脂多糖誘導雛雞發熱及肺炎模型建立

金科旭，馮慧勇，阿力米熱·阿布都外力，海婷玉，束佳敏，王天琪，戴小華

(新疆農業大學動物醫學學院，新疆 烏魯木齊 830000)

家禽養殖是新疆地方傳統基礎及特色經濟產業，也是新疆各地區加快現代化農業農村建設的重要基石。規模化養殖中由于通風消毒等問題會造成N2O、NH3等有害氣體不能及時處理，導致家禽呼吸道系統疾病的普遍發生[1]。發病時往往伴隨發熱、咳嗽、呼吸困難等癥狀[2]，嚴重時會誘發呼吸道系統的組織性損傷，繼而影響家禽生產甚至導致家禽死亡，造成嚴重的經濟損失。

實驗動物模型是深入開展動物試驗或藥物研究中藥效考察重要的一環，常見的動物模型建立方式包括物理法(缺血再灌輸)、化學法(二甲苯)、生物法(細菌、病毒)等[3-5]。脂多糖(LPS)作為革蘭陰性菌細胞壁的組成部分，因誘導的炎癥具有許多傳染性炎癥的特征，所以常被用作抗菌、抗炎藥物研發中動物模型的制備[6-7]。Zhang等[8]為研究白鵠湯解熱機制，靜脈注射LPS建立兔發熱模型；寶冬艷[9]通過腹腔注射LPS建立小鼠發熱模型；Puig等[10]通過酸化LPS誘導建立小鼠肺炎模型。大量文獻表明，與哺乳動物相比較，雞對于LPS具有一定的耐受性，即相對于哺乳動物的炎癥建模甚至致死濃度可能不會誘導雞的炎癥模型建立，僅僅參考哺乳動物的發熱及炎癥模型濃度可能無法順利誘導雞產生發熱或炎癥反應[11-12]。因此，本試驗以三黃雞為試驗動物，通過注射不同劑量LPS，考察LPS誘導雞發熱及肺損傷模型的最佳劑量，為家禽解熱抗炎藥物的研發提供建模數據。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

LPS(O55：B5，L2880)購自Sigma公司；TriQuick Reagent總RNA提取試劑購自北京索萊寶科技有限公司；FastKing RT Kit(With gDNase)、SuperReal PreMix Plus (SYBR Green)購自天根生化科技(北京)有限公司；2×TaqMasterMix(Dye)購自江蘇康為世紀生物科技股份有限公司。

1.2 主要儀器

實時熒光定量PCR系統(美國ABI公司，型號：ABI 7500 Fast)，化學法光凝膠成像儀(以色列DNR生物影像系統有限公司，型號：MicroChemi)，多功能酶標儀(美國伯騰儀器有限公司，型號：SynergyTMHTX)，電泳儀(北京六一儀器廠，型號：DYCP-31DN型)，臺式高速冷凍離心機(湖南恒諾儀器設備有限公司，型號：2-16R型)。

1.3 試驗動物及分組

1.3.1 動物

1日齡健康三黃雞共20只，購自新疆天康畜牧有限公司。自由采食飲水，定時清理雞舍衛生并每日消殺，雞舍內勤通風。按標準飼養技術適應性飼養21 d。

1.3.2 分組及采樣

20只三黃雞隨機分為4組：空白對照組和2.5 mg/kg、5.0 mg/kg和10.0 mg/kg LPS劑量組，每組5只?？瞻捉M腹腔注射生理鹽水以作對照，LPS各劑量組以腹腔注射方式建模。給藥后要觀察雛雞臨床表現，LPS誘導后24 h翅下采血，分離血清4 ℃保存備用；采集肺臟用冷生理鹽水沖洗血液并用濾紙吸干水分，右肺用于濕干比測定；部分左肺用中性甲醛固定液固定，用于組織學觀察；剩余左肺液氮速凍后于-80 ℃保存備用。

1.4 試驗方法

1.4.1 臨床表現及死亡率

實時觀察并記錄LPS誘導后飲食、采水、排便、被毛及精神狀態等情況，同時記錄雛雞死亡情況，根據數據進行統計分析。

1.4.2 體溫及組織濕干比測定

溫度計記錄LPS誘導0、1、2、3、4、6、8、12、24 h雛雞直腸溫度的變化，并于24 h處死雛雞，將右肺用生理鹽水沖洗后濾紙吸干水分，肺組織濕重稱重記錄；烘箱60 ℃烘干48 h致重量不再變化，干重稱量記錄。

肺臟濕干比=肺臟濕重/肺臟干重。

1.4.3 雛雞肺組織HE染色

將組織從固定液取出并稍作修整，以75%、85%、95%、100%乙醇脫水，經二甲苯透明、浸蠟包埋、修蠟切片、烘干脫蠟、HE染色、脫水透明、樹脂封片方式制作病理切片。

1.4.4 ELISA檢測細胞因子水平

分離血清并將采集的肺組織充分研磨勻漿后，采用ELISA法檢測肺組織中腫瘤壞死因子α(TNF-α)含量、環氧合酶-2(COX-2)活性以及血清中細胞因子TNF-α、白細胞介素-1β(IL-1β)、IL-6、COX-2、前列腺素E2(PGE2)、IL-10含量。ELISA試劑盒購自江蘇酶標生物科技有限公司。

1.4.5 熒光定量PCR檢測TNF-α mRNA表達

TriQuick Reagent總RNA提取試劑提取肺組織總RNA，按照試劑盒將mRNA逆轉錄為cDNA，得到的cDNA用于熒光定量PCR檢測TNF-α mRNA表達。引物序列如表1所示。熒光定量PCR反應體系為：cDNA模板2 μL，上下游引物各0.6 μL，2×SuperReal PreMix Plus 10 μL，ROX液0.6 μL，dd H2O 6.4 μL，體系為20 μL。RT-PCR擴增條件為：95 ℃ 15 min；95 ℃ 10 s，62 ℃ 32 s，40個循環。mRNA 的相對轉錄量采用2-ΔΔCt方法計算，以β-actin為內參基因。

表1 熒光定量PCR引物序列

1.5 數據統計與分析

通過SPSS 19.0統計分析軟件對均數進行單因素方差分析(One-way ANOVA，LSD)，GraphPad軟件繪圖，結果為“平均值±標準誤”。P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著。

2 結果

2.1 LPS對雞臨床表現的影響

腹腔注射不同劑量LPS后雛雞的臨床表現和生存曲線見圖1。LPS誘導后，所有LPS劑量組雛雞出現嗜睡、精神沉郁、閉眼扎堆、不愿走動且對外界刺激反應遲鈍等臨床癥狀。10.0 mg/kg LPS劑量組誘導的雛雞于2、3、6 h出現死亡現象，存活曲線見圖1。8 h后所有LPS組未再出現雛雞死亡，臨床癥狀緩解，開始飲水進食。由于10.0 mg/kg LPS劑量組雛雞死亡率高于50%，因此后續試驗采用空白組和2.5 mg/kg、5.0 mg/kg LPS劑量組進行研究。

圖1 不同濃度LPS對雛雞存活率的影響

2.2 LPS對雞體溫的影響

LPS對雞體溫的影響結果如圖2所示。與空白組相比，LPS各劑量組均能提高雞的體溫。2.5 mg/kg劑量組體溫于3 h達到最高(P<0.01)，并持續至8 h顯著高于空白組(P<0.05)，隨后體溫逐漸恢復，于24 h恢復正常；5.0 mg/kg劑量組于6 h達到最高(P<0.01)，隨后體溫逐漸恢復，直到24 h體溫仍高于空白組(P<0.05)。

與空白組相比，#表示差異顯著(P<0.05)，##表示差異極顯著(P<0.01)。下同。

2.3 LPS對雞肺臟濕干比的影響

LPS對雛雞肺濕干比的影響結果如圖3所示。LPS各劑量組肺組織濕干比值較空白組極顯著升高(P<0.01)，LPS各劑量組對雛雞肺臟濕干比值的影響呈劑量依賴性，但差異不顯著(P>0.05)。

圖3 不同濃度LPS對雛雞肺臟濕干比的影響

2.4 LPS對雞肺組織結構的影響

LPS對雞肺組織學變化的影響如圖4所示?？瞻捉M肺毛細血管結構完整，肺房中無紅細胞及炎性細胞浸潤(圖4A)；2.5 mg/kg LPS劑量組中肺毛細血管壁增厚并且有紅細胞浸潤，淋巴組織間隙可見嗜酸性粒細胞等炎性細胞浸潤(圖4B)；5.0 mg/kg LPS劑量組中可見肺房結構破損嚴重，平滑肌束增厚，肺毛細血管及淋巴組織間隙中有大量紅細胞浸潤，不能觀察到肺小葉之間清晰的界限，大量粒細胞及巨噬細胞在肺組織中出現(圖4C)。

A.空白組；B. 2.5 mg/kg LPS組；C. 5.0 mg/kg LPS組；紅色箭頭為紅細胞浸潤，黑色箭頭為炎性細胞浸潤。

2.5 LPS對細胞因子含量/活性的影響

LPS對肺組織中炎癥因子含量及活性的影響結果見表2。與空白組相比，LPS各劑量組肺組織中炎癥因子TNF-α含量及COX-2活性極顯著增加(P<0.01)；隨著LPS濃度的升高，5.0 mg/kg與2.5 mg/kg LPS組相比，TNF-α含量及COX-2活性也極顯著升高(P<0.01)。

表2 雛雞肺臟炎癥因子檢測

LPS對血清中細胞因子含量的影響結果如表3。經LPS誘導，血清中2.5 mg/kg LPS組炎癥因子TNF-α、IL-6含量顯著升高(P<0.05)，IL-1β、COX-2、PGE2含量極顯著升高(P<0.01)。隨著LPS劑量增加，5.0 mg/kg LPS組炎癥因子除IL-10的含量均極顯著升高(P<0.01)，其中IL-1β含量顯著高于2.5 mg/kg LPS組(P<0.05)。LPS誘導后抗炎因子IL-10含量顯著降低(P<0.05)，當LPS濃度達到5.0 mg/kg時，IL-10含量極顯著降低(P<0.01)，并且較2.5 mg/kg LPS組顯著降低(P<0.05)。

表3 雛雞血清炎癥因子檢測

2.6 LPS對肺組織炎癥因子TNF-α mRNA表達的影響

LPS對炎癥因子TNF-α mRNA的表達影響結果見圖5。相比空白組，LPS各劑量組的TNF-α mRNA表達水平均極顯著升高(P<0.01)，且表達水平呈LPS劑量依賴性，但差異不顯著(P>0.05)。

3 討論

實驗動物炎癥模型的建立，是更好地研究各類動物疾病發病機制，進而研制更多有效防治藥物的基礎。LPS是一種能夠引起機體組織及免疫細胞炎癥反應的內毒素，能夠通過NF-κB、MAPK等多種信號通路，誘導如TNF-α等炎癥因子的表達和分泌，進而引發機體炎癥[15]。同時LPS能夠作為外源性致熱源通過刺激機體體內免疫細胞產生內源性致熱源(TNF-α、IL-1β)，內源性致熱源能夠通過刺激大腦皮層細胞介質或直接參與發熱中樞介質PGE2的合成與釋放，引發機體發熱[16-17]。

袁麗華等[18]為研究清開靈解熱作用，通過腹腔注射LPS成功建立仔豬發熱模型。Nguyen等[19]通過對小鼠腹腔注射LPS建立小鼠發熱模型，進而研究美洲大蠊及其提取物的解熱抗炎作用。本試驗檢測到腹腔注射2.5 mg/kg LPS后雛雞體溫呈現上升趨勢，并于注射后3 h達到頂峰，隨后逐漸降低，24 h后恢復正常；當LPS劑量為5.0 mg/kg時，雛雞體溫出現先降低后急速升高現象，3 h后較空白組有著顯著升高，在6 h達到頂峰，隨后雖有降低趨勢，但24 h后較空白組仍有著顯著升高。李天珍[20]通過不同途徑以血清型O111：B4 LPS建立雛雞不同組織炎癥模型時，通過頸靜脈注射LPS后出現炎癥臨床癥狀及發熱現象，與本研究結果相似?？梢钥闯鲭S著外源性致熱源的濃度升高，發熱峰值出現延期，發熱時間延長，因此后續對于解熱藥物的研究中，可以考慮發熱時間較久的濃度，以此來保證可以檢測到藥物解熱的全過程。

COX-2是一種可誘導酶，國內外大量研究表明，COX-2在多種炎性疾病中顯著表達，且越來越多的研究闡明了COX-2在炎癥過程中發揮著至關重要的作用[21-23]。TNF-α作為炎癥中最先出現的炎癥因子，能夠通過與細胞膜上的受體結合，刺激肺組織釋放IL-1β、IL-6、PGE2等炎癥介質，并促使肺間質及肺泡內炎癥細胞增多，導致肺臟炎癥性損傷[24-25]。因此炎癥因子TNF-α、IL-1β、IL-6等是先天性和適應性免疫的關鍵因素，通過控制它們的活性可以啟動作為抵抗病原體或組織損傷的防御機制的免疫應答，在各種病理炎癥反應中發揮重要作用[26]。Baradaran等[27]通過LPS誘導小鼠肺炎模型，小鼠血清中TNF-α、IL-1β、IL-6、PGE2等炎癥因子的含量顯著升高。本研究中，經不同濃度LPS誘導，各LPS劑量組肺組織及血清中炎癥因子的含量及活性均出現顯著升高，當LPS劑量達到5.0 mg/kg時，肺組織中TNF-α及COX-2不僅較空白組極顯著升高，且較2.5 mg/kg組也有極顯著升高，血清中IL-1β較2.5 mg/kg組極顯著升高。試驗結果顯示，隨著LPS濃度的增加，可造成雞發熱及肺炎程度的加深，但若濃度過高，會造成雞死亡率超過50%，因此可根據試驗目的選擇適宜的濃度建立相應模型。

綜上所述，2.5 mg/kg和5.0 mg/kg LPS腹腔注射三黃雞雛雞，均可建立發熱及肺炎模型，具體應用時可根據所考察藥物對于解熱抗炎藥效及藥動效果的不同，選擇相應的建模方式。