昆侖雪菊醇提物對不同模擬體系晚期糖基化終產物生成活性的影響

逄格雨，徐碩，張子豪，張雨晴，于少軒

(山東理工大學 農業(yè)工程與食品科學學院，山東 淄博 255049)

晚期糖基化終產物(advanced glycation end products, AGEs)是非酶糖基化反應(Maillard反應)的終末產物,是蛋白質、脂質或核酸等大分子在沒有酶參與的條件下,與葡萄糖或其他還原性單糖反應所生成的穩(wěn)定的共價加成物[1]。研究表明[2-3],AGEs與糖尿病及其并發(fā)癥、心血管疾病、阿爾茨海默癥、動脈粥樣硬化等多種疾病以及人體衰老密切相關,目前,AGEs已成為影響人類健康的一個慢性風險因素[4]。人體內AGEs的來源包括內源性和外源性兩種途徑,前者主要是指體內過量的糖和蛋白質反應生成的AGEs;后者是通過進食、吸煙等方式將食物或香煙中的AGEs吸收進入體內。與內源性AGEs相比,外源性AGEs在人體AGEs蓄積池中的占比要高得多[5]。因此,控制食品中AGEs的生成進而減少AGEs的膳食攝入對改善國民的健康狀況,提高人們的生活質量,緩解醫(yī)療支出費用負擔具有重要的社會與經濟意義。在保證食品色、香、味的前提下,通過添加外源物質來抑制食品中AGEs生成是目前食品領域備受關注的研究內容之一。多種外源物質如維生素、黃酮、多酚、萜類和不飽和脂肪酸等已經被證明在食品加工過程中對抑制AGEs的生成具有巨大的潛力[6-7]。

昆侖雪菊,學名兩色金雞菊、蛇目菊,為菊科金雞菊屬(Coreopsis)多年生草本植物,在我國新疆和田地區(qū)、云南部分地區(qū)有一定栽培規(guī)模。昆侖雪菊是藥食兩用性植物,含有多種藥理成分,其作為許多保健品的原料,近年來已成為營養(yǎng)學家、藥理學家以及養(yǎng)生專家研究的熱點。目前,國內外對昆侖雪菊的研究主要集中在黃酮、生物堿、揮發(fā)性油、有機酸、氨基酸等成分的分離鑒定和活性評價等方面[8]。雖然從當前研究可以看出昆侖雪菊中的黃酮類活性成分對糖基化反應和氧化反應具有一定的抑制作用[9],但是關于探究昆侖雪菊醇提物抑制食品加工過程中AGEs的生成鮮有報道。因此,本研究分別在40、60、80 ℃ 3個溫度條件下對昆侖雪菊超微粉進行醇提,得到3種醇提物(E1、E2和E3)。通過測定三者的總黃酮含量,選取E1為本實驗研究對象,然后建立乳糖-酪蛋白和葡萄糖-賴氨酸-亞油酸兩種食品模擬體系,探究不同濃度的昆侖雪菊醇提物E1對模擬體系中AGEs生成的影響,以期為開發(fā)價格低廉、方便易得的食品級AGEs抑制劑提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

昆侖雪菊(干花,生產許可證號:QS650114020007),新疆雪菊生物科技有限公司;賴氨酸(純度為98%),上海麥克林生物有限公司;BCA蛋白濃度測定試劑盒,北京康潤誠業(yè)生物科技有限公司;3,5-二硝基水楊酸,上海研生生物技術有限公司;2,4-二硝基苯肼,上海諾泰化工有限公司;葡萄糖、α-乳糖、酪蛋白、亞油酸、茚三酮、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉等,均為分析純,國藥集團化學試劑公司。

1.2 儀器與設備

XL-30C實驗室超微粉碎機,廣州市旭朗機械設備有限公司;UV-1750型紫外-可見分光光度計,島津國際貿易有限公司;RG-18型磁力攪拌器,鞏義市予華儀器有限責任公司;熒光分光光度計,島津國際貿易有限公司;電熱鼓風烘箱DHG-9070A,上海浦東物理光學儀器廠;旋轉蒸發(fā)儀,上海況勝實業(yè)發(fā)展有限公司;循環(huán)水式真空泵,上海凌科實業(yè)發(fā)展有限公司。

1.3 昆侖雪菊醇提物的制備

將洗凈的昆侖雪菊在40 ℃下烘干至恒重,用小型超微粉碎機粉碎后過200目篩,取10 g過篩的昆侖雪菊粉末,用75%乙醇進行索式提取,溶液分別在40 、60、80 ℃水浴上回流提取,固液比為1∶60,回流30 min。將醇提物在40 ℃、96 kPa條件下旋蒸濃縮后轉移到直徑為100 mm的玻璃平皿中,在40 ℃烘箱中干燥至恒重,得到昆侖雪菊醇提物E1、E2、E3,4 ℃冰箱密封避光保存?zhèn)溆谩y定總黃酮含量時用75%乙醇溶液溶解并稀釋至一定體積。

1.4 昆侖雪菊醇提物中總黃酮含量的測定

黃酮類化合物在適當?shù)膲A性條件下,與金屬鋁離子能形成穩(wěn)定的黃色絡合物,在可見光區(qū)域有較大的紫外吸收,該研究采用NaNO2-Al (NO3)3-NaOH比色法測定雪菊醇提物中的總黃酮含量。參考杜鵑等[10]的方法并適當加以改動。分別吸取0.3 mg/mL蘆丁標準液0.3、0.5、0.7、0.9、1.1、1.3、1.5 mL于25 mL比色管中,用75%的乙醇將標準液稀釋至5 mL。加入50 mg/mL的亞硝酸鈉溶液2 mL,搖勻,放置6 min,再加入100 mg/mL的硝酸鋁溶液2 mL,搖勻,放置 6 min,最后加入1 mol/L的氫氧化鈉溶液15 mL,用乙醇定容至刻度,搖勻,放置15 min,于510 nm波長處測定其OD值并繪制出蘆丁標準曲線。精確稱取10 mg昆侖雪菊醇提物,溶解后按照以上方法測定OD值,按照蘆丁標準曲線計算其中的總黃酮含量。平行測定3次取平均值,且根據(jù)測定結果選取總黃酮含量最高的醇提物E進行后續(xù)實驗。

1.5 乳糖-酪蛋白反應體系的構建

參考葛輝[11]的方法并適當加以改動。以pH 6.7,0.2 mol/L磷酸鹽緩沖溶液(PBS)配制24 mg/mL的酪蛋白溶液和50 mg/mL的乳糖溶液。以0.125、0.25、0.5 mg/mL不同質量濃度梯度的昆侖雪菊醇提物E1設置實驗組,對照和空白組不添加昆侖雪菊醇提物。其他試劑的添加如表1所示。將混合溶液充分混勻后置于不同溫度(100 ℃和140 ℃)條件下加熱不同時間(4 h和1 h)。

表1 乳糖-酪蛋白反應體系的構建

1.6 葡萄糖-賴氨酸-亞油酸反應體系的構建

參照岳璐[12]的方法并適當加以改動。精確稱取2 g賴氨酸(20 mg/mL)和2 g葡萄糖用pH 6.7,0.2 mol/L PBS溶解并定容至100 mL,加入0.8 mL吐溫-80,用磁力攪拌器持續(xù)攪拌30 min后,加入0.8 mL亞油酸并繼續(xù)攪拌至溶液澄清,得到葡萄糖-賴氨酸-亞油酸體系。其他試劑的添加如表2所示。將混合溶液充分混勻后置于100 ℃反應條件下加熱2 h。

表2 葡萄糖-賴氨酸-亞油酸反應體系的構建

1.7 不同反應體系中熒光性AGEs的測定

該研究反應體系中的熒光性AGEs用熒光分光光度計測定[13-14], 精確吸取各反應體系樣液1 mL于離心管中,用去離子水稀釋5倍,設定的激發(fā)波長λex=345 nm、發(fā)射波長λem=420 nm,生成的熒光性AGEs強度用AU表示。昆侖雪菊醇提物對熒光性AGEs形成的抑制率[15]I1為

I1=(F2-F1)/(F2-F3)×100%,

(1)

式中:F2為對照組的熒光強度,F1為雪菊醇提物實驗組的熒光強度,F3為空白組的熒光強度。

1.8 不同反應體系中賴氨酸/賴氨酸殘基的測定

參考全紅麗[16]的方法并適當加以改動。對各反應體系透析蛋白處理后,根據(jù)BCA蛋白濃度測定試劑盒操作說明,配制工作液并于波長562 nm處測定OD值,得到蛋白標準曲線。分別取2 mL各反應體系樣液于離心管中對蛋白質定量后加入2 mL茚三酮試劑,充分混勻,80 ℃下水浴30 min,然后冷卻至室溫后用PBS定容至10 mL,搖勻,在562 nm處測定其OD值。以空白組中的賴氨酸/賴氨酸殘基含量為1,實驗組和對照組的賴氨酸/賴氨酸殘基相對含量C為

C=A/A°×100%,

(2)

式中:A表示對照組或不同濃度雪菊醇提物實驗組的吸光度,A°表示空白組的吸光度。

1.9 反應體系中酪蛋白羰基化程度的測定

參考段麗菊等[17]的方法并適當加以改動。選取乳糖-酪蛋白體系140 ℃反應1 h的各反應體系,對蛋白質定量后,取100 μL樣液與400 μL、10 mmol/L 2,4-二硝基苯肼(2,4-dinitrophenylhydrazine,DNPH)溶液充分混合后在室溫下暗處孵育1 h,每隔10 min漩渦1次。反應完畢后,向混合溶液中加入500 μL、0.2 g/mL的三氯乙酸(TCA),在4 ℃下,以12 000g的轉速離心15 min,棄上清。得到的沉淀用1 mL乙醇和乙酸乙酯混合物洗滌3次,后用1.25 mL、6 mol/L的鹽酸胍在37 ℃條件下水浴15 min,使其溶解并以12 000g的轉速離心15 min,取上清,在波長370 nm處測定其OD值。乳糖-酪蛋白反應體系中酪蛋白羰基化程度抑制率I2為

I2=(A2-A1)/(A2-A3)×100%,

(3)

式中:A2表示370 nm處對照組的吸光度,A1表示370 nm處雪菊醇提物實驗組的吸光度,A3表示370 nm處空白組的吸光度。

1.10 反應體系中葡萄糖余量的測定

參考趙凱等[18]的方法并適當加以改動。將葡萄糖標準溶液由1 mg/mL稀釋為0.5 g/L,吸取標準溶液5次,分別為0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL,并逐一補水至1 mL,加入3,5-二硝基水楊酸(dinitrosalicylic acid,DNS)試劑1.5 mL,搖勻,在波長550 nm處測定OD值,并繪制出葡萄糖標準曲線。取各反應體系樣液1 mL,加入DNS試劑1.5 mL,其他操作與上述方法相同,并通過葡萄糖標準曲線計算出葡萄糖-賴氨酸-亞油酸各反應體系中的葡萄糖余量。

1.11 數(shù)據(jù)處理

本論文中所有試驗重復3次,數(shù)據(jù)均用Origin作圖,結果用均數(shù)±標準差(x±s)表示。使用SPSS 16.0進行統(tǒng)計分析,組間差異顯著性分析采用方差分析,當P<0.05時認為差異顯著。

2 結果與分析

2.1 昆侖雪菊醇提物中總黃酮含量

以吸光度y為縱坐標、濃度x為橫坐標繪制出蘆丁標準曲線(圖1),通過線性擬合得到R2為0.999 7的標準曲線方程:y=27.67x+0.017 6。據(jù)此計算出不同溫度條件下得到的昆侖雪菊醇提物E1、E2和E3中總黃酮含量(以蘆丁當量表示)分別為0.438、0.416、0.384 mg/mL。由圖2可以看出,E1中總黃酮含量最高,因此本研究選取了醇提物E1作為研究對象進行后續(xù)實驗。徐瑩等[19]報道過類似的結果,其發(fā)現(xiàn)提取溫度超過55 ℃時,黃酮類化學物的結構遭到破壞,導致提取量降低。

圖1 蘆丁標準曲線

注:a～c不同字母表示具有顯著性差異(P<0.05)。圖2 昆侖雪菊醇提物中總黃酮含量

2.2 昆侖雪菊醇提物E1對酪蛋白-乳糖體系中AGEs生成的影響

2.2.1 不同熱處理條件下E1對酪蛋白-乳糖體系中熒光性AGEs生成的抑制作用

目前已被發(fā)現(xiàn)的AGEs有近40種,根據(jù)其是否具有特征性熒光,可以分為熒光性AGEs和非熒光性AGEs兩大類[20]。其中,熒光性AGEs因具有檢測方便、靈敏度高等特點而被大量研究作為目標物進行檢測分析,間接反映體系中AGEs的總量。由圖3(a)可以看出,與酪蛋白相比,酪蛋白-乳糖體系在100 ℃加熱4 h后,其熒光光譜在420 nm處有一個顯著的熒光發(fā)射峰。但是,添加了不同濃度的昆侖雪菊醇提物E1后,該熒光發(fā)射峰的熒光強度逐漸降低。由圖3(b)可知,0.125、0.25、0.5 mg/mL醇提物E1對熒光性AGEs的抑制率分別為9.89%、21.44%、55.73%。因此,昆侖雪菊醇提物E1能夠抑制酪蛋白-乳糖體系中熒光性AGEs的生成,且具有明顯的濃度依賴性,這與夏秋琴[21]的研究結果有相同趨勢,其發(fā)現(xiàn)在溫度為100 ℃的酪蛋白-乳糖反應體系中,隨著染料木黃酮添加量的增加,抑制熒光性AGEs產生的量逐漸增強。由圖3(c)和圖3(d)可知,在此前的基礎上提高溫度并縮短反應時間,昆侖雪菊醇提物E1在140 ℃加熱1 h的條件下也能夠抑制熒光性AGEs的生成,此時,0.125、0.25、0.5 mg/mL醇提物E1對熒光性AGEs的抑制率分別為14.30%、55.51%、70.44%,表明昆侖雪菊醇提物E1在該加熱條件下對熒光性AGEs的抑制效果更強一些。

(a)100 ℃加熱4 h的熒光光譜

2.2.2 E1對賴氨酸/賴氨酸殘基的保護能力

賴氨酸是發(fā)生糖基化反應形成復雜的AGEs的主要氨基酸,游離賴氨酸含量能夠反映反應體系的糖基化程度,賴氨酸含量越高,認為糖基化程度越低[22]。對照組因發(fā)生非酶糖基化反應,其所含賴氨酸相對含量為0.583%,隨著反應體系中E1濃度從0.125 mg/mL上升到0.5 mg/mL,賴氨酸的相對含量由0.608%增加到0.927%(圖4),說明隨反應體系中醇提物E1濃度的逐漸升高,非酶糖基化反應進行的程度逐漸降低,E1對乳糖-酪蛋白反應體系中AGEs生成的抑制作用逐漸增強。張宇臣等[23]有過類似發(fā)現(xiàn),即不同濃度的褐藻多酚可以有效提高牛血清蛋白與葡萄糖體外模擬體系中賴氨酸與葡萄糖的含量。

注:a～d不同字母表示具有顯著性差異(P <0.05)。圖4 E1對酪蛋白-乳糖體系中賴氨酸/賴氨酸殘基保護能力對比圖

2.2.3 E1對酪蛋白羰基化程度抑制率

蛋白質羰基化是在氧化損傷過程中表現(xiàn)出的蛋白質結構與功能不可逆的損傷[24],通過測定反應體系中酪蛋白羰基化程度可以判斷美拉德反應進行的程度。如圖5所示,添加3種不同濃度雪菊醇提物E1的反應體系中,酪蛋白羰基化程度抑制率從36.40%迅速上升到64.37%,且三者之間存在明顯的顯著性差異(P<0.05),表明昆侖雪菊醇提物E1能夠抑制乳糖-酪蛋白體系中酪蛋白羰基化程度,具有明顯的濃度依賴性。

注:a～c不同字母表示具有顯著性差異(P<0.05)。圖5 E1對酪蛋白羰基化程度抑制率對比圖

2.3 昆侖雪菊醇提物E1對葡萄糖-賴氨酸-亞油酸體系中AGEs生成的影響

2.3.1 不同熱處理條件下E1對葡萄糖-賴氨酸-亞油酸體系中熒光性AGEs生成的抑制作用

由圖6(a)可知,與酪蛋白-乳糖反應體系相似,100 ℃反應4 h后,該體系熒光光譜在420 nm處同樣有一個非常明顯的熒光發(fā)射峰。與對照組相比,添加醇提物E1的各反應體系熒光強度隨著E1濃度的升高而逐漸降低。由圖6(b)可知,添加濃度為0.5 mg/mL醇提物E1的實驗組,抑制效果最為明顯,抑制率達到58.25%。夏秋琴[21]得到過類似結果,其發(fā)現(xiàn)在賴氨酸-核糖體系中,隨著抑制劑染料木黃酮濃度的不斷增加,其對熒光性AGEs的抑制效果逐漸增強。

(a)熒光光譜

2.3.2 E1對賴氨酸/賴氨酸殘基的保護能力

為進一步研究昆侖雪菊醇提物E1對AGEs生成的抑制作用,本研究測定了不同反應體系中賴氨酸的含量變化并進行比較分析。2.2.2中提到,賴氨酸為非酶糖基化反應的底物,對照組賴氨酸相對含量為0.586%,處于比較低的水平,添加0.125、0.25、0.5 mg/mL醇提物E1的反應體系中,賴氨酸的相對含量分別升高至0.691%,0.754%、0.892%(圖7),均高于對照組,且四者之間具有顯著性差異,表明E1對賴氨酸的保護效果較好。

2.3.3 E1對葡萄糖余量的影響

通過線性擬合得到R2為0.999的標準曲線方程:y=0.667x-0.066 2,據(jù)此計算出空白組的葡萄糖余量為4.81 mg/mL,反應體系中添加0.125、0.25、0.5 mg/mL E1時,體系中葡萄糖余量分別為4.51、4.03、3.55 mg/mL。葡萄糖余量最高的是添加E1的反應組,與2.1的實驗結果相互印證,說明葡萄糖余量最高的實驗組中添加的雪菊醇提物E中總黃酮含量最高。

3 結論

1)昆侖雪菊醇提物對AGEs的生成具有顯著的抑制作用。熱處理溫度分別為100 ℃和140 ℃時,0.5 mg/mL雪菊醇提物E1對乳糖-酪蛋白和葡萄糖-賴氨酸-亞油酸反應體系中AGEs的抑制率分別可達70.44%和58.25%。

2)兩反應體系中的賴氨酸/賴氨酸殘基相對含量、酪蛋白羰基化抑制率以及葡萄糖余量均有很大程度提高。昆侖雪菊醇提物可能與賴氨酸殘基反應抑制蛋白質的糖基化,從而降低AGEs的生成。

3)本研究探討了昆侖雪菊醇提物在抗氧化、抗糖基化方面的食用價值,并將其應用到抑制AGEs生成的研究中,為AGEs抑制劑的研究提供了一定的數(shù)據(jù)參考。