流體剪切下軟骨祖細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組響應(yīng)分析

須凌峰 張月姣 張建昌 余佳 霍婉秋 徐佳麗 王美青

顳下頜關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)炎與異常咬合刺激關(guān)系密切[1-2]，本課題組前期研究表明，流體剪切力(flow fluid shear stress，F(xiàn)FSS)可通過多種信號途徑，如mTOR途徑[3]，CaSR途徑[4]，引起軟骨細(xì)胞凋亡、終末分化等異常反應(yīng)。顳下頜關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞根據(jù)分化程度可分為增殖細(xì)胞、前肥大細(xì)胞和肥大細(xì)胞等不同類型[5]，其中增殖細(xì)胞層中含有軟骨祖細(xì)胞(chondroprogenitor cells，CPCs)。軟骨祖細(xì)胞在關(guān)節(jié)軟骨更新修復(fù)和穩(wěn)態(tài)維持中扮演著重要的角色[6-7]。在課題組構(gòu)建的單側(cè)前牙反動物模型中，位于軟骨深層的肥大細(xì)胞會首先凋亡，而位于軟骨淺層(增殖層)的細(xì)胞則表現(xiàn)出較強(qiáng)的抵抗機(jī)械力刺激的能力[8]。為探索軟骨祖細(xì)胞響應(yīng)異常力刺激的規(guī)律，本研究通過第二代高通量RNA測序和生物信息學(xué)分析技術(shù)，從分子水平分析了軟骨祖細(xì)胞在受到FFSS刺激后的變化，以期深入理解軟骨祖細(xì)胞對異常力刺激的反應(yīng)特點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 軟骨祖細(xì)胞的分離與培養(yǎng)

取3 周齡雌性SD大鼠,使用手術(shù)刀分離髁突淺層軟骨,組織塊在無菌磷酸鹽緩沖溶液(phosphate buffered saline, PBS)中漂洗后,在DMEM培養(yǎng)基中將其切碎成1 mm×1 mm組織塊。收集組織,離心,棄上清。胰蛋白酶37 ℃消化20 min,然后使用Ⅰ型膠原酶(2 mg/mL)及Ⅱ型膠原酶(2 mg/mL)消化1 h。完全培養(yǎng)基終止消化,離心,棄上清,加入完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞。細(xì)胞培養(yǎng)于37 ℃,含5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱。培養(yǎng)至第3 代時用于后續(xù)實驗。

1.2 流式細(xì)胞術(shù)

將第一代軟骨祖細(xì)胞消化后制成單細(xì)胞懸液,調(diào)整細(xì)胞密度為1×107/mL。取100 μL上述細(xì)胞懸液,對照組不加抗體,實驗組加入FITC anti-rat CD90 Antibody(Biolegend, 美國), 4 ℃孵育30 min。孵育完成后PBS反復(fù)洗滌細(xì)胞3 次,進(jìn)行上機(jī)檢測。

1.3 流體剪切力加載

體外培養(yǎng)至第2 代的細(xì)胞經(jīng)消化收集后,接種于Flexcell StreamerTM(Flexcellint, 美國)Slips 玻片,約3 d長至80%融合時,對細(xì)胞加載1.2 Pa的流體剪切力(flow fluid shear stress, FFSS)刺激2 h。

1.4 轉(zhuǎn)錄組測序

使用TRIzol試劑(Ambion, 美國)進(jìn)行總RNA提取檢測RNA完整性和總量。合格的樣品經(jīng)過構(gòu)建文庫與質(zhì)檢后使用Illumina NovaSeq 6000(Illumina, 美國)測序。測序部分由北京諾禾致源科技股份有限公司提供技術(shù)支持。

1.5 生物信息學(xué)分析

1.5.1 主成分分析及相關(guān)性分析 通過諾禾云平臺(https://magic.novogene.com)進(jìn)行,用以評估樣品間基因表達(dá)模式相似程度與組間可區(qū)分度。差異表達(dá)分析使用DESeq2軟件(1.20.0)進(jìn)行。本文設(shè)定padj<0.05 &|log2(foldchange)|>1為顯著差異表達(dá)的閾值。

1.5.2 GO功能富集分析及KEGG通路富集分析 通過clusterProfiler(3.8.1)對差異表達(dá)基因進(jìn)行KEGG通路富集分析及GO富集分析,分析結(jié)果分別以氣泡圖和柱狀圖進(jìn)行展示。

1.5.3 差異基因蛋白網(wǎng)絡(luò)互作分析 選擇差異表達(dá)基因中|foldchange| Top 500的差異表達(dá)基因,通過預(yù)測蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用的STRING數(shù)據(jù)庫(http://string.embl.de/)提取相互作用關(guān)系。隨后將相互作用數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytospcape3.8.2軟件,使用CytoNCA軟件計算各節(jié)點(diǎn)介數(shù)中心度(betweenness, BC)。選擇BC Top 200的節(jié)點(diǎn)構(gòu)建相互作用網(wǎng)絡(luò)和核心節(jié)點(diǎn)篩選,并通過Cytoscape3.8.2繪制PPI網(wǎng)絡(luò)圖。

1.6 定量反轉(zhuǎn)錄聚合酶連鎖反應(yīng)

使用TRIzol裂解細(xì)胞,按照說明提取總RNA。使用MightyScript 第一鏈 cDNA 合成Master Mix(上海生工)反轉(zhuǎn)錄為cDNA。使用SYBR Green染料法Mix(上海生工)進(jìn)行定量,引物序列見表1。

表1 引物序列

1.7 統(tǒng)計與分析

數(shù)據(jù)使用GraphPad Prism9.0.0(GraphPad公司,美國)進(jìn)行統(tǒng)計分析與繪制統(tǒng)計圖。使用StudentT檢驗進(jìn)行2 組間差異比較,P<0.05則認(rèn)為存在統(tǒng)計學(xué)差異。

2 結(jié) 果

2.1 實驗樣本可靠性分析與差異表達(dá)

CD90是一種典型的干細(xì)胞表面標(biāo)志物。流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示,提取的大鼠髁突原代軟骨細(xì)胞CD90陽性細(xì)胞率達(dá)到98.51%(圖1)。經(jīng)過Illumina測序后,對結(jié)果進(jìn)行主成分分析,結(jié)果顯示:對照組三個樣本聚集緊密,而FFSS刺激組樣本稍微分散,但仍能夠很好地區(qū)分對照組和FFSS刺激組(圖2A)。樣本間Pearson 相關(guān)分析結(jié)果顯示,對照組組內(nèi)差異較小,而FFSS刺激組組內(nèi)差異略大(圖2B)。即:FFSS刺激后軟骨祖細(xì)胞的基因型發(fā)生了明顯變化,并能夠很好地與對照組區(qū)分。

圖1 軟骨祖細(xì)胞CD90陽性細(xì)胞率

圖2 主成分分析(A)與樣本間相關(guān)性分析(B)

2.2 差異表達(dá)基因篩選

在FFSS刺激后的樣本中共篩選出了1 996 個與對照組相比有顯著差異表達(dá)的基因,其中1 348 個基因表達(dá)上調(diào), 648 個基因表達(dá)下調(diào)(圖3)。表2展示了上調(diào)和下調(diào)差異表達(dá)基因中排名前10的基因,顯著上調(diào)的基因包括了溶質(zhì)載體蛋白家族成員Slc6a12、 Slc25a48,補(bǔ)體家族成員C3,特異性受體酪氨酸激酶家族成員Adgrv1、脂聯(lián)素家族成員Lcn2等。

圖3 差異表達(dá)基因火山圖

表2 Top10差異表達(dá)基因

2.3 GO和KEGG富集分析

為更加深入地研究軟骨祖細(xì)胞在受到FFSS刺激后的反應(yīng)機(jī)制,我們進(jìn)行了上調(diào)和下調(diào)差異表達(dá)基因的GO功能富集分析和KEGG通路富集分析, 并從中挑選了排名前20的信號通路進(jìn)行可視化分析。

對上調(diào)差異表達(dá)基因的KEGG通路富集分析結(jié)果表明,軟骨祖細(xì)胞對FFSS刺激的生物學(xué)反應(yīng)主要集中在與炎性反應(yīng)、免疫調(diào)節(jié)等生物學(xué)過程密切相關(guān)的信號通路,如TNF信號通路、IL-17信號通路、TOLL樣受體信號通路、MAPK信號通路、PI3K-Akt信號通路、JAK-STAT信號通路和破骨細(xì)胞分化等相關(guān)信號通路;對下調(diào)差異表達(dá)基因的KEGG通路富集分析結(jié)果表明,軟骨祖細(xì)胞主要受到細(xì)胞周期、p53信號通路、細(xì)胞外基質(zhì)受體交互、Foxo信號通路、局部黏附、PI3K-Akt信號通路、細(xì)胞衰老以及Wnt信號通路等的影響。

對于上調(diào)差異表達(dá)基因進(jìn)行GO功能富集分析后發(fā)現(xiàn),受FFSS異常力刺激后,軟骨祖細(xì)胞參與的生物學(xué)過程主要與細(xì)菌來源分子反應(yīng)、脂多糖反應(yīng)、血管生成、炎癥反應(yīng)及細(xì)胞分裂等相關(guān),在細(xì)胞組分方面主要涉及細(xì)胞外基質(zhì)、膠原三聚體、細(xì)胞膜等;在分子功能方面主要涉及軟骨祖細(xì)胞對抗氧化活性、生長因子活性、受配體活性、細(xì)胞因子活性等。對于下調(diào)差異表達(dá)基因進(jìn)行GO功能富集分析發(fā)現(xiàn),軟骨祖細(xì)胞的生物過程及細(xì)胞組分主要集中在多個與細(xì)胞分裂相關(guān)的活動中;在分子功能方面,軟骨祖細(xì)胞主要涉及細(xì)胞骨架結(jié)合與活性改變等內(nèi)容(圖4);GO富集分析結(jié)果則顯示,在生物學(xué)過程和細(xì)胞組分這兩方面主要富集在與細(xì)胞分裂相關(guān)的活動中。

2.4 炎癥及細(xì)胞周期相關(guān)基因表達(dá)

本研究在進(jìn)行富集分析時發(fā)現(xiàn):炎癥反應(yīng)和細(xì)胞周期改變是軟骨祖細(xì)胞在異常力刺激下發(fā)生的重要生物學(xué)變化之一。為此,利用熱圖分別展示炎癥反應(yīng)相關(guān)基因和細(xì)胞周期相關(guān)基因的表達(dá)變化情況,結(jié)果表明:炎癥相關(guān)基因(如Il-1α、Il1r1、Hif1-α、 Nfkb1、Ccl7等)的表達(dá)顯著上調(diào)(圖5A),細(xì)胞增殖相關(guān)標(biāo)志物(如Mki67、 Ccnd1、 Ccnd1、 Pcna等)的表達(dá)顯著降低,而周期素依賴性激酶抑制因子1A(Cdkn1a)的表達(dá)水平顯著增高(圖5B)。

2.5 PPI網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

通過PPI網(wǎng)絡(luò)分析,發(fā)現(xiàn)了幾個核心基因,包括參與細(xì)胞增殖、凋亡等生物學(xué)過程的白細(xì)胞介素-6(Il6)、激活轉(zhuǎn)錄因子3(Atf3)、蛋白微管相關(guān)蛋白2(Stmn2)、趨化因子配體2(Ccl2)、視黃酸受體(Ret)、蛋白激酶Cγ(Prkcg)、核因子kappa B抑制因子α(Nfkbia)[9-14];涉及細(xì)胞移動與黏附相關(guān)生物學(xué)過程的血管細(xì)胞黏附分子1(Vcam1)和肌球蛋白(Acta1)[15-16],以及在調(diào)控氧化應(yīng)激方面發(fā)揮重要作用的超氧化物岐化酶2(Sod2)[17](圖6)。

圖6 差異表達(dá)基因的蛋白網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及核心基因篩選

2.6 核心基因的驗證

為了驗證PPI網(wǎng)絡(luò)挖掘的核心基因,通過qRT-PCR驗證核心基因的表達(dá)量。結(jié)果顯示Acta1、 Atf3、 Ccl2、 Il6、 Nfkbia、 Ret、 Vcam1的表達(dá)變化與測序結(jié)果一致(圖7),而Sod2、 Stmn2表達(dá)無明顯變化,Prkcg表達(dá)變化與測序結(jié)果相反(圖7)。

圖7 核心基因驗證

3 討 論

關(guān)節(jié)軟骨是重要的負(fù)重組織,關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞對負(fù)荷變化可做出相關(guān)的生物學(xué)響應(yīng)。本文采用轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析方法,探討了下頜髁突軟骨祖細(xì)胞響應(yīng)FFSS刺激的生物學(xué)活動特點(diǎn),結(jié)果表明:軟骨祖細(xì)胞對FFSS的響應(yīng)主要集中于炎性反應(yīng)和細(xì)胞周期這兩大生物學(xué)過程,信號通路涉及與細(xì)胞增殖、凋亡、分化、細(xì)胞移動、細(xì)胞代謝等生物學(xué)過程,Acta1、Atf3、Ccl2、Il2、Nfkbia、Ret、Vcam1在這些生物學(xué)過程中可能發(fā)揮重要作用。

位于淺層的軟骨祖細(xì)胞具有增殖和向成熟軟骨細(xì)胞分化的能力[18]。異常生物力在骨關(guān)節(jié)炎發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮著重要作用,并誘發(fā)明顯的炎癥反應(yīng)[19]。白細(xì)胞介素-17(IL-17)是一種細(xì)胞因子,在骨關(guān)節(jié)炎病理過程可促進(jìn)IL-1β、TNF、IL-6等炎性因子及基質(zhì)金屬蛋白酶和一氧化氮(NO)的生成[20],并促進(jìn)骨關(guān)節(jié)炎惡化[21];PI3K/AKT/mTOR的激活能夠促進(jìn)軟骨細(xì)胞增殖能力的恢復(fù),對維持關(guān)節(jié)軟骨組織穩(wěn)態(tài)起重要作用,但該通路也參與骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)生與發(fā)展[22],軟骨細(xì)胞中IL-17 介導(dǎo)的 PI3K/AKT/mTOR 通路的激活,可促進(jìn)軟骨退變[23]。JAK-STAT被認(rèn)為是細(xì)胞功能的中心節(jié)點(diǎn)之一,參與免疫適應(yīng)、組織修復(fù)、炎癥、凋亡、等多種生物學(xué)過程[24]。有報道指出:軟骨細(xì)胞受到白細(xì)胞介素-1(IL-1)刺激時其增殖能力將下降,而抑制JAK2/STAT3信號通路則能部分恢復(fù)受損軟骨細(xì)胞的增殖能力[25];而最近一項研究表明,JAK/STAT信號通路的激活能夠促進(jìn)軟骨祖細(xì)胞衰老[26];腫瘤壞死因子-α/核因子-κB(TNF-α/NF-κB)信號通路是炎癥反應(yīng)中最重要的信號通路之一,抑制TNF-α/NF-κB信號通路的激活,可以抑制顳下頜關(guān)節(jié)軟骨祖細(xì)胞的炎癥反應(yīng)并維持軟骨生成能力[27]。本研究結(jié)果中PPI網(wǎng)絡(luò)分析顯示, Il6、Nfkbia等炎性和抗炎相關(guān)基因是互作網(wǎng)絡(luò)中的核心分子。先前的研究表明流體剪切力能夠刺激軟骨細(xì)胞產(chǎn)生前列腺素E2(PGE2),誘導(dǎo)Il6的合成[20]。Atf3是骨關(guān)節(jié)炎發(fā)展的關(guān)鍵介質(zhì)。炎性細(xì)胞因子通過NF-κB途徑上調(diào)Atf3的表達(dá),而Atf3缺乏會減弱IkB和p65的磷酸化狀態(tài),抑制NF-κB信號, 從而抑制軟骨細(xì)胞中細(xì)胞因子誘導(dǎo)的Il6轉(zhuǎn)錄[28]。 Vcam1是一種重要的炎性反應(yīng)介質(zhì), Vcam1表達(dá)增加與炎癥及組織損傷有關(guān)[29]。而Nfkbia能夠抑制與炎性反應(yīng)相關(guān)的NF-κB/REL復(fù)合物。在FFSS刺激后,軟骨祖細(xì)胞Nfkbia表達(dá)水平升高, 可能是細(xì)胞對于炎性過程的一種保護(hù)性反應(yīng)。這些結(jié)果提示炎癥反應(yīng)是軟骨祖細(xì)胞對異常力刺激的主要響應(yīng)。

骨關(guān)節(jié)炎軟骨中,軟骨細(xì)胞通過改變代謝來適應(yīng)骨關(guān)節(jié)炎中的炎性環(huán)境[30]。溶質(zhì)載體(solute carrier, SLC)是一類負(fù)責(zé)物質(zhì)在胞內(nèi)胞外之間運(yùn)輸?shù)目缒さ鞍?在細(xì)胞代謝過程中發(fā)揮著重要的作用[31]。本研究發(fā)現(xiàn)軟骨祖細(xì)胞在受到FFSS刺激后,Slc6a12、Slc25a48的表達(dá)水平顯著升高。盡管尚且沒有溶質(zhì)載體蛋白與骨關(guān)節(jié)炎發(fā)病相關(guān)的報導(dǎo),但是這些結(jié)果提示溶質(zhì)載體可能與骨關(guān)節(jié)炎病理過程中軟骨細(xì)胞代謝改變相關(guān)。

總之, 本研究通過采用第二代高通量轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù),首次證明軟骨祖細(xì)胞對于FFSS刺激的主要響應(yīng)表現(xiàn)為炎癥反應(yīng),并揭示了參與這一過程的幾個重要炎性反應(yīng)相關(guān)信號通路,如NF-κB、IL-17、MAPK、JAK-STAT、PI3K/Akt等,從而為進(jìn)一步研究軟骨祖細(xì)胞在力刺激作用下的功能活動特點(diǎn)及其可能的治療靶向,提供了轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究基礎(chǔ)。