艾灸對佐劑性關節(jié)炎大鼠滑膜組織Beclin-1、LC3-Ⅱ表達的影響

彭雄 周蘭 施雨燕 龔志賢 張亮 艾坤 李鑫 陳青 劉梨

〔摘要〕 目的 觀察艾灸對類風濕關節(jié)炎（rheumatoid arthritis， RA）大鼠炎癥因子白細胞介素-2（interleukin-2，IL-2）及滑膜細胞中自噬相關因子Beclin-1、微管相關蛋白1輕鏈3-Ⅱ（microtubule-associated protein1 light chain 3-Ⅱ，LC3-Ⅱ）表達的影響，探索艾灸治療RA的作用機制。方法 將36只雄性SD大鼠隨機分為空白組、模型組、甲氨蝶呤組、艾灸組，每組9只。采用弗氏完全佐劑造模法制備RA大鼠模型。造模成功后艾灸組予艾灸足三里、關元，每次20 min，每天1次；甲氨蝶呤組予甲氨蝶呤0.35 mg/kg灌胃，每周2次。空白組、模型組、甲氨蝶呤組每天給予艾灸組大鼠同樣時長及強度的捆綁。每組均干預3周。觀察大鼠一般情況，采用足趾容積測量儀檢測大鼠左后肢足趾容積，ELISA法檢測血清中IL-2含量，Western blot檢測大鼠踝關節(jié)滑膜組織中Beclin-1、LC3-Ⅱ蛋白相對表達量。結果 與模型組比較，甲氨蝶呤組及艾灸組精神一般，反應尚可，體質量恢復，較活躍，攝食、飲水尚可，足部腫脹、紅腫緩解，其局部炎癥及全身多發(fā)性關節(jié)炎情況均輕于模型組。與空白組比較，模型組大鼠于造模后第3、10、17、24天足趾容積明顯增大（P＜0.01），結合一般情況，提示模型制備成功；甲氨蝶呤組、艾灸組足趾容積于第24天增大（P<0.05）。與模型組比較，甲氨蝶呤組造模后第17、24天足趾容積降低（P＜0.05，P＜0.01），艾灸組第10、17、24天足趾容積明顯降低（P＜0.01）。干預3周后，與空白組比較，模型組血清中IL-2含量明顯升高（P<0.01），滑膜組織Beclin-1、LC3-Ⅱ蛋白表達量明顯上升（P<0.01）；與模型組比較，甲氨蝶呤組、艾灸組血清中IL-2含量降低（P<0.05），艾灸組滑膜組織Beclin-1、LC3-Ⅱ蛋白表達量下降（P<0.05）。結論 艾灸能改善RA大鼠關節(jié)腫脹，降低IL-2含量，其作用機制可能是通過調節(jié)自噬因子Beclin-1、LC3-Ⅱ蛋白表達量有關。

〔關鍵詞〕 類風濕關節(jié)炎；佐劑性關節(jié)炎；滑膜組織；艾灸；白細胞介素-2；Beclin-1；微管相關蛋白1輕鏈3-Ⅱ

〔中圖分類號〕R245.9? ? ? ? ?〔文獻標志碼〕A? ? ? ? ? 〔文章編號〕doi：10.3969/j.issn.1674－070X.２０24.01.018

Effects of moxibustion on Beclin-1 and LC3-Ⅱ expressions in

synovium of rats with adjuvant-induced arthritis

PENG Xiong1，2， ZHOU Lan2， SHI Yuyan1， GONG Zhixian1， ZHANG Liang2， AI Kun2，

LI Xin3， CHEN Qing1*， LIU Li1*

1. The First Hospital of Hunan University of Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410007， China; 2. Hunan University of Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410208， China; 3. Hunan Key Laboratory of TCM Diagnostics， Hunan University of

Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410208， China

〔Ａｂｓｔｒａｃｔ〕 Objective To observe the effects of moxibustion on the inflammatory factor interleukin-2 （IL-2） and the expressions of Beclin-1 and microtubule-associated protein 1 light chain 3-Ⅱ （LC3-Ⅱ） in the synovium of rats with rheumatoid arthritis （RA）， and to explore the mechanism of action of moxibustion treating RA. Methods A total of 36 SD male rats were randomly divided into blank， model， methotrexate， and moxibustion groups， with nine rats in each group. The rat model of RA was established by complete Freund's adjuvant. After modeling， moxibustion group was treated with moxibustion at "ZuSanli" （ST36） and "Guanyuan" （CV4） for 20 min， once a day. Methotrexate group was given methotrexate intragastrically （0.35 mg/kg） twice a week. The rats in blank， model， and methotrexate groups were bound for the time and intensity as same as those of moxibustion group daily. All groups were intervened for three weeks. The general condition of the rats was observed. The paw volume of the left hind limb of rats was measured by the paw volume measuring instrument， the content of serum IL-2 was determined by ELISA， and the relative expression levels of Beclin-1 and LC3-Ⅱ proteins in the ankle synovial tissues of the rats were determined by Western blot. Results Compared with model group， the spirit of the rats in methotrexate and moxibustion groups was average， their reaction and intake of food and water were passable with more activities， the body weight was restored， the redness and swelling of their paws were alleviated， and the local inflammation and systemic polyarthritis were less severe than those in model group. Compared with blank group， the paw volume of the rats in model group increased on the 3rd， 10th， 17th， and 24th days after modeling （P<0.01）， which， along with the general condition of the rats， suggested a successful modeling; meanwhile， the paw volume of the rats in methotrexate and moxibustion groups increased on the 24th day （P<0.05）. Compared with model group， the paw volume of the rats in methotrexate group significantly decreased on the 17th and 24th days after modeling （P<0.05， P<0.01）， and that in moxibustion group significantly decreased on the 10th， 17th， and 24th days （P<0.01）. After three-week intervention， the expression level of serum IL-2 in model group was significantly elevated （P<0.01）， and the protein expression levels of Beclin-1 and LC3-Ⅱ in the synovial tissues were significantly higher （P<0.01）; compared with model group， the expression level of serum IL-2 in methotrexate and moxibustion groups was reduced significantly （P<0.05）， and the protein expression levels of Beclin-1 and LC3-Ⅱ in the synovial tissues of moxibustion group were lower significantly （P<0.05）. Conclusion Moxibustion can alleviate the joint swelling of RA rats and decrease the content of IL-2. The mechanism of action may be related to regulating the protein expression levels of Beclin-1 and LC3-Ⅱ.

〔Ｋｅｙｗｏｒｄｓ〕 rheumatoid arthritis; adjuvant-induced arthritis; synovial tissue; moxibustion; interleukin-2; Beclin-1; microtubule-associated protein 1 light chain 3-Ⅱ

類風濕關節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）是以對稱性、侵蝕性滑膜炎為主的全身性自身免疫性疾病，以關節(jié)滑膜的炎癥、血管翳的形成、隨著病程加重出現(xiàn)的關節(jié)軟骨和骨破壞為特征，是造成我國人群喪失勞動力和致殘的主要原因之一[1]。臨床研究表明，艾灸可顯著改善RA患者臨床癥狀與生活質量[2-3]。有研究發(fā)現(xiàn)，滑膜細胞自噬與RA密切相關，細胞自噬可能引起滑膜細胞的過度活化及分化，促進滑膜細胞增殖，加重RA病情，通過調節(jié)自噬可抑制RA炎性反應[4-5]。白細胞介素-2（interleukin-2，IL-2）與RA滑膜炎癥密切相關，可增加關節(jié)腔內白細胞數(shù)量，使中性粒細胞炎性反應加重，是產(chǎn)生滑膜炎癥的關鍵因子[5]。自噬相關因子Beclin-1和微管相關蛋白1輕鏈3-Ⅱ（microtubule-associated protein1 light chain 3-Ⅱ，LC3-Ⅱ）是自噬啟動的標志性蛋白。本課題組前期研究證實，艾灸治療佐劑性關節(jié)炎（adjuvant arthritis， AA）模型大鼠足三里、關元能明顯緩解大鼠足跖腫脹程度，改善局部炎癥[4]。但目前從細胞自噬角度探討艾灸治療RA生物學機制的研究較少，因此，本研究擬采用艾灸足三里、關元干預AA模型大鼠，探討艾灸是否通過調節(jié)自噬相關因子Beclin-1、LC3-Ⅱ改善RA炎癥的生物學機制。

1 實驗材料與方法

1.1? 實驗動物及分組

健康雄性SD大鼠36只，體質量100～120 g，由湖南斯萊克景達實驗動物公司提供，動物許可證號：SCXK（湘）2019-0004。飼養(yǎng)于湖南中醫(yī)藥大學動物實驗中心，溫度20～25 ℃，濕度50%～70%，適應性喂養(yǎng)7 d后將大鼠按照體質量分層原則[6]隨機分為空白組、模型組、艾灸組、甲氨蝶呤組，每組9只。實驗全程遵從《關于善待實驗動物的指導性意見》中的動物倫理相關規(guī)定（2006年版）。本實驗倫理編號：LLBH-202203140004。

1.2? 主要試劑與儀器

滅活結合分枝桿菌（美國Sigma Aldrich，批號：SLBW7430）；甲氨蝶呤（美國AbMole BioScience，批號：M2228）；BCA試劑盒（美國Thermo Scientific公司，批號：QB214754）；RIPA裂解液（美國Solarbio公司，批號：R0010）；大鼠Beclin-1抗體（美國Abcam公司，批號：Ab210498）；大鼠LC3-Ⅱ抗體、羊抗鼠二抗（美國Proteintech公司，批號分別為：18722-1、SA00001）；SDS-PAGE制膠試劑盒（上海碧云天生物技術有限公司，批號：072319190723）；IL-2試劑盒（美國Elabscience公司，批號：E-EL-R0013c）。

足趾容積測量儀（濟南益延科技發(fā)展有限公司，型號：YLS-7C）；PVDF膜（美國Amersham Pharmacia GE公司，型號：K5NA8023B）；艾灸條（湘味堂艾草制品，型號：4 mm）；高速低溫離心機（美國SCILOGEX公司，型號：D3024R）；GloMax酶標儀（美國Promega公司，型號：GM3030）；振蕩儀（海門市其林貝爾儀器制造有限公司，型號：10RTEX-5）；電泳儀（美國BIO-RAD公司，型號：041BR126545）；水浴鍋（廈門精藝興業(yè)科技有限公司，型號：SB-1100）；電熱恒溫槽（上海精宏實驗設備公司，型號：DK-8D）；移液槍（德國 Ep-pendorf 公司，型號：3120000267）。

1.3? 造模方法

采用完全弗氏佐劑造模法[7]：將定量滅活結核分枝桿菌與礦物油放入高溫滅菌的研缽中充分研磨，直至溶液清透無雜質，配制成2.5 mg/mL的弗氏佐劑備用，使用時需震蕩以充分混勻。將造模大鼠（模型組、艾灸組、甲氨蝶呤組）固定，以巴比妥酸鹽30 mg/kg腹腔注射麻醉大鼠，等待3 min，大鼠無基本活動且反應遲鈍后，用乙醇棉球消毒尾根部后皮下注射佐劑0.1 mL/只。空白組大鼠用相同方法注射礦物油0.1 mL/只。造模后24 h左側足部急性炎癥腫脹，2～3 d出現(xiàn)雙側足趾持續(xù)腫脹以及發(fā)生顏色改變，雙側肢體或者前肢、耳部、尾部發(fā)生紅腫或出現(xiàn)炎性結節(jié)，提示造模成功[7]。

1.4? 干預方法

各組大鼠均于造模后第4天開始干預。艾灸組大鼠用特制固定器捆綁并予艾灸治療。穴位定位參照《實驗針灸學》[8]大鼠標準穴位圖譜及擬人對照法。足三里位于膝關節(jié)后外側，腓骨小頭下約5 mm處；關元位于恥骨聯(lián)合上緣3寸（胸劍聯(lián)合至恥骨聯(lián)合上緣以松緊帶平均分為13等份，每一等份模擬大鼠同身寸1寸）。用動物特用艾條，將多頭艾灸器置于穴位上2 cm處懸灸，每次20 min，每天1次，連續(xù)干預3周，共21次。甲氨蝶呤組大鼠給予甲氨蝶呤粉劑，按照0.35 mg/kg劑量[4]用去離子無菌水溶解后灌胃，每周2次，干預3周，共6次。空白組、模型組、甲氨蝶呤組每天給予艾灸組大鼠同樣時長及強度的捆綁。

1.5? 取材方法

各組大鼠干預3周后，用巴比妥酸鹽溶液以30 mg/kg腹腔注射麻醉。將大鼠仰位固定，采血管于腹主動脈取血5 mL放入-80 ℃冰箱保存，擬行ELISA法檢測。繼續(xù)將大鼠固定于冰上，用骨科剪迅速剪斷大鼠左右兩側足趾關節(jié)2 cm以上的后肢，打開足趾關節(jié)，找到關節(jié)軟骨下附著的淡黃色光滑透亮的滑膜組織，用眼科剪小心完整剪下。所有的滑膜組織取出后，放于凍存管并在液氮中凍存，再移至-80 ℃冰箱中保存，擬行Westen blot檢測。

1.6? 觀察指標

1.6.1? 觀察大鼠一般行為學? 觀察各組大鼠精神、反應、活力、體質量、二便及足趾腫脹情況。

1.6.2? 足趾容積測量? 采用足趾容積測量儀檢測大鼠左后肢足趾容積。在造模后第3、10、17、24天分別測量各組大鼠足趾容積并記錄。測量方法為：在大鼠足趾關節(jié)處用記號筆劃線標記，足趾測量儀校零后，一手抓住大鼠背部皮毛使其固定，另一手捉住大鼠左后膝關節(jié)處使其后足伸直，垂直并緩慢放入測量杯內，當測量杯水平面與鼠足上的測量標線重疊時，啟動測量開關并讀取測量數(shù)據(jù)，精確至小數(shù)點后3位。每只足爪每次測量3次取平均值。

1.6.3? 血清IL-2含量檢測? 用ELISA法，取出血清樣品置于冰上融化，4 ℃離心機中12 000 r/min離心20 min（離心半徑8.5 cm），取上清液。加入IL-2標準品1 mL至標準管中，靜置10 min并充分溶解。進行2倍比稀釋，配制不同濃度的標準品。加樣封板后溫育（37 ℃，90 min），加酶后洗滌，每孔加酶結合物工作液100 μL，封板后置于37 ℃烘箱中溫育30 min。再次洗滌后加底物溶液，封板膜封板后置于37 ℃烘箱中溫育15 min進行顯色。加終止液終止反應，15 min內在450 nm波長測量各孔的吸光度（OD值），繪出標準曲線和標準方程，計算每個樣本的濃度。

1.6.4? 滑膜組織中Beclin-1、LC3-Ⅱ蛋白相對表達量檢測? 采用Western blot法檢測蛋白表達量。取大鼠滑膜組織100 mg，加入組織裂解液，置于冰上裂解30 min后4 ℃離心機中12 000 r/min離心20 min（離心半徑8.5 cm），用BCA法測定樣本的蛋白濃度。將樣品以每個孔30 μg為標準進行上樣，在10％的SDS-PAGE膠上電轉移蛋白至PVDF膜后，浸泡在含5％脫脂奶粉的封閉液中，室溫孵育1 h。加入相應的一抗Beclin-1（1∶1 000）、LC3-Ⅱ（1∶1 000）、β-actin（1∶2 000），4 ℃過夜。TBST洗3次，每次10 min；加入二抗（1∶10 000）溶液，室溫孵育1 h。TBST洗3次，每次10 min。將PVDF膜與新鮮配制的增強型化學發(fā)光劑溶液反應2 min，快速于暗室中曝光顯影。用Image J 軟件做圖片灰度分析，將空白組進行歸一化處理，以目標蛋白與內參β-actin灰度值的比值作為相對表達量。

1.7? 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 22.0軟件進行統(tǒng)計學處理。對所有數(shù)據(jù)進行正態(tài)性檢驗，符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)以“ｘ±s”表示。組間比較采用單因素方差分析：若滿足正態(tài)性檢驗、方差齊時選用LSD法，滿足正態(tài)性檢驗、方差不齊時選用Tamhane T2法進行檢驗。以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 實驗結果

2.1? 各組大鼠一般行為學觀察

空白組大鼠精神尚可，反應靈敏，活動自如，攝食、飲水正常，二便正常。模型組大鼠精神欠佳，反應遲鈍，體質量下降，攝食、飲水均下降，足部明顯腫脹、紅腫，左后肢足跖部尤以嚴重，伴有四肢各關節(jié)處稍微紅腫。與模型組比較，甲氨蝶呤組及艾灸組精神一般，反應尚可，體質量恢復，較活躍，攝食、飲水尚可，足部腫脹、紅腫緩解，其局部炎癥及全身多發(fā)性關節(jié)炎情況均輕于模型組。

2.2? 各組大鼠足爪容積比較

與空白組比較，模型組于造模后第3、10、17、24天足趾容積明顯增大（P＜0.01），結合一般情況，提示模型制備成功；甲氨蝶呤組、艾灸組足趾容積于造模后第3、10、17天差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05），于第24天增大（P<0.05）。與模型組比較，甲氨蝶呤組造模后第17、24天足趾容積降低（P＜0.05，P＜0.01），艾灸組第10、17、24天足趾容積明顯降低（P＜0.01）。與甲氨蝶呤組比較，艾灸組足趾容積差異均無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。詳見表1。

2.3? 各組大鼠IL-2含量比較

干預3周后，與空白組比較，模型組血清中IL-2含量明顯升高（P<0.01）；與模型組比較，甲氨蝶呤組、艾灸組血清中IL-2含量降低（P<0.05）。詳見表2。

2.4? 各組大鼠滑膜組織中Beclin-1、LC3-Ⅱ蛋白表達量比較

干預3周后，與空白組比較，模型組Beclin-1、LC3-Ⅱ蛋白表達量明顯上升（P<0.01）；與模型組比較，艾灸組Beclin-1、LC3-Ⅱ蛋白表達量下降（P<0.05）。詳見圖1、表3。

3 討論

RA屬于中醫(yī)學“歷節(jié)病”“痹病”范疇，多由“正氣不足、復感外邪”所致，正氣虛弱是痹病發(fā)病的內因。素體虛弱，氣血不足，腠理疏松，衛(wèi)外不固；若感受風寒濕熱等外邪，阻滯氣血運行，使關節(jié)、肌肉、經(jīng)絡痹阻不通而形成痹病。針灸治療RA療效顯著，能抗炎消腫止痛，恢復關節(jié)功能[10-11]，常用足三里、關元等穴位[12]。足三里為足陽明胃經(jīng)的合穴，《針灸真髓·澤田派治病特效穴》曰：“三里養(yǎng)先后天之氣，灸三里可使元氣不衰，故稱長壽之灸。”可補益氣血。關元屬任脈，為足三陰經(jīng)與任脈之會，小腸之募穴，可培補元氣。足三里與關元聯(lián)用，先天后天同治，共起溫陽扶正補益之功，治其正虛內因；同時足三里又能起近治之用[13]。

RA是一種全身性自身免疫性疾病，利用滅活的結核分枝桿菌配制的完全弗氏佐劑所誘導的佐劑性關節(jié)炎動物模型，是細菌學家Freund于20世紀50年代創(chuàng)立，作為經(jīng)典的免疫性疾病實驗動物模型廣泛用于RA的病因探索、新藥開發(fā)、新的治療方法的篩選等方面[14]。RA的臨床表現(xiàn)為慢性滑膜炎、關節(jié)組織破壞，最終導致關節(jié)功能受損[15-16]。IL-2與RA滑膜炎癥密切相關，可增加關節(jié)腔內白細胞數(shù)量，使中性粒細胞炎性反應加重，是產(chǎn)生滑膜炎癥的關鍵因子[17]，并可誘導其他炎性因子的表達。RA患者體內IL-2表達水平明顯上升，且和RA病變程度呈正相關[18]。RA最突出的病理特征是滑膜炎與滑膜細胞增殖，該過程可能與細胞自噬密切相關[19-20]。自噬是細胞吞噬自身細胞質或細胞器、與溶酶體融合，形成自噬溶酶體、降解其所包裹的內容物的過程[19]。研究發(fā)現(xiàn)，自噬能調節(jié)滑膜細胞增殖，從而介入RA病程[21]；可調節(jié)、釋放或產(chǎn)生炎癥因子[22-23]。在RA動物模型中，抑制自噬也可以減輕滑膜炎癥[24]。細胞自噬最重要的現(xiàn)象是形成自噬小體，自噬小體成核階段、延伸階段，由Beclin-1、LC3-Ⅱ基因編碼的相關蛋白參與[25]。Beclin-1是與自噬調控相關的關鍵因子，可與Ⅲ型磷脂酰肌醇3-激酶形成復合物，參與自噬體雙層膜的形成，調動相關自噬蛋白質定位于前自噬體，其表達水平上調可誘導自噬發(fā)生[26-27]。Beclin-1是啟動自噬的標志，同時可反映自噬活性、評估其程度并調控其水平[28]。微管相關蛋白1輕鏈3（microtubule-associated protein1 light chain 3，LC3）是檢測自噬發(fā)生的標志性蛋白，并且是首個自噬小體膜蛋白，在自噬過程中，LC3被具有蛋白內切酶活性的自噬蛋白4剪切，生成的LC3-Ⅰ通過Atg3和Atg7參與的泛素樣反應，使其與磷脂酰乙醇胺發(fā)生作用，生成膜結合形式的LC3-Ⅱ，并持續(xù)附著于自噬體膜上。因此，LC3-Ⅱ的表達水平與自噬呈正相關，可用LC3-Ⅱ評估自噬水平表達高低[29-31]。研究表明，RA患者Beclin-1、LC3-Ⅱ蛋白表達量顯著性升高，且Beclin-1、LC3-Ⅱ相對表達水平與疾病活動度相關[32-33]。

本研究發(fā)現(xiàn)，模型組大鼠后足趾容積增大，血清中IL-2含量顯著性升高，滑膜組織Beclin-1、LC3-Ⅱ蛋白表達量顯著性升高，提示大鼠足趾關節(jié)滑膜組織自噬被促進，足趾關節(jié)局部發(fā)生病變，炎性反應增強。艾灸干預后，大鼠足趾容積顯著下降，血清IL-2含量降低，滑膜組織Beclin-1、LC3-Ⅱ蛋白表達量降低，提示艾灸可能通過下調RA滑膜組織Beclin-1、LC3-Ⅱ的表達水平，從而抑制滑膜細胞自噬，以此減輕炎癥反應。

綜上所述，艾灸可能通過下調RA滑膜組織Beclin-1、LC3-Ⅱ的表達水平，抑制自噬活性，改善局部炎性反應，使關節(jié)局部炎性反應得到一定程度糾正，從而緩解RA局部癥狀，發(fā)揮治療RA的生物學效應。

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