鮑曼不動桿菌耐藥基因及檢測手段

朱奕衡 竭晶 宋磊 羅招慶

(吉林大學第一醫院 1感染與免疫中心,吉林 長春 130021;2呼吸與危重癥醫學科)

鮑曼不動桿菌是一種普遍存在的革蘭陰性需氧球桿菌。由于基因組可塑性強,在遺傳學水平上鮑曼不動桿菌的不同分離株之間存在高度異質性〔1,2〕。作為“逃逸”菌株之一,鮑曼不動桿菌擁有多重耐藥性和很強的抗逆性,從而避免抗菌劑的作用。由于其對大腸桿菌素,替加環素和碳青霉烯類等最后抗生素方案的耐藥性,因而被世界衛生組織和美國疾病控制和預防中心列為“高度優先”,成為最具有威脅性的ESKAPE病原體之一〔3〕。其可以透過皮膚或呼吸道缺陷的病人進行傳播,也會經由重癥監護室中呼吸機呼吸的患者進行進一步的院內傳播,老年人因多重耐藥鮑曼不動桿菌引起的菌血癥使得其死亡風險增加近5倍,鮑曼菌血癥是引起30 d住院死亡率最高的獨立危險因素,因此鮑曼不動桿菌感染成為重癥監護患者或易受感染患者的主要風險因素。鮑曼不動桿菌感染一般會引起皮膚,軟組織或傷口感染、菌血癥、心內膜炎、尿路感染、腦膜炎和肺炎。鮑曼不動桿菌的血液感染導致的死亡率為28%～43%〔4,5〕。本文總結了目前藥物抗菌活性的常用測定方法,并對鮑曼不動桿菌耐藥基因及檢測方法的研究進展進行綜述,以期為研究鮑曼不動桿菌感染的臨床與科研工作者做參考。

1 鮑曼不動桿菌的抗藥性檢測

2.1體外抗菌活性的測定 體外抗菌活性測定可以直接評估抗菌藥物的有效性,并確定抗菌劑對相應菌株的最低抑菌濃度(MIC)和最低殺菌濃度(MBC)。目前有大量的方法用于確定病原體對于何種抗生素敏感,這些方法被統稱為抗微生物藥敏試驗。

上述技術都是基于微生物生長表型進行的,是普遍表型敏感性測試,這種方式具有普適性,機制已知且獨立具有明確的表型分類。但這種檢測手段依賴細菌的生長和相關產物的表達,因而需要不斷摸索合適的實驗條件及檢測手段。現如今已經開發出多種檢測手段包括但不限于以下方法:圓盤管法〔6〕:基于生長介質濁度評估;pH指示劑比色法〔7〕:含酚紅指示劑培養基中測定細菌生長;氧化還原劑比色法〔8〕:含氧化還原指示劑培養基中測定細菌生長;培養盤擴散法〔9〕:短暫孵育到含抗菌劑的培養盤中對抑制區進行視覺評估;微流瓊脂糖通道系統〔10〕:微流體通道中固定在瓊脂糖基質中的細菌并使用顯微鏡檢測單個細胞生長;前向激光散射〔11〕:使用激光的散射率測定細菌生長;數字延時顯微鏡〔12〕:液體樣品中的連續成像光學檢測;微生物細胞質量測量〔13〕:通過微通道測定細菌生長;恒溫微量熱測定〔14〕:通過產熱測定細菌生長;實時聚合酶鏈反應(PCR)〔15〕:在液體培養基中孵育后實時定量測定16 S RNA基因或rpoB的DNA拷貝;ATP熒光定量〔16〕:熒光素-熒光素酶與細菌ATP反應生成光,通過此測定細菌生長;熒光素酶報告噬菌體〔17〕:使用包含熒光素酶報告基因的噬菌體感染細菌,通過定量光的程度推定細菌生長程度;形態動力學細胞分析〔18〕:將細菌固定在平面并用數字顯微鏡記錄微生物對單一濃度抗生素的反應;流式細胞術〔19〕:通過評估細胞形態功能等參數判別藥物對細菌的損傷;MALDI-TOF MS直接靶向微滴生長測定〔20〕:將微生物作為微滴培養在MALDI靶上并使用MALDI-TOF MS測量。

另一類是特定抗性機制的檢測,常見方法是以靶向耐藥基因或序列進行DNA擴增法,免疫色譜分析或抗生素降解分析檢測特定的耐藥機制。抗生素降解分析主要是通過比色或基于基質輔助激光解吸/電離飛行時間質譜(MALDI-TOF MS)完成〔21〕。以上方法特點是可以快速篩選出特定的抗生素抗性并可以確定對應抗生素抗性的機制,但對于某些抗生素如碳青霉烯類抗生素透性升高或降低,難以通過該方法檢測。以上方法敏感性和特異性不能達到100%,即陰性的結果并不意味著對檢測的抗生素敏感,陽性結果也無法證明對相應的抗生素有抗性〔22〕。

通過全基因組測序(WGS)進行多種單一耐藥測檢測仍有問題亟待解決:對于單一抗生素的耐藥基因,是否了解的全面且可靠,對于耐藥基因的檢測是否足夠靈敏專一。雖然通過機器學習算法和通過RNA測序檢測基因表達水平等方法已經開始研究并被用于改進全基因組測序,但這些方法仍無法取代普遍的表型敏感性測試〔23〕。

2.2耐藥基因的獲取機制和定位 鮑曼不動桿菌株中有著多種耐藥機制,如β-內酰胺酶、氨基糖苷修飾酶、外排泵、滲透性缺陷和靶位點修飾等。鮑曼不動桿菌抗藥基因產生機制主要包含3種:一是通過酶修飾抗菌藥物,這其中包含氨基糖苷修飾酶(AMEs)介導的抗藥產生,使細菌獲得氨基糖苷類抗生素抗藥性;另一種是碳青霉烯水解D類(CHDL)β-內酰胺酶介導的抗藥產生,使細菌獲得β-內酰胺類,碳青霉烯類,頭孢菌素類,青霉素類抗生素抗藥性。第二種抗藥產生機制是改變目標靶點或細胞功能,這其中包含修飾宿主細胞包膜結構,主要通過改變磷脂酶作用,改變脂質和多糖,改變生物膜的形成或產生多種包括激活多種生物反應調節劑(TCS)包括AdeRS、BaeSR、pmrAB、BfmRS、GacSA等使細菌獲得氨基糖苷類,替加環素,呋喃醌類,黏菌素,多黏菌素,黏菌蛋白等抗生素的抗藥性。另一種途徑是通過突變或拓撲多種包括青霉素結合蛋白(PBP)、DNA旋轉酶fyrA、parC、16sRNA甲基化酶或二氫葉酸還原酶等異構酶使抗菌藥物改變作用靶點并獲得亞胺培南、氟喹啉、四環素、甲氧芐啶扽多種抗生素抗性。最后一種抗藥性產生機制是限制抗生素進入目標部位,主要是通過上調包括RND、MATE、MFS、SMC家族在內的藥物外排泵排除抗生素,使細菌獲得氨基糖苷類、替吉西林、氟喹啉類、紅霉素、氯霉素抗生素抗性;另一種情況是因為OmpA、CarO的丟失或Porin通道表達減少使細菌產生外膜滲透性缺陷并產生碳青霉烯類黏菌素,青霉素抗生素抗性。

2.2.1β-內酰胺酶抗性基因的定位 不動桿菌對β-內酰胺酶的耐藥性部分是固有的,如銅綠假單胞菌中AmpC型頭孢菌素酶賦予其β-內酰胺酶耐藥性已經被證實。鮑曼不動桿菌通過頻繁的基因水平轉移使之高頻率與外源DNA結合獲得β-內酰胺酶的耐藥性。β-內酰胺酶是在鮑曼不動桿菌中發現最多的一類耐藥基因〔24〕。β-內酰胺酶的耐藥基因檢測大部分基于聚合酶鏈式反應(PCR)的靶向宏基因組學,通過追蹤不同生態系統內部和系統之間的抗性基因或家族進行對應抗性基因引物的設計從而確定待測菌落包含相應基因的有無〔25〕。同樣也可以使用實時PCR以獲得半定量數據從而確定出不同生態系統中不同基因的相對豐度,部分的基因是通過微列陣技術檢測〔26〕。

β-內酰胺酶主要分為4類,A類是經典β-內酰胺酶,包括抑制青霉素和窄譜頭孢菌素的TEM和SHV家族,這其中也有部分成員擁有滅活廣譜β-內酰胺酶的能力,如頭孢噻肟酶(CTX)-M類被稱為廣譜β-內酰胺酶ESBLs。A類β-內酰胺酶也包括碳青霉烯酶如肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶(KPC),亞胺培南水解(IMI)型β-內酰胺酶和黏質沙雷菌酶(SME)等。除了少數KPC型酶外,A類碳青霉烯類主要被克拉維酸抑制,并可以更加有效地水解青霉素或頭孢霉素〔27〕。在鮑曼不動桿菌中已發現多種包括TEM、SHV、圭亞那超廣譜(GES)型β-內酰胺酶、CTX-M、SCO、假單胞菌擴展耐藥性(PER)、越南超廣譜(VEB)型β-內酰胺酶、KPC和羧青霉素水解(CARB)型β-內酰胺酶在內的多種A類β-內酰胺酶〔2〕。B類β-內酰胺酶是一種需要鋅離子或其他金屬離子催化的金屬β-內酰胺酶,主要包含新德里金屬β-內酰胺酶(NDM)、維羅納整合素編碼金屬(VIM)型β-內酰胺酶和亞胺培南耐藥假單胞菌(IMP)家族〔27〕。在鮑曼不動桿菌已鑒定出多種包括IMP、VIM、NDM家族和SIM-1在內的多種B類β-內酰胺酶〔2〕。C類β-內酰胺酶一般被稱為頭孢菌素(AmpC)酶,代表性的C類β-內酰胺酶包括頭孢霉毒水解(CMY)型β-內酰胺酶,AmpC(ACT)型β-內酰胺酶和沙特阿拉伯達蘭醫院(DHA)型β-內酰胺酶。通常具有C類β-內酰胺酶的革蘭氏陰性菌具有青霉素和部分頭孢霉素的抗性,但不會對克拉維酸顯著抑制〔27〕。在鮑曼不動桿菌中已經發現AmpC型β-內酰胺酶〔2〕。D類β-內酰胺酶包含苯唑西林酶(OXA)家族,其成員具有青霉素類,頭孢菌素類和碳青霉烯類的抗性〔27〕。400多種OXA型酶已經在鮑曼不動桿菌中被鑒定。

2.2.2外排泵耐藥基因的定位 在革蘭陰性菌中,細胞外膜限制了抗菌劑進入細胞的速度,外排泵也會主動將多種結構不同的抗菌藥物排出細胞外。外排泵在細菌致病性和多藥耐藥中被反復提及,外排泵排出的最常見的抗菌藥物包含大環內酯類、四環素類、喹諾酮類、氨基糖苷類、氟喹諾酮類、氯霉素、紅霉素、替加環素等,鮑曼不動桿菌被證實對基于外排泵機制的抗菌藥物如替加環素和亞胺培南具有耐藥性〔28,29〕。

外排泵一般有6類:ATP結合盒(ABC)家族、耐藥結節化因子(RND)超家族、主要促生因子(MFS)超家族、多藥及毒性化合物外排轉運蛋白(MATE)家族、藥物/代謝產物轉運蛋白(DMT)超家族和小多藥耐藥(SMR)家族轉運蛋白〔30〕。與鮑曼不動桿菌耐藥性相關的是RND超家族、MFS超家族、MATE家族和SMR家族轉運蛋白〔2〕。基因定位手段類似于β-內酰胺酶類家族,通過靶向PCR或全基因組測序得知相應的抗性基因。

第一個被發現因為外排泵而產生耐藥性的基因是AdeABC。擁有該基因的鮑曼不動桿菌首先被發現具有氨基糖苷類耐藥性,而部分RND型外排泵被證明具有氨基糖苷類耐藥性。后續通過靶向PCR證明了鮑曼不動桿菌中包含了adeB基因,隨后通過基因測序發現3個相鄰基因adeA、adeB和adeC的推斷產物與構成RND型多藥外派系統的蛋白質高度類似,因此推斷鮑曼不動桿菌中包含AdeABC泵。通過RNA雜交發現AdeRS雙組分系統嚴格調控AdeABC的表達,僅當AdeRS雙組分系統功能缺失時導致AdeABC泵組成性表達,從而導致抗生素耐藥性〔29〕。溴化乙錠是RND多藥轉運蛋白的有效且常見底物。使用溴化乙錠篩選鮑曼式桿菌的選定分離株,以確定是否存在外排泵〔31〕。由于RND系統在革蘭陰性菌中普遍存在,因此不斷有新的RND家族的成員被發現,后來有研究人員開發了一種居于寡核苷酸的DNA微陣列,用于評價鮑曼不動桿菌外排泵基因的表達,大大加速了外排泵相關研究的進程〔26〕。

在功能性宏基因組中,從待檢測的細菌混合物中提取DNA并將其鳥槍克隆到合適的載體中以生成基因文庫。通過對轉入基因文庫的大腸桿菌進行氯霉素篩選發現了TetA基因〔32〕。這種方法不同于以往的靶向PCR,該方法可以篩選出未知的抗性基因。其中AbeM的發現同樣使用了類似的思路〔33〕。隨后在2012年發明了一種新的高通量功能宏基因組的方法,這是一種大規模平行的,可同時進行多功能進行選擇的平臺,可以對數百個獨立選擇的抗性片段進行復制,被稱為功能性宏基因組的平行注釋和重組的篩選(PARFuMS)〔34〕。后續發現的外排泵耐藥基因多是通過基于同源搜索或比較基因組學的方法對鮑曼不動桿菌中可能的外排泵進行搜尋或通過靶向PCR進行定位并尋找〔35〕。

2.2.3滲透性缺陷相關基因的定位 孔蛋白形成的通道對分子跨越外膜運輸和毒力發揮起到重要作用。當一些孔蛋白表達減少時(CarO、Omp家族)導致鮑曼桿菌與碳青霉烯類抗生素(如亞胺培南,氨曲南,氯霉素和萘啶酸等)抗性增加〔36〕。研究發現,OmpA和CarO與OXA-23碳青霉烯酶發生物理相互作用,這種相互作用和抗生素耐藥性相關〔37〕。除外膜蛋白外,LPS或肽聚糖缺失也會影響鮑曼不動桿菌抗藥性,如LPS的缺失或修飾會降低鮑曼不動桿菌膜的完整性并增加大腸桿菌素抗性〔38〕。

2000年首次發現OmpA表達的減少與碳青霉烯的耐藥性相關〔39〕。后續的多個Omp家族的蛋白都是通過質譜比較菌株之間的外膜蛋白的表達差異,測序和蛋白數據庫等方法來確認相關基因〔40〕。一種典型的參與鮑曼不動桿菌亞胺培南和美羅培南耐藥性的孔蛋白CarO的發現是通過對比兩株菌株的OMP表達差異時發現亞胺培南的耐藥性和29 kD的外膜蛋白的缺失相關。經過實驗驗證這29 kD的OMP缺失增加了與亞胺培南的抗性并通過實驗定位到了CarO這個基因上,同時發現多種天然鮑曼不動桿菌的碳青霉烯耐藥性是由于不同的插入元件破壞了CarO的完整性導致的〔41〕。

2.2.4氨基糖苷修飾酶相關基因的定位 氨基糖苷類修飾酶是鮑曼不動桿菌對氨基糖苷類抗生素耐藥的主要機制,酶是機制不通順。氨基糖苷類修飾酶主要分為乙酰轉移酶,腺苷轉移酶和磷酸轉移酶〔34〕。編碼氨基糖苷修飾酶的基因可以位于質粒或轉座子上,有研究發現在Ⅰ類整合子上也出現了氨基糖苷修飾酶,在鮑曼不動桿菌中已鑒定出了6種編譯氨基糖苷修飾酶的基因,都是通過靶向PCR鑒定并得到的,其中磷酸纖維素紙可以用于鑒定氨基糖苷修飾酶的活性〔42〕。

2.2.5抗生素靶點的轉變相關基因的定位 抗菌劑的靶點的重要特征是在微生物的生長生存中起到重要作用,因此會造成對應微生物破裂死亡或者抑制生長并且該靶點不應該存在于哺乳動物中或與哺乳動物中相應靶點充分不同〔5〕。例如作用于轉肽酶或轉糖酶的抗生素僅作用于微生物,而類似作用域蛋白質合成相互作用的藥物,如氨基糖苷類、四環素類、大環內酯類、氯霉素類等;或作用于RNA聚合酶;如利福梅素;或作用于染色體分離(喹諾酮類)和完整性(甲硝唑);或作用于葉酸代謝如三聚體和嘧啶,其雖在哺乳動物中存在相應靶點,但差異性足以選擇性抑制細菌的對應生理反應〔2〕。

因此,在長期抗生素的選擇壓力下,部分生物體相應的靶點發生突變并降低對應抗生素的敏感性并保證細胞的基本生理功能。最先被發現因為抗生素靶點轉變導致的細菌耐藥性是青霉素結合蛋白(PBPs)的改變。在檢測不到β-內酰胺酶的情況下,鮑曼不動桿菌中改變后的低親和力的PBPs過度表達增加了對亞胺培南的抗性,因而推測PBPs的改變增加了鮑曼不動桿菌對亞胺培南的抗性〔43〕。隨后多個參與抗生素靶點改變的基因,如DNA旋轉酶GyrA/ParC,二氫葉酸還原酶DHFR和FolA,脂多糖PmrC等都是通過靶向PCR或測序等手段定位到對應的關鍵耐藥基因〔44〕。

綜上,由于臨床多藥耐性鮑曼不動桿菌的流行,嚴重威脅重癥監護室中危重患者和老年患者的生命健康,因此對鮑曼不動桿菌的研究刻不容緩,無論是臨床還是科研對于鑒定菌株的耐藥和相關基因都是必要的。鮑曼不動桿菌具有所有細菌耐藥機制,并且所有的β-內酰胺酶在鮑曼不動桿菌都得到了檢測。除此之外,幾乎所有的鮑曼不動桿菌中都包含氨基糖苷修飾酶,眾多外排泵介導的耐藥也陸續地得到檢測。現如今最有效的治療手段依舊停留在黏桿菌素與其他抗生素聯合治療,鮑曼不動桿菌的致病機制已進行了廣泛研究,多種毒力蛋白被發現,但其無窮無盡的獲取抗生素的能力在世界范圍內引起臨床耐藥株檢出率越來越高,致死率也在不斷升高。