山奈酚調控ROS/TXNIP通路對膝骨關節炎大鼠軟骨細胞氧化及炎性損傷的改善作用

王飛 梅群超 馮晶 李宏軍 汪伯毅 李含章

(1武漢市第一醫院中醫部,湖北 武漢 430022;2湖北中醫藥大學針灸骨傷學院;武漢市第一醫院 3骨科;4創面修復與周圍血管科)

膝骨關節炎(KOA)是骨性關節炎(OA)的一種,常見于中老年人群。關節軟骨的退變與繼發性骨質增生是KOA的主要病變特征,而關節疼痛、腫脹及晨僵是KOA的典型表征〔1〕。由于已經損壞的關節軟骨不能修復,所以KOA不能徹底治愈。目前,臨床上常采用藥物治療來緩解KOA患者病癥,傳統中藥不僅價格低廉、副作用低,還具有明顯的治療效果〔2〕。山奈酚是在多種中藥和食物中廣泛存在的黃酮類化合物,具有多種生理作用,如抗炎、抗氧化、抗腫瘤等〔3〕。已有研究〔4,5〕表明,山奈酚能夠通過抑制絲裂原激活蛋白激酶相關的細胞外信號調節激酶和P38信號通路,抑制IL-1β誘導的炎癥反應,進而對大鼠軟骨細胞OA產生保護作用。然而,目前有關山奈酚治療KOA的研究較少。活性氧/硫氧還原蛋白相互作用蛋白(ROS/TXNIP)通路是研究較多的與炎性反應相關的信號通路。相關文獻〔6,7〕顯示,ROS/TXNIP通路的阻滯對大鼠心肌缺血/再灌注損傷及急性胰腺炎肺損傷有改善作用。本研究將通過構建KOA大鼠模型探討山奈酚對大鼠膝關節軟骨組織損傷的影響,并進一步探究其與ROS/TXNIP通路的關系。

1 材料與方法

1.1主要試劑、儀器 山奈酚(成都儀睿生物科技有限公司);ROS/TXNIP通路激活劑氧化三甲胺(TMAO,武漢鼎信通藥業有限公司);蘇木素-伊紅染色液(北京中杉金橋生物技術公司);活性氧熒光探針DCFH-DA(購自北京百奧萊博科技有限公司);一氧化氮(NO)、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)和谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)檢測試劑盒(武漢賽培生物科技有限公司);腫瘤壞死因子(TNF)-α、白細胞介素(IL)-1β和IL-6 ELISA試劑盒上海酶聯生物科技有限公司);TXNIP、核苷酸結合寡聚化結構域樣受體蛋白(NLRP)3一抗及相應二抗(美國Abcam公司)。倒置熒光顯微鏡,購自日本奧林巴斯;流式細胞儀,購自貝克曼庫爾特公司;凝膠成像儀,購自美國伯樂公司。

1.2實驗動物 45只7～8周齡健康雄性SPF級SD大鼠,體質量為210～230 g,購自北京科興中維生物技術有限公司,動物許可證號為SYXK(京)2020-0054。本研究獲得醫院動物實驗倫理委員會批準。

1.3實驗分組、模型構建與給藥方法 45只大鼠隨機分為即假手術組、模型組、山奈酚組、TMAO組和山奈酚+TMAO組,每組各9只。假手術組除外,其余各組均參考Wang等〔8〕使用的改良Hulth法構建KOA大鼠模型。模型構建成功后,山奈酚組灌胃50 mg/kg山奈酚〔9〕,TMAO組灌胃110 mg/kg ROS/TXNIP通路激活劑TMAO〔10〕,山奈酚+TMAO組灌胃50 mg/kg山奈酚和110 mg/kg ROS/TXNIP通路激活劑TMAO,模型組和假手術組分別灌胃等量的生理鹽水,1次/d,持續8 w。

1.4膝關節軟骨組織損傷評分 各組使用3%戊巴比妥鈉進行麻醉,然后解剖兩側膝關節,取出左后肢內踝軟骨,分成兩份,1份用于制備石蠟切片,另1份置于-80 ℃冰箱中保存待用。甲醛固定軟骨組織將其制備成石蠟切片,脫蠟后采用蘇木素溶液染色30 min,自來水沖洗后將切片置于乙醇溶液中靜置10 s,取出后用伊紅溶液染色3 min,酒精脫水后利用倒置熒光顯微鏡觀察大鼠軟骨組織形態變化,并對其退變程度進行Mankin評分。

1.5ROS水平測定 取出-80℃冰箱中保存的各組大鼠部分軟骨組織,勻漿后,將其置于稀釋過的DCFH-DA中,上下顛倒混勻,20 min后使用磷酸(PBS)清洗3次,然后采用流式細胞儀在488和525 nm激發光處觀察熒光強度。

1.6NO、SOD、MDA和GSH-Px含量測定 取出-80 ℃冰箱中保存的各組軟骨組織,采用組織磨碎儀磨成勻漿,然后進行離心,取上清,按照Griess法測定NO水平,并按照SOD、MDA和GSH-Px檢測試劑盒說明測定。

1.7TNF-α、IL-1β和IL-6含量測定 按照ELISA試劑盒方法檢測軟骨組織中TNF-α、IL-1β、IL-6水平。

1.8TXNIP和NLRP3蛋白表達水平的測定 提取各組大鼠的軟骨組織勻漿總蛋白,定量后進行電泳,經過轉膜、封閉后,依次加入TXNIP、NLRP3一抗及相應二抗,孵育后加入ECL發光試劑顯影,然后以β-actin作為內參蛋白,利用凝膠成像儀分析TXNIP和NLRP3蛋白表達水平。

1.9統計學分析 采用SPSS22.0軟件進行方差分析,進一步兩兩比較使用LSD-t檢驗。

2 結 果

2.1山奈酚對各組膝關節軟骨損傷的影響 假手術組膝關節軟骨細胞排列整齊;與假手術組比較,模型組和TMAO組膝關節軟骨損傷嚴重,細胞排列紊亂;與模型組相比,山奈酚組膝關節結構逐漸恢復,軟骨細胞也恢復整齊排列;而與山奈酚組比較,山奈酚+TMAO組膝關節軟骨損傷加重,見圖1。模型組Mankin評分顯著高于假手術組(P<0.05);山奈酚組Mankin評分顯著低于模型組(P<0.05);山奈酚+TMAO組Mankin評分顯著高于山奈酚組(P<0.05);TMAO組與模型組Mankin評分無顯著變化(P>0.05),見表1。

2.2山奈酚對各組軟骨組織中ROS水平的影響 與假手術組相比,模型組ROS水平顯著升高(P<0.05);與模型組相比,山奈酚組ROS水平顯著降低(P<0.05),TMAO組ROS水平無明顯變化(P>0.05);與山奈酚組相比,山奈酚+TMAO組ROS水平顯著升高(P<0.05),見表1。

2.3山奈酚對各組軟骨組織氧化損傷的影響 與假手術組相比,模型組軟骨組織中NO和MDA含量明顯增加,SOD和GSH-Px含量明顯減少(P<0.05);與模型組相比,山奈酚組軟骨組織中NO和MDA含量明顯下降,SOD和GSH-Px含量明顯上升(P<0.05),而TMAO組軟骨組織中NO、MDA、SOD和GSH-Px含量差異無統計學意義(P>0.05);與山奈酚組相比,山奈酚+TMAO組軟骨組織中NO和MDA含量明顯升高,SOD和GSH-Px含量明顯降低(P<0.05),見表1。

圖1 各組膝關節軟骨損傷比較(蘇木素-伊紅染色,×200)

表1 各組膝關節軟骨損傷、ROS水平、軟骨組織氧化損傷指標

2.4山奈酚對各組軟骨組織炎性損傷的影響 模型組軟骨組織TNF-α、IL-1β和IL-6含量明顯高于假手術組(P<0.05);山奈酚組軟骨組織TNF-α、IL-1β和IL-6含量明顯低于模型組(P<0.05),而TMAO組與模型組軟骨組織TNF-α、IL-1β和IL-6含量無明顯差異(P>0.05);山奈酚+TMAO組軟骨組織TNF-α、IL-1β和IL-6含量明顯高于山奈酚組,明顯低于TMAO組(P<0.05),見表2。

表2 各組軟骨組織炎性 損傷指標

2.5山奈酚對各組軟骨組織中TXNIP和NLRP3蛋白表達水平的影響 與假手術組比較,模型組軟骨組織中TXNIP和NLRP3蛋白表達顯著上調(P<0.05);與模型組比較,山奈酚組軟骨組織中TXNIP和NLRP3蛋白表達顯著下調(P<0.05),而TMAO組與模型組軟骨組織中TXNIP和NLRP3蛋白表達差異不明顯(P>0.05);與山奈酚組比較,山奈酚+TMAO組軟骨組織中TXNIP和NLRP3蛋白表達明顯上調(P<0.05),見圖2、表3。

1～5:假手術組、模型組、山奈酚組、TMAO組、山奈酚+TMAO組圖2 各組軟骨組織中TXNIP和NLRP3蛋白表達

表3 各組軟骨組織中TXNIP和 NLRP3蛋白表達水平

3 討 論

KOA發病機制十分復雜,年齡、肥胖、炎癥等因素均能導致KOA的發生,但目前尚無將其治愈的有效方法。近年來,從傳統中藥或者食物中提取的生物活性成分備受關注。一些文獻〔11～13〕顯示,川皮苷、芹菜素、山茱萸新苷Ⅰ等活性成分均能改善KOA。山奈酚是一種天然黃酮類物質,在抵抗氧化、炎癥、腫瘤等方面具有一定的效果〔14〕。目前研究較多的是山奈酚對心肌細胞的影響,而對KOA影響的研究甚少。本研究結果提示,山奈酚可使KOA大鼠軟骨組織損傷得到改善。

有資料〔15〕顯示,氧化應激是影響KOA發展的重要因素之一。NO、MDA、SOD和GSH-Px是氧化應激標志物。NO能促進自由基的生成,而MDA和SOD分別用來反映機體承受自由基攻擊的能力和清除自由基的能力,二者可作為KOA治療效果的評價指標。在KOA狀態下,NO和MDA含量明顯升高,SOD含量明顯降低〔16〕。GSH-Px含量的降低會導致機體損傷加重〔17〕。本研究結果說明,山奈酚能夠抑制KOA大鼠體內的氧化應激反應,進而改善其氧化造成的損傷。除了氧化應激外,TNF-α、IL-1β和IL-6等炎性因子是影響KOA病理進程的又一大因素。以往研究〔18〕表明,TNF-α、IL-1β和IL-6水平的降低有利于預防KOA。本研究提示,山奈酚具有良好的抗炎作用,可通過降低炎性因子的含量改善KOA大鼠軟骨組織的炎性損傷。

有研究〔19〕表明,機體的炎癥反應與ROS/TXNIP通路關系密切。ROS的大量產生使TXNIP表達上調,進而激活NLRP3炎癥小體并增加炎性因子的分泌,從而使機體損傷加重。Gu等〔20〕通過實驗發現,ROS/TXNIP通路的阻滯可抑制OA小鼠關節軟骨細胞凋亡。本研究結果表明,山奈酚能夠抑制KOA大鼠體內ROS/TXNIP通路的激活,改善KOA大鼠軟骨細胞的氧化和炎性損傷。