚴重。研究表明，本次試驗所分離到的NGPV XZ-01株對半番鴨具有很強的致病性，也為新型小鵝瘟病毒的進一步研究提供了理論支持。