外源物質(zhì)對低鹽羅非魚糜蛋白構(gòu)象及體外消化特性的影響

劉曉艷，葉月華，白衛(wèi)東, ，錢 敏，劉巧瑜，歐佰僑，譚梓健

（1.仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院輕工食品學(xué)院，廣東廣州 510225；2.現(xiàn)代農(nóng)業(yè)工程創(chuàng)新研究院，廣東廣州 510225；3.廣東省嶺南特色食品科學(xué)與技術(shù)重點實驗室，廣東廣州 510225；4.嶺南特色綠色加工與智能制造農(nóng)業(yè)部重點實驗室，廣東廣州 510225；5.茂名市大漁水產(chǎn)品有限公司，廣東茂名 525000）

羅非魚（Oreochromis niloticus）是一種淡水魚，具有生長速度快、產(chǎn)量高、肌肉加工性能好的特點，極具市場潛力，是魚糜生產(chǎn)的主要淡水魚來源之一[1]。但以羅非魚為代表的淡水白肉魚肌球蛋白含量較低，因此魚糜凝膠彈性較弱[2]，需通過優(yōu)化加工工藝（超高壓、微波、超聲輔助等）[3-4]或添加合適的外源物質(zhì)（如酶類蛋白質(zhì)、非酶類蛋白質(zhì)、淀粉類、非淀粉多糖類等）對其品質(zhì)進行改良。

轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶（transglutaminase，TGase）可通過催化轉(zhuǎn)酰基反應(yīng)增強蛋白質(zhì)間的交聯(lián)程度，從而改善魚糜的凝膠特性[5]。然而在低鹽條件下，難以暴露足夠數(shù)量的谷氨酰胺和賴氨酸殘基作為 TGase 反應(yīng)底物，從而不利于 TGase 催化交聯(lián)反應(yīng)的進行[6]。天然淀粉和變性淀粉是改善魚糜制品質(zhì)量最常用的添加劑[7]。羥丙基二淀粉磷酸酯是淀粉與磷酸化試劑和醚化劑伴同酯化制得的具有優(yōu)異特性的復(fù)合變性淀粉，較普通淀粉糊化后膨潤力、透明度顯著提高，具有粘度穩(wěn)定性好，保水性強及耐加工性好的特點[8-9]；研究表明，羥丙基二淀粉磷酸酯的添加可以使鲅魚魚糜凝膠的持水性顯著增大，提高不易流動水所占比例，使鲅魚魚糜的凝膠性能在1%添加量時達到最大值，當(dāng)添加量為 1.5%時，魚糜的硬度、粘聚性達到最大值，咀嚼度也處于較高的水平，且白度處于合適的感官區(qū)間[10]。羥丙基二淀粉磷酸酯對高溫殺菌后魚糜凝膠的破斷力及凹陷距離的改善效果最好，能顯著增強魚糜的凝膠強度，且可不同程度提高魚糜的持水力[11]。但添加過量的淀粉會使魚糜制品產(chǎn)生一定的“粉感”[12]。親水膠體是從植物和海藻中提取或由微生物合成的高分子多聚糖，也可以用來改善魚糜制品的凝膠特性[13]。0.2%的卡拉膠可顯著地提高白鰱魚魚糜凝膠強度、硬度、膠著性和咀嚼性，持水性和白度均達到最大值，凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)變得更加致密，孔洞較少且分布均勻，然而大量的親水膠體又會使魚糜制品變脆[12]，由此帶來一定的局限性。為更好改善羅非魚糜的品質(zhì)，有必要將幾種技術(shù)手段進行聯(lián)合并優(yōu)化合適比例以克服不同外源物的不足。然而，TGase、羥丙基二淀粉磷酸酯和結(jié)冷膠及其復(fù)配物是否會影響低鹽羅非魚糕的消化吸收特性，目前尚不明確。

本實驗以微波超聲波輔助制備的低鹽羅非魚糜凝膠為研究對象，分析谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶、羥丙基二淀粉磷酸酯、結(jié)冷膠以及三者的復(fù)配物（THG）對其水分分布及蛋白質(zhì)構(gòu)象的影響；并通過體外模擬消化實驗，探究不同外源物質(zhì)對微波超聲波輔助制備的低鹽羅非魚魚糕體外消化特性的影響，為外源添加物的應(yīng)用前景及羅非魚糕類食品的開發(fā)與應(yīng)用提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

冷凍羅非魚片 廣東省茂名鴻業(yè)水產(chǎn)有限公司；氯化鈉（NaCl）為食品級 廣東省鹽業(yè)集團有限公司；姜末、蔥白、白砂糖、肥膘肉、雞蛋 廣州市濱江街市場；谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶（≥30000 U/g）河南萬邦實業(yè)有限公司；羥丙基二淀粉磷酸酯 泰威生物技術(shù)有限責(zé)任公司；結(jié)冷膠 高酰，深圳市星牧生物工程有限公司；尼羅藍 上海阿拉丁試劑公司；唾液淀粉酶（500 U/mg）、胃蛋白酶（≥250 U/mg）、胰酶（～1500 U/mg）、α淀粉酶（～50 U/mg）、膽鹽 上海Sigma-Aldrich 貿(mào)易有限公司；碳酸氫鈉、鹽酸、氯化鉀、磷酸二氫鉀、氯化鈉、氯化鎂、氯化鈣、碳酸銨、硼砂、十二烷基硫酸鈉、鄰苯二甲醛、1,4-二巰基蘇糖醇、絲氨酸（serine）標準品 國藥集團化學(xué)試劑有限公司。

XO-SM100 超聲波微波組合反應(yīng)系統(tǒng) 南京先歐儀器制造有限公司；碗狀陶瓷模具（直徑9 cm×高度5 cm×厚度0.1 mm）廣州雪諾陶瓷有限公司；MesoMR23-060H-1 低場核磁共振成像分析儀 蘇州紐邁儀器分析股份有限公司；Chirascan V100 圓二色光譜 英國應(yīng)用光物理公司；DHSI-IV 體外仿生動態(tài)人胃腸消化系統(tǒng) 蘇州曉東宜健儀器設(shè)備有限公司；85-2 集熱式恒溫加熱磁力攪拌器 北京大龍；移液槍 德國艾本德股份公司；MP512-01 pH 計上海三信儀表廠；UV-1600 分光光度計 上海美譜達儀器有限公司；DHG-9070A 鼓風(fēng)干燥箱 上海精宏實驗設(shè)備有限公司；LA960 激光粒度儀 日本堀場公司；K9840 凱氏定氮儀 濟南海能儀器股份有限公司；Olympus FV10i 激光共聚焦顯微鏡 奧林巴斯中國有限公司；K600 食品調(diào)理機 德國博朗電器公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 低鹽羅非魚糜凝膠的制備 樣品制備主要參照陳燕婷等[14]的方法略作修改：將冷凍的羅非魚片置于4 ℃解凍12 h，經(jīng)漂洗后，切成約30 mm×30 mm×30 mm 的方塊（每組樣品100 g）。先以20000 r/min空斬90 s；再加入1.5% NaCl，以23000 r/min 鹽斬120 s，然后按需求添加0.4%TGase、9%羥丙基二淀粉磷酸酯（HDP）、0.6%結(jié)冷膠，添加濃度由前期的工藝優(yōu)化得到。以28000 r/min 斬拌180 s；斬拌過程加入70 mL 的冰水調(diào)節(jié)水分含量至75%左右，且使魚糜的溫度控制在10oC 以下。斬拌均勻的魚糜倒入9 cm×5 cm×0.1 mm 的碗狀陶瓷模具中，用PE保鮮膜封口后密封。置于40oC 水浴加熱30 min，而后置入微波超聲波組合反應(yīng)釜中，90oC 保溫處理8 min，其中，微波功率620 W、超聲功率330 W。然后立即放入4oC 冰箱，待測相關(guān)指標。5 組羅非魚糜凝膠樣品的簡稱分別是：空白組、0.4%TGase 組、9%HDP 組、0.6%結(jié)冷膠組，以及0.4%TGase、9%HDP 與0.6%結(jié)冷膠三者互作的處理組（THG 組）。

1.2.2 低鹽羅非魚糕的制備 參考Ye 等[15]方法。魚糕的制備方法與魚糜制備的區(qū)別在于，魚糕的制備過程中，在鹽斬后，除了按需求添加0.4%TGase、9%HDP、0.6%結(jié)冷膠之外，還加入姜末（5%）、蔥白（5%）、料酒（0.3%）、蛋清（8%）、肥膘肉（10%）、味精（0.2%）、白砂糖（0.5%）等配料，添加濃度由前期的工藝優(yōu)化得到。5 組羅非魚糕樣品的簡稱分別是：空白組、0.4%TGase 組、9%HDP 組、0.6%結(jié)冷膠組，以及0.4%TGase、9%HDP 與0.6%結(jié)冷膠三者互作的處理組（THG 組）。

1.2.3 低場核磁共振（LF-NMR）分析 參考 Traffano等[16]的方法略作修改：魚糜樣品在室溫條件下恒溫30 min 后，切成3 cm×1 cm×2 cm 的長方體并置于核磁管中，使用CPMG（Carr-Purcell-Meiboom-Gill）脈沖序列進行自旋-自旋弛豫時間T2的測定。參數(shù)設(shè)定：SW=100 kHz，SF=21 MHz，RFD=0.002 ms，RG1=20.0 db，P1＝10.0 μs，DRG1＝2，TD=1024，PRG=1，TW=4000 ms，NS＝2，回波個數(shù)NECH=5000。反演結(jié)果做歸一化處理，每組樣品3 個平行，每個平行樣測3 次。

1.2.4 圓二色光譜分析 參考Guan 等[17]的方法略作修改：用20 mmol PBS 將樣品稀釋成0.1 g/mL 溶液，將樣品注入具有0.1 cm 光程的石英比色皿，設(shè)置參數(shù)為：掃描波段190～260 nm，掃描速度：60 nm/min，帶寬1 nm，步進1 nm，測其常溫圓二色光譜。橢圓率取三次掃描的平均值，并扣除基線。利用CDNN 軟件，選擇Net using 33 basespectra 進行二級結(jié)構(gòu)擬合。

1.2.5 體外仿生動態(tài)人胃腸模擬消化 參考Minekus等[18]方法，消化液模擬液主要由電解質(zhì)儲備液、酶、CaCl2和水組成。唾液模擬液（SSF）、胃液模擬液（SGF）及腸液模擬液（SIF）中電解質(zhì)的濃度推薦如表1 所示。以100 mL 為例，將α淀粉酶溶解在80 mL 的SSF 母液中，并加入0.5 mL 的CaCl2（H2O）2（0.3 mol/L）和19.5 mL 的去離子水，得到α淀粉酶在SSF 中的最終濃度為150 U/mL，并用1 mol/L HCl 將SSF 的pH 調(diào)節(jié)至7.0，一次實驗唾液用量是60 mL；同樣在SGF 中，將胃蛋白酶溶解于80 mL 的母液，加入500 μL 的CaCl2（H2O）2（0.3 mol/L）和19.95 mL 的去離子水，得到胃蛋白酶在SGF 中的最終濃度為4000 U/mL，用6 mol/L HCl 調(diào)節(jié)SGF 的pH 至1.6，一次實驗胃液用量是296 mL；同樣在SIF中，將胰酶和膽鹽溶解于80 mL 的母液，加入0.2 mL的CaCl2（H2O）2（0.3 mol/L）和19.8 mL 的去離子水，得到胰酶在SIF 中的最終濃度為200 U/mL、膽鹽20 mmol/L，用6 mol/L HCl 將SIF 的pH 調(diào)節(jié)至7.0，一次實驗?zāi)c液用量是576 mL。

表1 動態(tài)體外胃腸消化設(shè)備運行參數(shù)Table 1 Operating parameters of dynamic in vitro gastrointestinal digestion equipment

正確安裝胃腸模型和一次性進液裝置（如圖1），并將當(dāng)天配制的消化液模擬液吸入針筒內(nèi)與模型正確連接。取150 g 樣品并將其放入食品調(diào)理機中，加入60 mL SSF 并在10 檔下斬拌30 s 以模擬口腔消化。然后將樣品置于DHSI-IV 仿生動態(tài)人胃腸消化系統(tǒng)胃模型中，進行180 min 的連續(xù)胃腸消化。在消化過程中，先將296 mL 模擬胃液注入空胃模型中20 mL，隨后以可變流速模擬胃液分泌，流加速度變化趨勢如圖2 所示；腸液模擬液勻速流加，流加速度為3.0 mL/min。消化完成后收集樣品，在4 ℃、8000 r/min 下離心20 min，將沉淀和上清液分離后，貯存于-80 ℃冰箱，備用。

圖1 動態(tài)體外消化設(shè)備及取樣位置標注Fig.1 Dynamic in vitro digestion equipment and labeling of sampling locations

圖2 胃液模擬液流加速度的變化趨勢Fig.2 Variation tendency of simulation gastric fluid flow acceleration

1.2.6 蛋白質(zhì)體外消化率的測定 參考張怡潔等[19]的方法，取消化物上清液部分采用凱氏定氮儀測定其中的總氮含量，代表已經(jīng)消化了蛋白質(zhì)量，計算蛋白質(zhì)消化率，每組樣品重復(fù)3 次實驗。

蛋白質(zhì)消化情況用以下方式表示，公式如下：

式中，M胃內(nèi)剩余=胃腸消化180 min 胃內(nèi)剩余物上清液中的總N 量；M0-180=胃腸消化180 min 腸消化產(chǎn)物上清液中的總N 量；M0=消化液模擬液上清液中的總N 量；M總=未消化樣品中的總蛋白質(zhì)含量。

1.2.7 蛋白水解度的測定 采用OPA（鄰苯二甲醛）法測定蛋白質(zhì)水解度[20]；使用分光光度計測試所有樣品的340 nm 吸光值，空白對照為去離子水。在裝有3 mL OPA 試劑的試管中加入400 μL 絲氨酸標準溶液或樣品溶液，充分混勻（5 s）并靜置 2 min，然后立即讀取340 nm 處的吸光度。在測量空白值和樣品值之前測2 個標準品，另2 個標準品在測完空白和樣品后再測。標準品的吸光值取4 次的平均值，每組樣品重復(fù)3 次實驗。

1.2.8 激光共聚焦顯微鏡觀察微觀結(jié)構(gòu) 激光共聚焦顯微鏡觀察（CLSM）微觀結(jié)構(gòu)的方法參考王嵬等[21]的方法略有修改，用無水乙醇制備0.1%的尼羅藍染色劑，并在4oC 下避光保存。取消化后的樣品上清液1 mL 與尼羅藍染色劑（40 μL）混合均勻，取1 滴置于載玻片中央，從一側(cè)蓋上蓋玻片，避免產(chǎn)生氣泡，倒置在載物臺上使用50 倍觀察。激發(fā)波長為633 nm，接收波長為680 nm。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有實驗數(shù)據(jù)表示為結(jié)果平均值±標準差，采用Origin 2018 和Excel 2010 軟件進行作圖，實驗數(shù)據(jù)采用SPSS 22.0 軟件進行方差分析，Duncan 多重比較分析實驗數(shù)據(jù)間的差異顯著性（P＜0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 外源物質(zhì)對低鹽羅非魚糜凝膠水分分布狀態(tài)的影響

如圖3 所示，低鹽羅非魚糜凝膠的橫向弛豫時間T2波譜圖存在3 個區(qū)間：T21（0～10 ms），T22（50～100 ms），T23（900～1300 ms）；P21、P22、P23則分別代表魚糜樣品中結(jié)合水、不易流動水、自由水的相對含量。

圖3 低鹽羅非魚糜凝膠弛豫時間（T2）的變化Fig.3 Change of relaxation time（T2）of low-salt tilapia surimi gels

表2 結(jié)果表明，弛豫時間受添加物種類的作用影響較大。與空白組相比，添加0.4%TGase、9%HDP、0.6%結(jié)冷膠及THG 組的弛豫時間均顯著提前（P＜0.05），其中THG 組提前得最為明顯，表明它們的結(jié)合水和不易流動水更加穩(wěn)固。與空白組相比，THG 組的 T21、T22及 T23弛豫時間分別減小了約56.72%、13.03% 及 24.35%，表明復(fù)配物互作減弱自由水流動性的作用最顯著。

表2 低鹽羅非魚糜凝膠低場核磁共振自旋弛豫時間（T2）和峰比例（P）Table 2 LF-NMR spin-spin relaxation time (T2) and peak proportion (P) of low-salt tilapia surimi gels

表2 中的P21、P22和P23分別代表各弛豫時間所對應(yīng)的峰面積比例，代表不同狀態(tài)的水分含量。可以看出，添加單一外源物質(zhì)和復(fù)配物后凝膠體系的結(jié)合水和不易流動水的含量均有所增多，而自由水的含量均減少。與空白組相比，0.4%TGase 組、9%HDP組和0.6%結(jié)冷膠組的低鹽魚糜凝膠中P21、P22和P23均存在顯著性差異（P＜0.05）。此外，THG 組P21和P22較空白組分別增加98.71%和14.75%，自由水（P23）含量遠小于空白組，說明在復(fù)配物的作用下，自由水向結(jié)合水和不易流動水方向遷移，可能是由于復(fù)配物分子中游離的羥基在氫鍵的作用下結(jié)合成網(wǎng)狀，鎖住了一部分自由水，導(dǎo)致不易流動水含量增加，所以添加復(fù)配物后水分子與蛋白質(zhì)結(jié)合更緊密[22]。

圖4 為低鹽羅非魚糜凝膠的水分質(zhì)子密度偽彩圖，魚糜凝膠偽彩圖的不同顏色可以更好地比較添加不同外源物質(zhì)時魚糜凝膠中水分的分布情況。偽彩圖像越紅，代表檢測的信號強度越強，樣品含有更多的水分子氫質(zhì)子。偽彩圖像越藍，代表檢測的信號強度越弱，樣品含有的水分子氫質(zhì)子較少[23]。從圖中可以看出，相比于水分質(zhì)子密度最低的空白組而言，0.4%TGase 組、9%HDP 組和0.6%結(jié)冷膠組的魚糜凝膠水分質(zhì)子密度相對較高；THG 組的紅色最深且分布最廣泛，表明THG 組魚糜凝膠水分質(zhì)子密度較高。有研究認為，持水率越高，魚糜凝膠水分質(zhì)子密度也相對提高[24]。本實驗中幾種外源物的添加，可能對魚糜凝膠的持水率有正面影響。

圖4 低鹽羅非魚糜凝膠水分質(zhì)子密度的偽彩圖Fig.4 Pseudo-color of water proton density of low-salt tilapia surimi gels

2.2 外源物質(zhì)對低鹽羅非魚糜凝膠二級結(jié)構(gòu)的影響

在添加不同外源物質(zhì)條件下，魚糜肌原纖維蛋白的圓二色光譜如圖5 所示。從圖5 可以看出，空白組、0.6%結(jié)冷膠組及0.4%TGase 組的魚糜肌原纖維蛋白有兩個明顯的負峰在205 nm 和225 nm 附近，說明富含α-螺旋構(gòu)象單元。THG 組和9%HDP組的CD 譜中兩個負峰的強度減弱，表明α-螺旋含量下降。

圖5 不同外源物質(zhì)處理低鹽羅非魚糜凝膠的CD 光譜Fig.5 CD spectra of low-salt tilapia surimi gels treated with different exogenous substances

從圖6 可得，與空白組相比，單一外源物質(zhì)和復(fù)配物會影響肌原纖維蛋白的構(gòu)象單元組成，可見α-螺旋相對含量減少，但β-折疊、β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)卷曲相對含量增加，這表明在單一外源物質(zhì)和復(fù)配物的作用下，魚糜蛋白的緊密螺旋結(jié)構(gòu)向無規(guī)則狀態(tài)轉(zhuǎn)化。在5 組樣品中，THG 組肌原纖維蛋白中含有相對含量最低的α-螺旋，以及相對含量最高的β-折疊、β-轉(zhuǎn)角及無規(guī)卷曲，這表明：相對于單一的外源物質(zhì)，THG 更加明顯地改變了蛋白質(zhì)的構(gòu)象，且更有利于疏水蛋白基團的暴露和蛋白間的相互作用。較低含量的α-螺旋和較高含量的無規(guī)則卷曲有助于蛋白質(zhì)形成穩(wěn)定的三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，在束縛水分的同時還能改善凝膠的品質(zhì)[25]。THG 對魚糜凝膠品質(zhì)的影響，需要進一步研究。

圖6 不同外源物質(zhì)處理低鹽羅非魚糜凝膠二級蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的變化Fig.6 Change of secondary protein structure of low-salt tilapia surimi gels treated with different exogenous substances

2.3 外源物質(zhì)對低鹽羅非魚糕蛋白體外消化率的影響

蛋白體外消化率可用于評估魚糜制品蛋白質(zhì)的營養(yǎng)價值。如圖7 所示，在經(jīng)過180 min 的模擬消化過程后，不同外源物質(zhì)的添加導(dǎo)致低鹽羅非魚糕呈現(xiàn)出的消化差異性較大（P＜0.05），5 組樣品的消化率范圍在52.75%到73.73%之間，蛋白體外消化率大小依次為：0.4%TGase 組＞THG 組＞9%HDP 組＞空白組＞0.6%結(jié)冷膠組。

圖7 不同外源物質(zhì)對低鹽羅非魚糕模擬體外消化后蛋白體外消化率的影響Fig.7 Effects of different exogenous substances on protein digestibility of tilapia fish cakes after simulated digestion in vitro

目前有關(guān)研究報道[26]稱魚肉蛋白對消化酶的敏感性可能決定于蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)，蛋白質(zhì)的無規(guī)則卷曲含量與體外消化率呈正相關(guān)，從前期實驗中不同外源物質(zhì)對肌原纖維蛋白二級結(jié)構(gòu)含量變化結(jié)果可知，THG 組的無規(guī)則卷曲含量大，故體外消化率也會有所上升。關(guān)于 TGase 對蛋白質(zhì)的消化特性影響，有的研究認為會有負面作用，比如酪蛋白分子因 TGase的交聯(lián)作用會形成高分子聚集體，對胃蛋白酶的消化產(chǎn)生抑制作用，并且在 20 h 的胃消化后消化液中會仍有高分子量的蛋白片段殘留[27-29]。也有研究表明，TGase 會對蛋白質(zhì)的消化沒有抑制作用，甚至有促進作用。比如，Havenaar 等[29]的研究證實，添加 TGase的酪蛋白在小腸中會被快速降解。同樣，添加 TGase甚至?xí)谝欢ǔ潭壬咸岣擀?伴大豆球蛋白對胰蛋白酶的敏感程度，使其更容易被降解[30]。張怡潔等[19]研究發(fā)現(xiàn)添加TGase 的帶魚純魚肉重組制品樣品中蛋白質(zhì)體外消化率比對照組高。本研究表明，0.6%結(jié)冷膠組蛋白質(zhì)消化率下降，其原因需要進一步研究。

2.4 不同外源物質(zhì)對低鹽羅非魚糕蛋白水解度的影響

由圖8 可知，0.4%TGase 組（28.74%）、9%HDP組（26.47%）、0.6%結(jié)冷膠組（27.68%）和THG 組（30.15%）的蛋白水解度均顯著高于僅有20.62%的空白組（P＜0.05），但這4 組樣品之間相差不大，說明本實驗中添加的外源物質(zhì)均在一定程度上有助于蛋白質(zhì)水解，且THG 互作效果優(yōu)于單一外源物質(zhì)，以上外源物質(zhì)的加入對低鹽羅非魚糕的蛋白水解度有正面作用，水解后的蛋白質(zhì)較易消化吸收，因此推測適當(dāng)添加外源物質(zhì)可促進羅非魚糕中大分子蛋白質(zhì)分解為低分子量多肽，具體原因還需進一步研究。

圖8 不同外源物質(zhì)對低鹽羅非魚糕模擬體外消化后蛋白水解度的影響Fig.8 Effects of different exogenous substances on protein degree of hydrolysis of low-salt tilapia fish cakes after simulated digestion in vitro

2.5 激光共聚焦顯微鏡觀察不同外源物質(zhì)對低鹽羅非魚糕的消化作用

如圖9 所示，圖中顯示的紅色熒光亮點為尼羅藍試劑染色后的蛋白質(zhì)顆粒。空白組中有許多紅色熒光亮點甚至聚集成團，這表明大部分蛋白質(zhì)沒有被消化或消化不完全，而且還有大量的顆粒聚集體；0.4%TGase 組、9%HDP 組、0.6%結(jié)冷膠組以及THG 組中紅色熒光亮點均少于空白組，并且更加分散，特別是THG 組的紅色熒光亮點明顯變少，從而推測THG 復(fù)配物對蛋白質(zhì)的消化分解不會產(chǎn)生不利影響甚至還起到促進作用。已有的研究認為，凝膠消化率與結(jié)構(gòu)孔隙率和凝膠溶解率呈正相關(guān)性，與凝膠強度、硬度、彈性、持水率和凝膠形成作用力（二硫鍵、離子鍵、氫鍵）呈負相關(guān)性[31]，低鹽羅非魚糕的消化率與哪些因素相關(guān)，需要進一步研究。

圖9 不同外源物質(zhì)對低鹽羅非魚糕模擬體外消化后激光共聚焦顯微鏡微觀結(jié)構(gòu)的影響Fig.9 Effects of different exogenous substances on CLSM microstructure of tilapia fish cakes after simulated digestion in vitro

3 結(jié)論

添加THG 后，羅非魚糜結(jié)合水和不易流動水較空白組分別增加98.71%和14.75%，自由水含量顯著減少（P＜0.05）；魚糜凝膠偽彩圖的結(jié)果表明，THG組水分質(zhì)子密度較高；THG 促進了α-螺旋向β-折疊、β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化。由此可見，在THG 的作用下，魚糜中水分子與蛋白質(zhì)結(jié)合更緊密，相對于單一的外源物質(zhì)，THG 更加明顯地改變了蛋白質(zhì)的構(gòu)象，且更有利于疏水蛋白基團的暴露和蛋白間的相互作用。

體外模擬消化實驗結(jié)果表明，與空白組相比，添加0.4%TGase 和THG 對低鹽羅非魚糕的胃排空速度、蛋白體外消化率及蛋白水解度均有正面作用；其中THG 可顯著促進蛋白質(zhì)分解成粒徑較小的聚集體（P＜0.05），經(jīng)胃-十二指腸消化結(jié)束后的消化產(chǎn)物顏色更加透明清晰，從激光共聚焦顯微鏡可觀察到THG 組的紅色熒光亮點顯著減少，反映其蛋白被消化得較為完全。后續(xù)實驗將從0.4%TGase 和THG對魚糜凝膠結(jié)構(gòu)特性的影響角度分析，進一步分析其對體外消化率及蛋白水解度均有正面作用的機制，為羅非魚糜凝膠特性研究及羅非魚糕類食品的開發(fā)與應(yīng)用提供理論參考。