落葉松中花旗松素的提取、抑菌作用及其與白屈菜紅堿聯(lián)用協(xié)同抑菌作用機(jī)理

荊立成，楊 躍，楊 闊，李玫萱，趙 敏，崔岱宗

（東北林業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，黑龍江哈爾濱 150036）

花旗松素（Taxifolin，TFL）又名二氫槲皮素，是一種具有多種天然活性物質(zhì)的二氫黃酮類化合物。自然界中，廣泛存在于落葉松、水飛薊、紅蓼、洋蔥和黃芪等多種松科與薔薇科的植物中，其中以落葉松中含量最高[1]，根莖部尤甚。常用的提取方法包括：熱水浸提法、乙醇回流法、酶誘導(dǎo)法、超聲法和有機(jī)溶劑萃取法等[2-3]。未來(lái)也可能通過(guò)構(gòu)建基因工程菌株大規(guī)模發(fā)酵生產(chǎn)花旗松素。因花旗松素結(jié)構(gòu)中含有較多的酚羥基，可表現(xiàn)出多種生物學(xué)活性與較強(qiáng)的抗氧化作用，現(xiàn)已研究發(fā)現(xiàn)其含有抗菌、抗病毒、抗腫瘤、抗輻射及抗心血管系統(tǒng)疾病等功能，具備開發(fā)為防腐劑、保健品和食品的潛力[4-6]。此外，2021 年4 月，花旗松素已被我國(guó)衛(wèi)健委認(rèn)定為“新食品原料”，可見其市場(chǎng)前景十分廣闊。

白屈菜紅堿（Chelerythrine，CHE）是一種苯并菲啶型生物堿，具有抗炎抑菌、抗腫瘤、防治蟲害等生物活性[7]。目前研究發(fā)現(xiàn)白屈菜紅堿對(duì)多種典型病蟲害都具有顯著抑制作用，具備開發(fā)生物防治農(nóng)藥的潛力，用于減輕作物病害[8]。但因單獨(dú)使用該藥物抑菌所需濃度較高，因此若能找到其他抗菌劑與之聯(lián)合使用，將降低藥量并增強(qiáng)抑菌活性，提升產(chǎn)品性能。已有研究表明，生物堿和黃酮類化合物都具有高效抑菌能力。因此，本實(shí)驗(yàn)將白屈菜紅堿與花旗松素聯(lián)合使用觀察其抑菌能力是否增強(qiáng)。

基于此，本研究取材落葉松根莖部，采用超聲輔助乙醇熱浸提法提取花旗松素，經(jīng)醚類萃取、重結(jié)晶技術(shù)進(jìn)行純化，測(cè)定其純度與提取率，研究其對(duì)革蘭氏陽(yáng)/陰性菌的抑菌能力和機(jī)理，并與白屈菜紅堿聯(lián)用進(jìn)行了藥物聯(lián)合抑菌實(shí)驗(yàn)，探究其抑菌效能，以期為未來(lái)食品、日化及醫(yī)藥領(lǐng)域的產(chǎn)品開發(fā)與行業(yè)發(fā)展提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

大腸桿菌（E.coli）、金黃色葡萄球菌（S.aeruse）

東北林業(yè)大學(xué)微生物學(xué)科菌種保藏中心；過(guò)氧化氫酶試劑盒、過(guò)氧化物酶試劑盒、超氧化物歧化酶試劑盒 蘇州格銳思生物科技有限公司；花旗松素標(biāo)準(zhǔn)品上海源葉生物科技有限公司；胰蛋白胨、酵母提取物 Oxoid 公司；甲醇（色譜級(jí)）Fisher 公司；無(wú)水乙醇、甲基叔丁基醚、二甲基亞砜、2-Nitrophenyl-β-D-galactopyranoside（鄰硝基苯-β-D-吡喃半乳糖苷，ONPG）等化學(xué)試劑 分析純，國(guó)藥集團(tuán)；Luria-Bertani（LB）培養(yǎng)基；落葉松 來(lái)自大興安嶺；白屈菜紅堿（CHE）（純度98%）東北林業(yè)大學(xué)微生物實(shí)驗(yàn)室。

Agilent 1260 高效液相色譜儀 美國(guó)安捷倫科技有限公司；5430R 低溫高速離心機(jī) 德國(guó)艾本德公司；JEM-2100 透射電子顯微鏡 日本電子株式會(huì)社；TU-1901 紫外分光光度計(jì) 北京普析通用儀器責(zé)任有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 花旗松素提取與純度計(jì)算 采用超聲輔助乙醇熱浸提法提取花旗松素[9]。取200 g 落葉松粉末加入2 L 90%乙醇，80 ℃水浴2 h 后超聲（功率300 W）震蕩1 h 過(guò)濾得濾液，利用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀進(jìn)行減壓濃縮。取第一次提取液加入甲基叔丁基醚1.2 L，勻速攪拌20 min，靜止30 min，分離得到甲基叔丁基醚萃取液，此步驟重復(fù)3～4 次，將其減壓濃縮，凍干得粗提物。再經(jīng)三次重結(jié)晶[10]，凍干得終產(chǎn)物。

準(zhǔn)確稱取花旗松素標(biāo)準(zhǔn)品（HPLC≥98%）10 mg溶于乙醇中，定容至10 mL，制備成1 mg/mL 的對(duì)照液，配制濃度分別為0.05、0.1、0.4、0.6、0.8、1 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)待測(cè)液，用于繪制花旗松素濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線。花旗松素標(biāo)準(zhǔn)液及提取樣品均采用高效液相色譜測(cè)試，條件如下：

柱溫30 ℃、流動(dòng)相40%水:60%甲醇、運(yùn)行時(shí)間10 min、檢測(cè)波長(zhǎng)288 nm、流速1.0 mL/min。此條件下，花旗松素出峰時(shí)間約為（2.672±0.1）min[11-12]。

根據(jù)對(duì)應(yīng)出峰時(shí)間的出峰面積，將其帶入花旗松素濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線得到樣品純度。另取適量花旗松素產(chǎn)物溶于去離子水，采用紫外分光光度計(jì)對(duì)其進(jìn)行全光譜掃描，驗(yàn)證提取物為花旗松素。

1.2.2 花旗松素對(duì)供試菌MIC 濃度測(cè)定及抑菌活性

配制LB 液體培養(yǎng)基：蛋白胨2 g，酵母提取物1 g，NaCl 2 g，蒸餾水200 mL，pH7.2～7.4，高壓滅菌待用。用0.01 mol/L PBS 溶解花旗松素，加入適量LB液體培養(yǎng)基，配制終濃度為0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8、2.0 mg/mL 的花旗松素溶液，分別加入培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的E.coli、S.aureus菌液80 μL，終體積8 mL。各管充分混勻后置恒溫培養(yǎng)箱37 ℃ 130 r/min 振蕩培養(yǎng)。24 h 后取各組菌液測(cè)定OD600值。

抑制率＞80%所含最低藥物濃度為最小抑菌濃度（Minimum inhibitory concentration，MIC）[13]。

1.2.3 細(xì)菌形態(tài)學(xué)觀察 分別在培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的E.coli、S.aureus菌液中加入終濃度為0、0.5、1 MIC 的花旗松素溶液，每組設(shè)置三個(gè)重復(fù)，混勻后置于37 ℃培養(yǎng)箱，130 r/min 震蕩培養(yǎng)，于1、2、4、6、8、10、12 和24 h 分別取樣測(cè)定600 nm 處吸光值[14]，繪制生長(zhǎng)曲線。另取適量菌液通過(guò)掃描電子顯微鏡和透射電子顯微鏡觀察菌體形態(tài)變化，樣品處理方法參照胡梅[15]。培養(yǎng)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌與添加終濃度為1 MIC 的二氫槲皮素培養(yǎng)至12、24 h。放入離心管中（設(shè)置三組管）離心后倒去上清液并收集大腸桿菌、金黃色葡萄球菌菌泥與經(jīng)二氫槲皮素處理后的大腸桿菌、金黃色葡萄球菌菌泥。先將蓋玻片用純水和無(wú)水乙醇分別超聲清洗15 min，將離心后菌泥接觸到蓋玻片上并均勻分散，等自然晾干，之后加入適量的3%戊二醛固定液將樣品全部覆蓋后放置-4 ℃冰箱固定12 h。使用現(xiàn)配制的乙醇（濃度為30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、100%，每次濃度重復(fù)3 次，更有效脫水作用）進(jìn)行乙醇濃度梯度脫水，每次震蕩脫水10～15 min 即可。之后保存樣品于-4 ℃冰箱樣品自然晾干待測(cè)。

1.2.4 細(xì)菌胞內(nèi)大分子物質(zhì)泄露情況的測(cè)定 采用分光光度法測(cè)定花旗松素處理后菌體內(nèi)大分子物質(zhì)含量[16]，以評(píng)價(jià)菌體被破壞的程度。將培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期的菌體8000 r/min 離心10 min，用0.01 mol/L PBS清洗3 次并重懸，分別加入花旗松素使其終濃度為1/2、1、2 MIC，以無(wú)花旗松素的細(xì)菌培養(yǎng)液為對(duì)照，放置于37 ℃搖床130 r/min 振蕩培養(yǎng)，于1、4、8、24 h 取混懸樣液1 mL，8000 r/min 離心10 min，取上清適當(dāng)稀釋后，立即于260、280 nm 測(cè)定吸光值，每組重復(fù)三次。

1.2.5 細(xì)菌細(xì)胞質(zhì)膜滲透性的測(cè)定 參照吳海霞[17]方法。制備待測(cè)菌液，分別加入不同濃度梯度的花旗松素（1/2、1、2 MIC）設(shè)置三組平行，再加入1 mg/mL的ONPG（鄰硝基苯-β-D-吡喃半乳糖苷）混勻，37 ℃水浴，每隔1 h 測(cè)于405 nm 的吸光值OD2（共測(cè)4 個(gè)小時(shí)時(shí)間段）。陰性對(duì)照為加入緩沖液，吸光度值為OD1。細(xì)胞質(zhì)膜滲透性增加導(dǎo)致的吸光度值為OD=OD2-OD1。

重懸待測(cè)菌液，分別加入不同濃度花旗松素，使其終濃度為2 MIC，每組設(shè)置三組平行充分混勻，37 ℃水浴孵育1 h 后離心，取上清液再加入1 mg/mL的ONPG（鄰硝基苯-β-D-吡喃半乳糖苷），37 ℃條件下再水浴孵育4 h，測(cè)定在405 nm 下的吸光度值OD2。細(xì)菌經(jīng)超聲波破碎（冰浴，功率200 W，超聲5 s，間隔5 s）離心后取上清液，測(cè)吸光度值OD1作為陽(yáng)性對(duì)照。上清液中β-半乳糖苷酶相對(duì)活性（%）=OD2/OD1×100，通過(guò)分光光度計(jì)測(cè)定β-半乳糖苷酶水解乳糖類似物ONPG 產(chǎn)物的特征吸收評(píng)價(jià)花旗松素對(duì)細(xì)胞質(zhì)膜滲透性的影響。

1.2.6 細(xì)菌胞內(nèi)抗氧化酶系活性的測(cè)定 采用1.1 中材料對(duì)花旗松素作用于細(xì)菌后的CAT 酶、POD酶和SOD 酶活性變化進(jìn)行測(cè)定[18]。

取適量培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的E.coli、S.aureus，配制終濃度為1 MIC 的TFL 溶液，以0 MIC 為對(duì)照，分別裝于2 mL 離心管內(nèi)，每組設(shè)置3 組平行重復(fù)，培養(yǎng)至1、4、8、24 h。將樣品離心后加入1 mL 提取液冰浴超聲破胞，之后在4 ℃條件下12000 r/min 離心10 min，取上清根據(jù)試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2.7 花旗松素與白屈菜紅堿聯(lián)合抑菌 使用Bliss 獨(dú)立模型計(jì)算藥物聯(lián)用作用指數(shù)[19]，使用以下其公式計(jì)算協(xié)同指數(shù)：

式中，F(xiàn)AB：指在聯(lián)用藥物時(shí)細(xì)菌的生長(zhǎng)速率（24 h測(cè)得OD 值），A 為花旗松素，B 為白屈菜紅堿。FA，F(xiàn)B：分別指有A、B 時(shí)細(xì)菌的生長(zhǎng)速率；F0：指沒用藥處理時(shí)細(xì)菌的生長(zhǎng)速率；S：為藥物聯(lián)用作用指數(shù)，該參數(shù)若為正值，則代表藥物聯(lián)用對(duì)菌體具協(xié)同作用；負(fù)值則呈拮抗作用[20]。

1.2.8 花旗松素與白屈菜紅堿的聯(lián)合抑菌機(jī)制 同1.2.4、1.2.5 和1.2.6 操作，分別測(cè)定菌體的胞內(nèi)大分子物質(zhì)泄漏、細(xì)菌膜滲透性和抗氧化酶系的變化。實(shí)驗(yàn)中，將花旗松素樣品變更為0.25 MIC 的花旗松素和0.25 MIC 的白屈菜紅堿混合液。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 26.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，采用t檢驗(yàn)，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。Origin 2021 軟件進(jìn)行繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 花旗松素提取及純度計(jì)算

根據(jù)高效液相色譜測(cè)定不同濃度花旗松素標(biāo)準(zhǔn)品所得峰面積，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖1A）。據(jù)此計(jì)算在落葉松中提取所得花旗松素樣品（圖1C）純度為90%。經(jīng)紫外分光光度計(jì)全光譜掃描（圖1B），發(fā)現(xiàn)樣品最大吸收峰值位于288 nm，這與劉文叢等[21]研究結(jié)果一致，可確定提取物為純度較高的花旗松素。

圖1 花旗松素標(biāo)準(zhǔn)曲線及全波長(zhǎng)掃描光譜圖和液相分析結(jié)果Fig.1 Taxifolin standard curve,full-wavelength scanning spectrum and liquid phase analysis results

2.2 花旗松素的MIC 測(cè)定及抑菌活性

MIC 表示受試物抑菌能力的指標(biāo)[22]，能更準(zhǔn)確反映其抑菌活性。結(jié)果如圖2 所示，花旗松素對(duì)E.coli和S.aureus均具有較好的抑菌效果。當(dāng)花旗松素的質(zhì)量濃度達(dá)到1.2 mg/mL 時(shí)，對(duì)兩株細(xì)菌的抑菌活性大于80%，分別為81.12%和83.95%。

圖2 花旗松素對(duì)菌體MIC 測(cè)定Fig.2 MIC determination of taxifolin on the bacteria

細(xì)菌的生長(zhǎng)曲線反映了當(dāng)前培養(yǎng)條件下的微生物群體生長(zhǎng)規(guī)律。如圖3 所示，在細(xì)菌培養(yǎng)液中加入花旗松素后將嚴(yán)重影響大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的生長(zhǎng)，各時(shí)段菌液的OD600值均明顯降低。相較未添加花旗松素的對(duì)照組菌液，加入1/2 MIC 花旗松素后1 h 即發(fā)生明顯變化，遲緩期延長(zhǎng)，12 h 時(shí)近似達(dá)到細(xì)菌生長(zhǎng)峰值，進(jìn)入穩(wěn)定期。花旗松素濃度為1 MIC 時(shí)，細(xì)菌的生長(zhǎng)即刻被抑制，生長(zhǎng)速率極其緩慢，未見生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期。培養(yǎng)至8 h 時(shí)的大腸桿菌組OD600值僅為0.173，較對(duì)照組下降了86.4%。由此可見，花旗松素對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌活性明顯，細(xì)菌生長(zhǎng)在1 MIC 濃度下幾乎被完全抑制。

圖3 花旗松素對(duì)供試菌生長(zhǎng)曲線的影響Fig.3 Effects of taxifolin on the growth of the tested bacteria

2.3 花旗松素對(duì)菌體形態(tài)影響

為觀測(cè)花旗松素對(duì)供試菌作用后對(duì)其外觀和微觀結(jié)構(gòu)的影響，研究加入2 MIC 濃度的花旗松素，通過(guò)掃描電子顯微鏡和透射電子顯微鏡進(jìn)行觀察。如圖4 所示，正常培養(yǎng)的大腸桿菌和金黃色葡萄球菌外部光滑，細(xì)胞形態(tài)飽滿，結(jié)構(gòu)緊密，菌體之間界限清晰。但當(dāng)培養(yǎng)液中添加花旗松素后，菌體表面逐漸粗糙，邊緣模糊，伴有明顯褶皺和凹陷，變形明顯[23]。隨處理時(shí)間延長(zhǎng)，菌體形態(tài)更加不整，外壁不全，可見大量細(xì)胞碎片，出現(xiàn)消融跡象[24]。由此可見，花旗松素的作用可能是使細(xì)菌形態(tài)改變，細(xì)胞壁溶解，細(xì)胞膜破裂，并伴隨大量?jī)?nèi)容物泄露，最終導(dǎo)致細(xì)菌消解死亡。

圖4 花旗松素對(duì)細(xì)菌形態(tài)結(jié)構(gòu)變化的影響Fig.4 Effects of taxifolin on the morphology structure changes of bacteria

2.4 花旗松素對(duì)菌體核苷酸泄露影響

當(dāng)菌體細(xì)胞膜受到損傷后，胞內(nèi)大分子物質(zhì)會(huì)向胞外滲出[23]，因此根據(jù)核酸和蛋白質(zhì)的含量變化可作為評(píng)價(jià)細(xì)胞膜完整性的指標(biāo)。實(shí)驗(yàn)通過(guò)核酸、蛋白質(zhì)等大分子物質(zhì)在260、280 nm 處的吸光值判斷菌體胞內(nèi)大分子泄漏情況[24-25]。結(jié)果如圖5 所示，在花旗松素作用下，兩株菌的OD260和OD280值均有顯著增加（P＜0.05），且隨濃度升高而增大。這說(shuō)明隨花旗松素濃度增加，細(xì)菌細(xì)胞膜的通透性更高，使正常情況下不能透過(guò)細(xì)胞膜的大分子物質(zhì)大量泄漏，進(jìn)而影響細(xì)胞正常生長(zhǎng)，抑制菌體繁殖。

圖5 花旗松素對(duì)供試菌胞內(nèi)大分子物質(zhì)泄露的影響Fig.5 Effects of taxifolin on leakage of intracellular macromolecular substances of the tested bacteria

隨培養(yǎng)時(shí)間推移，兩株細(xì)菌對(duì)照組的OD260和OD280值也有所增加，這可能是由于細(xì)胞受到了輕微的破損或者機(jī)械損傷，但含有花旗松素的實(shí)驗(yàn)組明顯較對(duì)照更高。以E.coli為例，培養(yǎng)至24 h 的1/2、1、2 MIC 實(shí)驗(yàn)組OD260測(cè)試值是同期對(duì)照組的1.18、1.52 和1.88 倍，表明菌體有大量?jī)?nèi)容物泄露，與花旗松素濃度呈正相關(guān)，且泄漏量隨處理時(shí)間延長(zhǎng)而增大。對(duì)比兩株供試菌受到影響的程度，E.coli組OD260變化較S.aureus組更大，這可能是由于花旗松素對(duì)革蘭氏陰性菌的細(xì)胞壁膜破壞更明顯所致。

2.5 花旗松素對(duì)菌體細(xì)胞質(zhì)膜滲透性影響

β-半乳糖苷酶是細(xì)菌胞質(zhì)內(nèi)的水解酶，可分解乳糖。研究發(fā)現(xiàn)，ONPG 作為乳糖類似物可進(jìn)入菌體細(xì)胞被β-半乳糖苷酶水解，產(chǎn)生半乳糖和在405 nm有特征吸收的鄰-硝基苯酚。若細(xì)胞膜遭受破壞，膜通透性增強(qiáng)，ONPG 可迅速進(jìn)入菌體細(xì)胞[26]。因此可以通過(guò)測(cè)定OD405判斷鄰-硝基苯酚的產(chǎn)生量，進(jìn)而評(píng)價(jià)花旗松素對(duì)細(xì)胞膜滲透性的作用。結(jié)果如圖6 所示，可見添加花旗松素后，E.coli和S.aureus的細(xì)胞質(zhì)膜滲透性均有顯著增加（P＜0.05）。在培養(yǎng)作用初期，花旗松素對(duì)E.coli膜滲透性作用明顯，隨花旗松素濃度增大而增強(qiáng)。隨處理時(shí)間延長(zhǎng)，花旗松素對(duì)S.aureus膜滲透性影響逐漸增強(qiáng)，4 h 時(shí)細(xì)菌膜滲透性較E.coli更高。

圖6 花旗松素對(duì)供試菌細(xì)胞膜滲透性作用及β-半乳糖苷酶泄漏情況Fig.6 Effects of taxifolin on cell membrane permeability of test bacteria and leakage of β-galactosidase

將花旗松素處理后的菌液離心測(cè)試β-半乳糖苷酶相對(duì)活性，觀察胞外β-半乳糖苷酶泄漏情況。結(jié)果表明，2 MIC 花旗松素處理E.coli和S.aureus后，檢測(cè)到胞外β-半乳糖苷酶的相對(duì)活性分別為79.15%和70.1%，說(shuō)明花旗松素的引入使菌體細(xì)胞膜受到破壞，導(dǎo)致上清液中有大量β-半乳糖苷酶泄漏，這與胞內(nèi)大分子物質(zhì)泄漏的測(cè)試結(jié)果一致。

2.6 花旗松素對(duì)菌體胞內(nèi)抗氧化酶活性影響

在遭受環(huán)境脅迫時(shí)，微生物胞內(nèi)電子氧化呼吸鏈會(huì)受到影響，自由基代謝平衡被打破，誘導(dǎo)氧化應(yīng)激[19]。過(guò)氧化物酶（POD）、過(guò)氧化氫酶（CAT）、超氧化物歧化酶（SOD）是胞內(nèi)清除超氧自由基的抗氧化酶系，保護(hù)機(jī)體免受應(yīng)激損傷[27]。如圖7 所示，在花旗松素作用下，E.coli和S.aureus胞內(nèi)POD、CAT、SOD 酶活較對(duì)照組明顯升高，且隨作用時(shí)間延長(zhǎng)而增大。當(dāng)花旗松素作用于E.coli到24 h 時(shí)，各實(shí)驗(yàn)組差異最大，其POD、CAT、SOD 酶活分別是對(duì)照組的1.72、1.22、1.53 倍。在花旗松素對(duì)S.aureus作用中，CAT 和SOD 在8 h 時(shí)最顯著，分別是對(duì)照組的1.21、1.71 倍，24 h 時(shí)POD 差異最大，是對(duì)照組的2.54 倍。這說(shuō)明花旗松素作用后使細(xì)菌均產(chǎn)生了不同水平的氧化壓力，生成了更多的ROS 造成菌體損傷，而細(xì)菌自身為應(yīng)對(duì)這類刺激產(chǎn)生了更高水平的抗氧化酶。

圖7 花旗松素對(duì)供試菌胞內(nèi)抗氧化酶系活性的影響Fig.7 Effects of taxifolin on the activities of antioxidant enzyme system of the bacteria

2.7 花旗松素與白屈菜紅堿聯(lián)合抑菌效果

如圖8，當(dāng)將白屈菜紅堿和花旗松素以1/4 CHE+1/4 TFL 濃度混合用于聯(lián)合抑菌時(shí)發(fā)現(xiàn)，對(duì)于E.coli而言，藥物聯(lián)用效果在前4 h 中不明顯，在6～24 h 過(guò)程中較1/4 MIC 白屈菜紅堿和1/4 MIC 花旗松素單獨(dú)作用效果更顯著。對(duì)S.aureus來(lái)說(shuō)，兩種藥物聯(lián)用后對(duì)細(xì)菌生長(zhǎng)的抑制作用持續(xù)到24 h，效果明顯。通過(guò)Bliss 獨(dú)立模型[28]計(jì)算藥物聯(lián)合作用對(duì)E.coli和S.aureus生長(zhǎng)速率結(jié)果分別為-0.0279和0.0142，表明花旗松素和白屈菜紅堿藥物聯(lián)用后對(duì)E.coli表現(xiàn)為拮抗作用，而對(duì)S.aureus表現(xiàn)為協(xié)同作用。后續(xù)實(shí)驗(yàn)將對(duì)藥物聯(lián)用于S.aureus的協(xié)同作用機(jī)制進(jìn)行主要分析。

圖8 藥物聯(lián)合對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌抑菌及協(xié)同指數(shù)的計(jì)算Fig.8 Calculation of bacteriostatic and synergistic index of drug combination on E.coli and S.aureus

2.8 花旗松素與白屈菜紅堿聯(lián)合抑菌的探究

如圖9，相較于前文中對(duì)花旗松素作用于S.aureus的胞內(nèi)大分子物質(zhì)泄漏情況，1/4 白屈菜紅堿+1/4 花旗松素濃度的白屈菜紅堿和花旗松素聯(lián)用后，測(cè)得實(shí)驗(yàn)組OD260和OD280值明顯較花旗松素單獨(dú)作用更高，甚至分別是24 h 2 MIC 濃度花旗松素的1.04 倍和1.6 倍。此外，通過(guò)在405 nm 處測(cè)試鄰-硝基苯酚的吸光度值發(fā)現(xiàn)，在藥物聯(lián)用作用下培養(yǎng)液吸光度值隨菌體生長(zhǎng)和培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)而逐步上升，說(shuō)明有大量的ONPG 被β-半乳糖苷酶水解，表明細(xì)胞膜滲透性增強(qiáng)。而且，培養(yǎng)上清液中β-半乳糖苷酶活達(dá)87.01%，較2 MIC 花旗松素單獨(dú)作用S.aureus酶活性高16.91%，這也說(shuō)明藥物聯(lián)用后對(duì)菌體細(xì)胞膜破壞更嚴(yán)重，導(dǎo)致β-半乳糖苷酶泄露量增多。

圖9 藥物聯(lián)用對(duì)金黃色葡萄球菌核苷酸及酶泄露和細(xì)胞膜滲透性的影響Fig.9 Effects of drug combination on nucleotides and enzymes leakage and cell membrane permeability of S.aureus

聯(lián)合抑菌作用后胞內(nèi)POD、CAT 和SOD 酶活變化如圖10 所示。相較對(duì)照組，各抗氧化酶活均有所上升。經(jīng)比較分析，24 h CAT、SOD 和POD 酶活較單獨(dú)使用1 MIC 濃度花旗松素對(duì)S.aureus作用要更高，分別是其1.28、1.25、1.11 倍。表明1/4 MIC濃度花旗松素和1/4 MIC 濃度白屈菜紅堿對(duì)菌體殺傷作用更大，氧化壓力更強(qiáng)。

圖10 藥物聯(lián)用對(duì)金黃色葡萄球菌POD、CAT、SOD 酶活性的影響Fig.10 Effects of drug combination on the activities of POD,CAT and SOD enzymes of S.aureus

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)在落葉松中利用超聲輔助乙醇熱浸提法得到純度較高的花旗松素純度為90%，將其用于抑菌研究。發(fā)現(xiàn)其對(duì)革蘭氏陰性和陽(yáng)性菌具有較好的抑菌效果，花旗松素對(duì)大腸桿菌與金黃色葡萄球菌MIC 均為1.2 mg/mL，抑菌效果達(dá)到80%以上。并通過(guò)觀察抑菌過(guò)程中的形態(tài)變化，發(fā)現(xiàn)明顯褶皺、凹陷干癟、菌體表面有不規(guī)則突起，均勻且出現(xiàn)空腔，開始出現(xiàn)消融現(xiàn)象，胞內(nèi)大分子物質(zhì)泄漏24 h OD260均與對(duì)照組相比增長(zhǎng)了3.21、3.01 倍，說(shuō)明花旗松素對(duì)菌體細(xì)胞膜產(chǎn)生破壞作用，導(dǎo)致大量核苷酸泄露。2 MIC 花旗松素處理E.coli和S.aureus后，檢測(cè)到胞外β-半乳糖苷酶的相對(duì)活性分別為79.15%和70.1%，說(shuō)明花旗松素的引入使菌體細(xì)胞膜受到破壞，導(dǎo)致上清液中有大量β-半乳糖苷酶泄漏，這與胞內(nèi)大分子物質(zhì)泄漏的測(cè)試結(jié)果一致。抗氧化酶活性測(cè)定中發(fā)現(xiàn)酶活性增強(qiáng)，與花旗松素破壞菌體產(chǎn)生了更多的ROS 引起菌體應(yīng)激性增強(qiáng)有關(guān)。與白屈菜紅堿進(jìn)行藥物聯(lián)合抑菌實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)二者對(duì)革蘭氏陰性菌表現(xiàn)為拮抗作用，而革蘭氏陽(yáng)性菌具有協(xié)同作用，這可能是由于細(xì)菌細(xì)胞壁膜組成成分差異所致。在聯(lián)合抑菌實(shí)驗(yàn)中，添加較低濃度的花旗松素和白屈菜紅堿即可達(dá)到更好的抑菌效果，細(xì)胞膜滲透性大幅增加比單獨(dú)作用S.aureus酶活性高16.91%，這也說(shuō)明藥物聯(lián)用后對(duì)菌體細(xì)胞膜破壞更嚴(yán)重，導(dǎo)致β-半乳糖苷酶泄露量增多，1/4 MIC 藥物聯(lián)用對(duì)菌體殺傷力更大氧化壓力也隨之增強(qiáng)，伴有大量的胞內(nèi)大分子物質(zhì)泄漏。這說(shuō)明二者聯(lián)用的協(xié)同抑菌效果主要是通過(guò)增強(qiáng)對(duì)細(xì)胞膜的破壞實(shí)現(xiàn)的。基于此，我們?cè)谙乱徊窖芯坑?jì)劃中將主要針對(duì)典型食源性致病菌，挖掘花旗松素及其與生物堿聯(lián)用的廣譜抑菌性能和機(jī)理，以擴(kuò)展花旗松素產(chǎn)品的應(yīng)用領(lǐng)域，制造可觀的生態(tài)經(jīng)濟(jì)效益，使其成為特色林業(yè)產(chǎn)業(yè)發(fā)展的新亮點(diǎn)。