石榴皮提取物通過抑制炎癥和氧化應激改善小鼠結腸炎

鹿欣雨,高 敏,李海燕,李丹鳳,黃鳳霞,王 琳

(1西安醫學院醫學技術學院醫學檢驗實驗中心,西安 710021;2西安醫學院醫學技術學院;3西安醫學院藥學院化學實驗中心;*通訊作者,E-mail：luxyu28nn@163.com)

潰瘍性結腸炎(ulcerative colitis,UC)是一種慢性、復發性腸道炎癥疾病,臨床癥狀以腹瀉、發燒、腹痛、血便、食欲下降和體質量減輕為主,直腸和結腸黏膜反復出現的炎癥性病變可能會引發結腸癌[1]。UC的發病機制尚不完全清楚,炎癥和氧化應激在UC的疾病進程中發揮著關鍵作用[2]。免疫系統的失衡會促進活性氧的產生[3,4],進一步導致腫瘤壞死因子α(TNF-α)、白細胞介素17(IL-17)、干擾素γ(IFN-γ)等促炎性細胞因子的釋放,最終加重氧化應激和腸上皮細胞損傷[5]。

目前UC的常規治療藥物具有一定的局限性和副作用[6],而天然植物提取物療效更高,副作用更小[7,8]。石榴皮富含多酚類化合物,主要由酚酸、鞣質和類黃酮組成,為我國傳統中藥,具有治療腹瀉、痢疾、感染性炎癥等作用[9,10]。據報道,在刀豆球蛋白A誘導的自身免疫性肝炎小鼠模型中石榴皮提取物(pomegranate peel extract,PPE)能減輕肝臟炎癥并降低TNF-α、IFN-γ和IL-6的分泌[11];本課題組前期研究表明,在實驗性自身免疫性腦脊髓炎(EAE)小鼠模型中,口服PPE能通過降低中樞和外周CD4+IL-17+、CD4+IFN-γ+等炎性細胞因子的分泌,增加免疫調節細胞因子的表達來減輕EAE的嚴重程度[12],然而,PPE在UC中的潛在價值還需進一步挖掘。本研究旨在探討PPE對葡聚糖硫酸鈉(dextran sulfate sodium,DSS)誘導的UC小鼠的治療作用和分子機制,為PPE在UC治療中的作用提供藥理學基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物 6～8周雌性C57BL/6小鼠購自斯貝福(北京)生物技術有限公司,許可證號：SCXK(京)2019-0010,小鼠適應動物實驗室4 d,飼養于標準動物室,濕度40%～60%,溫度(20±5)℃,并提供標準食品和蒸餾水。所有動物實驗均經西安醫學院倫理審查委員會批準(批準編號：XYLS2023085),并按照批準的機構指南和規定進行。

1.1.2 主要試劑與儀器 石榴皮來源于陜西臨潼農家石榴園石榴PunicagranatumL.的干燥果皮。福林酚試劑購自北京索萊寶科技有限公司;安石榴苷、沒食子酸、鞣花酸(分析對照品,HPLC≥98%)購自成都德斯特生物技術有限公司;葡聚糖硫酸鈉、糞便隱血試劑盒購自上海翌圣生物科技有限公司;RNA樣本保存液、細胞/組織RNA快速提取試劑盒購自北京聚合美生物科技有限公司;反轉錄酶、SYBR Green qPCR Master Mix購自南京諾唯贊生物科技有限公司;丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽過氧化物酶(GPX)試劑盒購自南京建成生物工程研究所。高效液相色譜儀購于美國Thermo公司,正置顯微鏡購于德國Leica公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 PPE的制備及總酚含量測定 新鮮石榴皮經水清洗烘干粉碎,過濾得石榴皮粉末。稱取石榴皮粉末1 g置于50 mL離心管中,加入30 mL 60%乙醇溶液,靜置過夜后進行超聲波輔助提取30 min并離心,收集上清液在40 ℃水浴條件下旋轉蒸發,將旋蒸后的液體置于-80 ℃中冷凍48 h后用冷凍干燥機冷凍烘干得到PPE粉末。采用Folin-Ciocalteau法計算PPE總酚含量[13],取沒食子酸對照品溶液,配制成濃度為0.01,0.02,0.03,0.04,0.05 mg/mL的對照品溶液。分別取不同濃度的沒食子酸對照品溶液和PPE溶液0.8 mL置于10 mL棕色容量瓶,依次加入4 mL蒸餾水、0.4 mL福林酚試劑、4.8 mL 29%的碳酸鈉溶液,充分混合,靜置30 min后在760 nm的波長處測量吸光度?？v坐標表示吸光度,橫坐標表示濃度,制備沒食子酸標準曲線并計算線性方程。

1.2.2 高效液相色譜法分析PPE成分 根據對照品在檢測波長254 nm處響應值高低的不同,將沒食子酸、安石榴苷、鞣花酸對照品以適當比例混合,配制成混合對照品溶液。精密稱定10 mg PPE粉末,加10 mL甲醇超聲溶解,搖勻濾過,即得樣品溶液。賽默飛高效液相色譜儀U3000,色譜柱Waters Symmetry-C18(4.6 mm×250 mm,5.0 μm),流動相分別為：A-乙腈,B-0.1%磷酸水溶液,洗脫程序[14]：0～35 min 2%～8% A,35～47 min 8%～18% A,47～55 min 18%～20% A,柱溫35 ℃,進樣量3 μL,流速1.0 mL/min。

1.2.3 動物分組及處理 將實驗小鼠隨機分為正常組、模型組、PPE低劑量組和PPE高劑量組,每組6只。正常組小鼠自由用水。模型組和PPE各組小鼠均連續7 d給予3%的DSS飲用水,第8天接受正常飲用水。從DSS造模給藥第1天起,正常組和模型組每日均以蒸餾水灌胃,PPE各組分別給予200 mg/kg和400 mg/kg的PPE灌胃,連續10 d,每日固定時間給藥1次。第11天結束實驗脫頸處死小鼠,迅速取出結腸并測量其長度;取1 cm的遠端結腸進行蘇木精和伊紅染色(hematoxylin-eosin,HE);取部分結腸組織置于裝有RNA保存液的離心管,存于-80 ℃進行RT-qPCR,檢測TNF-α、IL-17A、IFN-γ的表達水平;再取部分結腸組織于-80 ℃保存,后續檢測氧化應激標志物。

1.2.4 疾病活動指數評估 從造模第1天起,每天對小鼠的體質量、大便性狀和血便進行記錄和評分。根據疾病活動指數(disease activity index,DAI)評分標準[15](見表1),兩名實驗人員對造模小鼠進行雙盲評分,最終取體質量下降百分比、大便性狀和血便評分的平均值作為DAI評分,并統計評分結果。

表1 DAI評分標準

表2 RT-qPCR引物序列

1.2.5 RT-qPCR檢測結腸炎性細胞因子(TNF-α、IL-17A、IFN-γ)的表達 按動物/組織RNA提取試劑盒說明書步驟提取RNA,并用核酸蛋白儀(Nono-

1.2.6 HE檢測各組小鼠結腸組織的病理變化 結腸組織用4%多聚甲醛固定,經脫水和包埋后用石蠟輪轉切片機切為6 μm薄片,結腸切片用HE進行組織學分析,在光學顯微鏡下觀察切片并拍照分析。組織學評分0～4分,依據為上皮損傷(0分,無組織損傷;1分,局部損傷;2分,中度損傷,3分,重度損傷)、隱窩損失(0分,無損失;1分,輕度;2分,中度;3分,重度;4分,無隱窩)、絨毛損傷(0分,無;1分,輕度;2分,中度;3分,重度;4分,完全損傷)、炎癥細胞浸潤程度(0分,無;1分,隱窩周圍輕度浸潤;2分,黏膜肌層出現浸潤;3分,黏膜肌層普遍浸潤;4分,嚴重浸潤)[16]。

1.2.7 結腸組織氧化應激標志物(MDA、SOD、GPX)活性測定 結腸組織用生理鹽水勻漿,3500 r/min,4 ℃下離心10 min收集上清。結腸中MDA、SOD、GPX活性根據試劑盒方法測定。

1.2.8 統計學分析 采用GraphPad Prism 8統計軟件對數據進行繪圖和分析,數據以平均值±標準誤表示。兩組間比較采用獨立樣本t檢驗,P<0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 PPE總酚含量及主要成分分析

沒食子酸對照品溶液濃度在0.01～0.05 mg/mL線性關系良好,標準曲線回歸方程為y=2.150 2x+0.052 1,R2=0.998 6,測得PPE中總酚含量為(295.76±3.15)mg/g。PPE樣品色譜圖與混合對照品色譜圖對比顯示樣品中含有沒食子酸、安石榴苷及鞣花酸,其中安石榴苷以同分異構體(安石榴苷A和B)存在(見圖1),化合物色譜信息分析結果顯示安石榴苷峰面積的百分比最高(見表3)。

注：1.沒食子酸;2.安石榴苷A;3.安石榴苷B;4.鞣花酸。圖1 混合對照品和PPE樣品色譜結果Figure 1 Chromatogram of mix-standard sample and PPE sample

表3 PPE樣品色譜信息

2.2 PPE對UC小鼠體質量、DAI指數和結腸長度的影響

與正常組相比,模型組和PPE各組小鼠從DSS造模給藥第3天開始陸續呈現活動減少、軟便、腹瀉和體質量下降趨勢,表明UC模型已成功建立。與正常組相比,模型組小鼠體質量降低(P<0.01),DAI指數增加(P<0.000 1),結腸長度縮短(P<0.01);在第7天時,與模型組相比,PPE低劑量組和高劑量組體質量均無統計學意義(P>0.05),DAI指數均降低(P<0.01);在第11天時,與模型組相比,PPE低劑量組體質量下降程度緩解(P<0.01),PPE高劑量組體質量仍無統計學意義(P>0.05),DAI指數均降低(P<0.01,見圖2)。此外,與模型組與相比,PPE低劑量組和高劑量組小鼠結腸縮短程度均得到明顯改善(P<0.05,見圖2)。提示PPE能緩解結腸炎的嚴重程度。

注：與正常組比較,**P<0.01,****P<0.000 1;與模型組比較,#P<0.05,##P<0.01,###P<0.001。圖2 PPE對UC小鼠體質量、DAI指數和結腸長度的影響Figure 2 Effects of PPE on body weight, DAI score, and colon length in mice with DSS-induced colitis

2.3 PPE對UC小鼠結腸組織病理學的影響

正常組小鼠結腸上皮細胞和隱窩結構完整,杯狀細胞沒有減少,組織學評分也最低;與正常組相比,模型組出現上皮損傷、杯狀細胞丟失、炎性細胞浸潤、隱窩結構破壞情況,組織學評分較高(P<0.000 1);與模型組相比,PPE低劑量組和高劑量組小鼠黏膜損傷較少,隱窩結構破壞程度減輕,炎性細胞浸潤明顯減少,組織學評分降低(P<0.05,見圖3)。由此可見,PPE對UC小鼠結腸黏膜損傷有明顯的改善作用。

2.4 PPE對炎性細胞因子表達的影響

與正常組相比,模型組TNF-α、IL-17A和IFN-γ的表達水平增加(P<0.05);與模型組相比,PPE低劑量組和高劑量組結腸組織中TNF-α、IL-17A和IFN-γ的表達水平均下調(P<0.05,見圖4)。以上結果表明PPE給藥可以有效逆轉炎性細胞因子的異常產生。

注：與正常組比較,*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001;與模型組比較,#P<0.05,##P<0.01,###P<0.001。圖4 PPE對UC小鼠結腸組織促炎細胞因子的影響Figure 4 Effects of PPE on pro-inflammatory cytokines in colon tissues of mice with DSS-induced colitis

2.5 PPE對氧化應激標志物的影響

與正常組相比,模型組小鼠結腸組織中MDA濃度升高(P<0.01),SOD和GPX活性降低(P<0.01);與模型組相比,PPE低劑量組和高劑量組小鼠結腸MDA水平均明顯降低(P<0.01),SOD水平差異無統計學意義(P>0.05),同時PPE低劑量組小鼠GPX水平增加(P<0.05),而PPE高劑量組GPX活性未見統計學差異(P>0.05,見圖5)。表明PPE可以通過降低MDA水平、增加SOD和GPX活性來抑制氧化應激。

3 討論

UC是一種常見的胃腸道疾病,由于其病因的復雜性,預防和治療該疾病的有效方法仍然很有限。因此,迫切需要開發新的安全有效的治療藥物。石榴皮來源天然,安全性較高,具有極高的開發價值。本研究表明PPE能明顯改善DSS誘導的結腸炎小鼠的DAI評分、結腸長度縮短和組織病理學損傷情況,且低劑量的PPE(200 mg/kg)改善UC的治療效果更為顯著,我們推測可能由于PPE中所含的有效成分在高濃度時會刺激腸道從而減弱UC的治療效果。

炎性細胞因子的分泌在腸道免疫系統和UC的病理生理中起著關鍵作用。巨噬細胞、樹突狀細胞和T細胞來源的TNF-α在UC中具有刺激中性粒細胞并啟動其他細胞因子分泌的作用[17];Yang等[18]證實IFN-γ信號通路及其核心基因在UC表型中上調并促進免疫炎癥反應的加重;IL-17A是一種有效的促炎細胞因子,可通過促其他炎癥介質(如TNF-α、IL-6)的釋放以及誘導中性粒細胞相關基因參與炎癥過程[19]。因此,抑制這些促炎細胞因子的分泌可以減輕UC。據報道許多植物提取的多酚可以降低炎性細胞因子的水平,從而減弱炎癥反應,例如,咖啡櫻桃殼多酚、紫山藥多酚、青豌豆殼多酚提取物通過降低DSS誘導的小鼠結腸組織中IL-1β、IL-6、IFN-γ、TNF-α、IL-17A等其他促炎細胞因子的水平來改善結腸炎[20-22]。本研究結果與此一致的是,與模型組相比,PPE低劑量組和高劑量組小鼠結腸組織中TNF-α、IFN-γ、IL-17A水平降低,表明PPE治療能抑制促炎細胞因子的表達,有效改善炎癥反應。

氧化應激也是UC發病的潛在機制,炎性細胞浸潤產生的自由基會破壞內源性防御系統和上皮細胞的完整性,誘發腸黏膜免疫功能障礙,延緩腸黏膜恢復,而SOD與GPX的協同作用可以保護結腸黏膜免受過氧化物引起的損傷[4]。DSS誘導的氧化應激和脂質過氧化通常表現為MDA含量增加以及GPX、SOD活性降低[23]。同樣,本研究中,與模型組相比,PPE低劑量組和高劑量組結腸組織中MDA水平降低,SOD和GPX活性提高,而且PPE低劑量組抗氧化能力高于PPE高劑量組,可能是由于多酚在高劑量給予時會充當促氧化劑[24]。

綜上所述,PPE可以通過降低炎性細胞因子表達水平,調節氧化應激來改善DSS誘導的結腸炎。因此,PPE可以作為一種有潛力的天然抗炎、抗氧化劑,為UC等炎癥性疾病的預防、治療和藥物開發提供研究基礎。