日本腦炎病毒感染睪丸間質細胞對干擾素調節因子3相關信號通路的影響

陳閶崢，湯德元，羅柳，廖正波，袁盛林，陳旭

(貴州大學動物科學學院，貴州 貴陽 550025)

日本腦炎(Japanese encephalitis，JE)是由日本腦炎病毒(Japanese encephalitis virus，JEV)感染引起的一種人畜共患病，因其于1934年首次于日本被分離而得名[1]，在自然界中主要以人-蚊-豬的循環模式進行傳播[2]。感染JEV后臨床上主要表現出腦炎、腦膜炎和脊髓炎等神經系統癥狀[3]，病死率高達30%，30%～50%的患者存在永久性的中樞神經系統損傷后遺癥[4]。豬是JEV最重要的自然增殖宿主，當豬感染JEV后，母豬會出現流產、產死胎，公豬出現睪丸單側或雙側腫大，精液帶毒、喪失種用能力[5]。

模式識別受體(pattern recognition receptors，PRRs)家族能夠識別來自細菌或真菌、病毒和原生動物的病原體相關分子模式(PAMPs)，是宿主構成先天免疫系統的第一道防線[6]。病原體被先天免疫受體結合的配體識別并觸發不同的先天信號通路，從而啟動一系列宿主防御機制。先天免疫受體家族包括視黃酸誘導基因Ⅰ型(retinoic acid-inducible gene Ⅰ like receptors，RIG-Ⅰ)，Toll樣受體(Toll-like receptors，TLRs)，NOD樣受體(NOD-like receptors，NLRs)和C型凝集素受體(C-type lectin receptors，CLRs)[7]，作為識別PAMPs的進化保守蛋白，它們是先天免疫反應的關鍵，也是先天和適應性免疫反應的關鍵調節因子[8]。

干擾素調節因子3(interferon regulatory factors 3，IRF3)是調節干擾素(IFN)基因表達的重要蛋白質分子，作為PRRs多個通路下游的信號調節因子和轉錄因子發揮作用，在Ⅰ型IFN以及多種IFN刺激基因(ISG)的產生中起關鍵作用[9]。IRF3在不同來源的細胞中普遍表達，并以靜止狀態存在于細胞質中。在PRRs感知病原體后，IRF3通過TANK結合激酶1(TANK binding kinase 1，TBK1)或核因子κB抑制物激酶ε(inhibitor of nuclear factor κB kinase subunit epsilon，IKKε)的羧基末端磷酸化被激活，從而動員 IRF3 進行二聚化和核轉位[10]。

有研究表明，JEV感染后可激活RIG-Ⅰ和TLR3受體，但有關其在JEV感染過程中引發的先天免疫的作用機制研究尚不清楚。因此，本研究通過建立JEV感染睪丸間質細胞的模型，探討JEV對IRF3相關信號通路的影響，為研究JEV的致病機制提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 病毒與細胞

JEV GZ株由本實驗室分離鑒定并保存，小鼠睪丸間質細胞TM3購自武漢普諾賽生物技術公司。

1.2 主要試劑

DMEM/F12培養基、胎牛血清均購于Gibco公司；RIG-Ⅰ、IRF3、p-IRF3單克隆抗體購于CST公司；TLR3多克隆抗體購于Abcam公司；兔抗GAPDH單克隆抗體、HRP標記山羊抗兔二抗購于生工生物工程(上海)有限公司；TRNzol Universal總RNA提取試劑購于天根生化科技(北京)有限公司；1st Strand cDNA Synthesis Kit、One Step RT-PCR Kit購于寶生物公司；FastSYBR Mixture購于江蘇康為世紀生物科技股份有限公司。

1.3 細胞培養及感染

用含10%胎牛血清、1%青鏈霉素雙抗的DMEM/F12完全培養基，于37 ℃，5% CO2條件下培養TM3細胞，待細胞生長到布滿細胞瓶80%時，將細胞轉移至6孔板內進行培養，每孔約2.5×105個細胞。

待細胞貼壁后，每孔按感染復數(MOI)=1加入病毒液，37 ℃培養箱內吸附1 h后棄去上清液，用PBS清洗3次后，重新加入含2%胎牛血清的DMEM/F12維持液于37 ℃培養箱內繼續培養，觀察細胞病變情況于不同時間段收集各組細胞上清液，使用病毒RNA提取試劑盒提取上清液中的病毒RNA。使用實驗室前期根據JEV NS1基因設計的相關引物(F：5′-GGAAGCGGGTGGATAGGT-3′；R：5′-GTAGTGGTGACCGAAGGG-3′)[11]，進行一步法RT-PCR檢測JEV核酸。反應條件為：50 ℃，40 min反轉錄；95 ℃，5 min預變性；95 ℃ 45 s，56 ℃ 45 s，72 ℃ 45 s，共40個循環；72 ℃ 10 min。產物使用1%瓊脂糖凝膠進行TAE電泳，驗證JEV能否感染TM3細胞。

A.對照組；B.12 h；C.24 h；D.48 h。

M. DL2000 Marker；1. JEV NS1基因；2. 陰性對照。

1.4 熒光定量PCR 檢測

使用12孔板鋪板TM3細胞，分為對照組以及12 h、24 h、48 h攻毒組，每組3孔，攻毒組按相應時間每孔加入MOI=1的病毒液，對照組加入DMEM。達到接毒時間后，將不同接毒時間組細胞棄去上清液，PBS清洗3次，加入TRNzol試劑，提取細胞總RNA，并使用1st Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒反轉錄為cDNA，用于進行熒光定量PCR檢測。熒光定量PCR反應的引物序列如表1。熒光定量PCR反應條件如下：預變性95 ℃ 20 s；95 ℃ 3 s，60 ℃ 30 s，共40個循環。熔解曲線分析：95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 15 s。以GAPDH的mRNA水平為基準，采用2-ΔΔCt分析法計算各樣本中目的基因的相對表達水平。

表1 熒光定量PCR引物序列

1.5 Western blot檢測

使用6孔板鋪板TM3細胞，分為對照組和JEV攻毒組，共4組，每組3孔，攻毒組每孔加入MOI=1的病毒液，對照組加入DMEM。達到接毒時間后，將不同接毒時間組細胞棄去上清液，PBS清洗3次，加入蛋白裂解液進行裂解，離心取上清液，反應于冰上進行，并用BCA法測定蛋白濃度。用SDS-PAGE分離蛋白質，并轉移到PVDF膜上。將膜在5%脫脂奶中封閉1.5 h，加入抗體4 ℃孵育過夜。用TBST緩沖液洗膜3次，室溫孵育二抗1 h，再次用TBST緩沖液洗膜3次。用ECL顯色劑顯影。

1.6 統計分析

應用統計分析軟件Graphpad Prism 8進行分析，多組間比較使用單因素方差分析(One-way ANOVA)。數據用“平均值±標準差”表示。

2 結果與分析

2.1 細胞培養及感染

將JEV接種TM3細胞后每隔12 h觀察細胞狀態，見圖1。觀察到病毒接種12 h后細胞開始出現病變，少量細胞出現變圓和空泡樣病變；隨著接種時間延長大量細胞皺縮，裂解死亡，死亡細胞從壁上脫落，細胞之間出現空隙，連接松散。連續傳代后JEV依然能穩定的引起TM3細胞病變。

2.2 RT-PCR擴增JEV NS1基因

用病毒核酸提取試劑盒提取感染細胞上清液中病毒核酸，使用本實驗室前期設計的JEV NS1引物，進行一步法RT-PCR擴增。結果可見在831 bp出現目的條帶(圖2)，陰性對照無條帶，證明在睪丸間質細胞中檢出JEV核酸，與預期相符。

2.3 JEV感染TM3細胞NS1蛋白鑒定

Western blot檢測結果如圖3所示，在JEV感染后的TM3細胞樣品中可檢測到NS1蛋白條帶，而對照組無條帶，說明JEV已感染TM3細胞。

1. 對照組；2. 攻毒組。

2.4 IRF3通路相關因子的mRNA表達水平檢測

如圖4可見，各引物擴增曲線Ct值均在15～35范圍內；熔解曲線均為單峰，證明擴增特異性良好。熒光定量PCR結果如圖5所示。RIG-Ⅰ的mRNA水平在感染后12 h時表達顯著上升(P<0.05)，24和48 h有所回落，但與對照組相比無顯著差異；TLR3的mRNA水平在感染后均出現明顯增加，隨著感染時間增加呈現下降趨勢，但無顯著性差異；IRF3的mRNA水平在感染后12和24 h出現顯著升高(P<0.05)，但48 h時出現下降。因此，選擇12 h作為后續試驗的細胞感染時間。

*表示與對照組相比差異顯著(P<0.05)。下同。

*表示P<0.05，**表示P<0.01，***表示P<0.001。

2.5 IRF3通路相關因子的蛋白表達水平檢測

Western blot檢測JEV感染TM3細胞后12 h的蛋白表達水平變化。由圖5可見，與對照組相比，TLR3、RIG-Ⅰ、IRF3蛋白表達水平均上調，與TLR3、RIG-Ⅰ、IRF3的mRNA轉錄水平變化一致，其中RIG-Ⅰ和IRF3蛋白表達量顯著上調(P<0.05)，TLR3蛋白表達量極顯著上調(P<0.01)；而IRF3的磷酸化水平也出現顯著上調，與對照組相比有極顯著差異(P<0.001)。可見JEV入侵細胞能夠激活RIG-Ⅰ和TLR3并誘導IRF3蛋白表達和磷酸化水平顯著上升。

2.6 IFN-β的mRNA表達水平檢測

通過熒光定量PCR方法分別檢測JEV感染TM3細胞后對照組與攻毒組中IFN-β的mRNA轉錄水平，引物擴增曲線Ct值均在15～35范圍內；熔解曲線均為單峰，證明擴增特異性良好。結果如圖6所示，與對照組相比，感染JEV后IFN-β的轉錄水平出現顯著升高(P<0.05)，證明JEV感染TM3細胞后可激活IRF3的磷酸化，而p-IRF3入核后調控IFN-β基因，上調IFN-β的表達。

圖6 JEV感染后IFN-β的mRNA表達情況

3 討論

JEV感染一直困擾我國生豬養殖業，會導致公豬出現睪丸腫脹，嚴重的充血和炎癥反應，臨床上多見為感染豬單側或雙側睪丸腫脹。目前關于JEV的致病機制研究主要圍繞在于其引發的中樞神經系統炎癥，而關于生殖系統的研究相對較少[12]。睪丸防御病毒進入血液的第一道防線是睪丸間質細胞和睪丸巨噬細胞。因此，本研究以睪丸間質細胞為研究對象，探究感染JEV后睪丸間質細胞內的抗病毒相關通路激活情況。

目前為止，對于病毒的致病機制和信號轉導方面的研究多是通過體外細胞模型來開展的，而JEV對某些細胞如小鼠小膠質細胞的感染能力較弱，因此選擇合適的細胞系對于JEV致病機制的研究至關重要。王子暢[13]通過建立UBE2J1敲除的PK-15細胞系開展研究，發現敲除UBE2J1基因后能夠抑制JEV的復制，為JEV的防治提供理論基礎。本試驗使用TM3細胞為細胞模型，以MOI=1劑量接種后，在感染12 h可觀察到細胞病變，并通過RT-PCR和Western blot技術，檢出JEV NS1基因和蛋白條帶。NS1是JEV中高度保守的非結構蛋白，其在JEV病毒粒子的組裝和釋放及JEV免疫逃避方面均有重要作用[14]，說明JEV可感染TM3細胞并在其中復制，可以開展后續試驗。

先天免疫是當人體遭受病毒侵害時抵抗病毒的第一道防線，而其能夠快速發揮作用的原因就在于機體內多樣的PRRs[15]。在JEV感染的免疫反應中，主要依賴于細胞質中的RIG-Ⅰ和TLR3，通過識別并結合JEV在復制過程中產生的dsRNA激活[16]，引發下游系列信號轉導級聯反應，激活IRF3、NF-κb等信號轉導分子，最終誘導Ⅰ型IFN、炎癥因子等細胞因子的產生，抑制病毒的復制和傳播[17]。本研究通過JEV感染TM3細胞后，檢測出RIG-Ⅰ和TLR3的mRNA和蛋白表達水平均有顯著上調，表明JEV在感染TM3細胞后成功激活了RIG-Ⅰ和TLR3。

IRF3是激活Ⅰ型IFN的重要啟動子，通常在細胞內并不表現出活性，當被RIG-Ⅰ和TLR3激活后，C端中絲氨酸(Ser)和蘇氨酸(Thr)殘基發生磷酸化，并轉入細胞核內，啟動IFN-β的分泌[18-19]。已有研究表明，在使用JEV感染豬睪丸細胞后，通過miRNA的表達譜系差異分析，發現miR-23a的表達量有顯著升高[20]。miR-23a是一種細胞內部的小型非編碼RNA，在先天免疫中通過靶向增強IRF3的激活，來實現IFN-β的誘導表達，達到抑制病毒復制作用[21]。本試驗結果與之類似，證明JEV感染TM3細胞可激活RIG-Ⅰ/TLR3-IRF3信號通路，引起IRF3的mRNA轉錄水平上調，IRF3和p-IRF3的蛋白表達上調，并最終誘導IFN-β的表達上調。。

4 結論

通過建立JEV感染TM3細胞的體外感染模型，發現JEV感染后可激活RIG-Ⅰ/TLR3-IRF3通路，引起IRF3磷酸化，誘導細胞IFN-β表達上調，啟動了TM3細胞先天性抗病毒反應，抑制病毒的復制。