蜜環菌Am-07-22 發酵對玉米赤霉烯酮降解效果影響及機理初探

王澤賢，趙宇楠，賈丹丹，紀晚唐，許 丁，向楊玲，蔡 丹，劉景圣

（吉林農業大學食品科學與工程學院，小麥和玉米深加工國家工程研究中心，吉林長春 130118）

玉米赤霉烯酮（Zearalenone，ZEN）是一種非甾體雌激素真菌毒素，又稱為F-2 毒素，是一種主要由鐮刀菌屬真菌產生的次級代謝產物，主要存在于被污染的玉米、小麥、大米、大豆等谷物中[1]。ZEN 會通過多種途徑污染谷物，食品和飼料等，嚴重威脅人類健康和生命安全，其化學結構與許多類雌激素具有相似的特性，會激活雌激素受體，引起農產動物的流產、死胎、畸形胎等生殖障礙[2]。另外ZEN 還會通過食物鏈進入人體，造成免疫損傷[3]、肝臟損傷[4]、具有遺傳毒性[5]、誘發癌癥[6]等危害。ZEN 的污染及毒性危害較大，因此尋找到高效降解ZEN 的方法變得尤為重要。

常見的降解玉米赤霉烯酮的方法包括物理方法、化學方法和生物方法[7]。物理方法主要通過熱處理、紫外線輻射或γ射線照射、吸附劑吸附等[8-9]。化學方法包括氨化法、堿法、臭氧處理、氧水處理等[10]。但物理化學方法具有降解效率較低，破壞營養成分，引入其他化學物質等不利因素等限制。而生物方法因其具有高效性、高特異性、污染少逐漸成為真菌毒素降解的聚焦熱點，研究表明玉米赤霉烯酮的生物降解主要來自以下兩類：微生物降解和酶降解[11]。迄今為止，大量研究成果顯示微生物具有顯著的脫除玉米赤霉烯酮的作用，種類主要涉及乳酸菌、芽孢桿菌、曲霉菌和酵母菌等[12-13]。Zhao 等[14]和 Xu 等[15]研究發現芽孢桿菌可有效降解 ZEN。González 等[16]測試了11 種已經能證明降解 AFB1 的芽孢桿菌降解 ZEN 的能力，結果發現所有菌株在 30 ℃ 下培養72 h 內均能降解 ZEN。另外 Sun 等[17]從發酵大豆中分離出的食品級黑曲霉 FS10 在 PDB 培養基中能有效去除 ZEN，菌絲體和培養濾液也可降低 43.10%和 68.16% 的 ZEN。

盡管現階段對細菌及相關酶降解ZEN 的相關研究較為普遍，但大型食用真菌降解ZEN 及相關機理的研究依然較少，國內外學者研究發現大型食用真菌能夠代謝產生漆酶，并且漆酶在降解真菌毒素方面有著良好的應用[18]。Loi 等[19]研究杏鮑菇漆酶Ery4和漆酶介體體系（LMSs）對多種真菌毒素及毒素聯合使用的降解能力，結果對AFB1、FB1、OTA、ZEN 和T-2 毒素均有不同程度的降解效果。Song 等[20]在畢赤酵母X33 中表達了來自秀珍菇的漆酶基因Lac2，結果表明Lac2-ABTS 和 Lac2-AS 兩種體系在pH4～8 及溫度40～60 ℃范圍內均為降解玉米赤霉烯酮的有效體系。

實驗室前期研究發現蜜環菌Am-07-22 具有能夠降解真菌毒素的潛力，因此本試驗在此基礎上以玉米赤霉烯酮（ZEN）為研究對象，蜜環菌Am-07-22 為試驗菌株，通過生物發酵降解的技術，研究蜜環菌Am-07-22 對ZEN 的降解特性和相關機理，為玉米赤霉烯酮生物脫毒提供新的菌株資源，為食用菌應用于真菌毒素防控奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

菌種 蜜環菌Am-07-22（Armillaria mellea）由小麥和玉米深加工國家工程研究中心保藏；玉米赤霉烯酮ZEN 固體標準品（純度＞99%）購于青島普瑞邦（Pribolab）生物工程有限公司，固體標準品用色譜級甲醇溶液溶解稀釋，配制成濃度為100 μg/mL 的ZEN 標準儲備液，于-20 ℃避光保存；蛋白酶K（≥30 units/mg protein）、SDS 上海阿拉丁生化科技股份有限公司；蜜環菌Am-07-22 固體斜面培養基為12°Bé麥芽汁瓊脂培養基；蜜環菌Am-07-22 液體培養基 馬鈴薯20%、蠶蛹粉0.5%、葡萄糖1%、蔗糖1%、酵母浸粉2%、磷酸二氫鉀 0.15%、七水合硫酸鎂0.075%、維生素B10.001%，pH 自然，121 ℃滅菌20 min。

1200 型高效液相色譜儀 美國Agilent 公司；JY 92-IIN 超聲波細胞破碎儀（配備φ6 變幅桿）寧波新芝生物科技股份有限公司；Allegra X-30R 高速離心機 美國Beckman 公司；DSX-18L-I 手提式高壓蒸汽滅菌鍋 上海申安醫療器械廠；Stab S2 振蕩培養箱 上海潤度生物科技有限公司；HH-S4 數顯恒溫水浴鍋 常州市金壇友聯儀器研究所；BSA2245電子分析天平 Sartorious（北京）有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 菌種活化 參考何音華[21]的方法對菌種進行活化，將保藏的蜜環菌Am-07-22 菌種轉接至12°Bé新鮮麥芽汁瓊脂斜面培養基中，并放置于培養箱，在27 ℃條件下培養至第12 d 備用。

將活化好的蜜環菌Am-07-22 菌株從固體斜面培養基中取8 塊1 cm3的菌體接種至30 mL 液體培養基中，于27 ℃恒溫搖床中振蕩培養6 d，搖床轉速為160 r/min，培養結束即為制得的一級種子液，于4 ℃的條件下保存。再將一級種子液打碎，以8%的接種量接種至200 mL 的液體種子培養基中，于27 ℃、160 r/min 的培養條件下再次振蕩培養6 d，得到二級種子液。二級種子液也于4 ℃條件下保存。

1.2.2 ZEN 的檢測 參考駱翼[22]的高效液相色譜的ZEN 檢測條件并加以改進，具體的檢測條件如下：

色譜柱：Extend-C18柱，柱長150 mm，內徑4.6 mm，粒度5 μm。流動相：甲醇:水=70:30、柱溫：25 ℃、流速：0.6 mL/min、進樣量：20 μL、紫外吸收波長：236 nm。

吸取適量的ZEN 標準儲備液，用甲醇溶液稀釋，配制成15、10、5、2、1、0.5、0.2 μg/mL 的不同濃度ZEN 工作液，于4 ℃避光保存。標準工作液經過0.22 μm 濾膜過濾后，使用高效液相色譜儀進行檢測。以ZEN 濃度為橫坐標，以高效液相色譜檢測ZEN 的峰面積為縱坐標繪制標準曲線。

1.2.3 蜜 環 菌Am-07-22 降 解ZEN 效 果 及ZEN 回收率的測定 將制備好的蜜環菌Am-07-22 二級種子培養液（菌種濃度為75 g/L）破碎處理后，接種至ZEN 含量為5 μg/mL 的10 mL 液體培養基中，接種量為10%，然后將反應體系在27 ℃，160 r/min 的恒溫搖床中振蕩避光反應7 d。取1 mL 上清液加入1 mL 甲醇溶液進行ZEN 的提取，然后在10000 r/min的條件下低溫離心10 min，取上清再經過0.22 μm濾膜過濾后，使用高效液相色譜儀檢測ZEN 的含量，并計算ZEN 的降解率。ZEN 降解率計算公式如下：

式中，ZEN 對照組：ZEN 含量為5 μg/mL 未接種蜜環菌Am-07-22 的液體培養基。

同時對該提取方法進行加標回收率的計算，分別添加0.5、2、10 μg/mL 濃度的ZEN 標準工作液，采用上述方法提取與檢測，每個濃度3 個平行。

1.2.4 ZEN 濃度對蜜環菌Am-07-22 降解的影響將打碎的蜜環菌Am-07-22 二級種子液接種至含有ZEN 濃度分別為2、5、7.5、10、15 μg/mL 的10 mL液體培養基中，接種量為10%，每個菌種3 個平行，然后將反應體系在27 ℃，160 r/min 的恒溫搖床中振蕩避光反應7 d。提取ZEN 后使用高效液相色譜儀檢測玉米赤霉烯酮的含量，每組3 個平行，并計算ZEN 的降解率和降解量。

1.2.5 培養時間、溫度、初始pH 和接種量對蜜環菌Am-07-22 降解ZEN 的影響 將打碎的蜜環菌Am-07-22 二級種子液接種至含有ZEN 濃度分別為5 μg/mL 的10 mL 初始pH 分別為4、5、6、7、8、9 的液體培養基中，接種量分別為2.5%、5%、7.5%、10%、12.5%、15%，然后將反應體系在18、21、24、27、30、33 ℃，160 r/min 的恒溫搖床中振蕩避光分別反應4、5、6、7、8、9 d。其中單因素固定條件為培養時間7 d、培養溫度27 ℃、初始pH 自然、接種量10%。使用高效液相色譜儀檢測玉米赤霉烯酮的含量，每組3 個平行，并計算ZEN 的降解率。

1.2.6 蜜環菌Am-07-22 降解ZEN 活性部位的檢測

將蜜環菌Am-07-22 重新接種于液體種子培養基中，在27 ℃恒溫搖床中以160 r/min 轉速的條件下振蕩培養6 d。培養結束后用4 層濾布過濾，收集所得到的菌絲體及發酵上清液，對降解ZEN 的菌體種子發酵液活性部位進行檢測，共分3 組進行，以含有濃度為5 μg/mL 的ZEN 作為對照組，每組取3 個重復樣品進行試驗。

參考金博文[23]的方法對不同組進行處理，A 組（發酵上清液）：取過濾后的上層發酵液，在4 ℃，10000 r/min 的條件下低溫離心10 min，收集上清液1 mL。B 組（菌絲體組）：稱取過濾后的下層菌絲體1 g，用PBS 緩沖液輕輕漂洗3～5 次。C 組（細胞破碎組）：稱取過濾后的下層菌絲體1 g，用PBS 緩沖液輕輕漂洗3～5 次，進行細胞超聲破壁處理2 h（200 W，工作5 s，間歇5 s），然后在10000 r/min 的條件下低溫離心10 min，收集胞內液1 mL。將制備后的實驗組加入稀釋后的ZEN 標準儲備液（見1.1），體系中ZEN 的濃度為5 μg/mL，反應體系在27 ℃、160 r/min條件下避光振蕩培養7 d。

1.2.7 蜜環菌Am-07-22 降解ZEN 活性物質性質的初步分析 參考景思源[24]的處理方法對活性物質進行分析，分3 組處理：1 組（蛋白酶K 組）：取5 mL 發酵上清液，加入250 μL 蛋白酶K（終濃度為0.1 mg/mL），55 ℃處理2 h。2 組（SDS 組）：取5 mL 發酵上清液，加入250 μL SDS（終濃度為0.5 mg/mL），55 ℃處理2 h。3 組（蛋白酶K+SDS 組）：取5 mL 發酵上清液，加入250 μL 蛋白酶K（終濃度為0.1mg/mL）和250 μL SDS（終濃度為0.5 mg/mL），55 ℃處理2 h。4 組（100 ℃沸水浴組）：取5 mL 發酵上清液，在100 ℃條件下沸水浴處理20 min。

將不同處理后的4 組發酵上清液用0.22 μm 濾膜過濾后，向其中加入ZEN 儲備液，體系中ZEN 的濃度為5 μg/mL，反應體系在27 ℃、160 r/min 條件下避光振蕩培養7 d。結束后使用高效液相色譜儀檢測ZEN 含量并計算降解率。同時用初始濃度為5 μg/mL ZEN 的發酵上清液作為對照組。

1.2.8 蜜環菌Am-07-22 產漆酶酶活測定 參考劉天睿等[25]的方法并加以改進，從發酵上清液中取樣測定蜜環菌Am-07-22 第1 d 至第10 d 產漆酶的酶活力，采用ABTS 法測定漆酶酶活，以ABTS 為底物，通過酶標儀測定漆酶活力。在200 μL 酶活反應體系中先加入50 μL 0.5 mmol/L 的ABTS 及100 μL 0.2 mol/L 檸檬酸鈉緩沖溶液（pH4.0），混合均勻，再加入稀釋10 倍后的酶液50 μL 啟動反應，每隔1 min記錄420 nm 吸光度值的變化，在符合線性關系處求出斜率并換算出酶活力。漆酶酶活性的定義為以每分鐘氧化1 μmol ABTS 所需要的漆酶量作為1 個酶的活力單位，酶活的單位為U/L。漆酶活力計算公式：

式中，ε為ABTS 的摩爾吸光系數為36000 L/（mol·cm），N 代表稀釋倍數，V 總代表酶活測定體系中的反應液的總體積，V 酶代表反應添加的酶液體積。

1.2.9 發酵時間、pH、金屬離子對蜜環菌Am-07-22發酵上清液降解ZEN 的影響 參考韋錦范[26]的方法并加以改進，按照上述方法收集蜜環菌Am-07-22的發酵上清液，向其中加入濃度為5 μg/mL ZEN 標準溶液，于27 ℃，160 r/min 的條件下振蕩反應。單因素固定條件為反應時間7 d、pH 自然、未添加金屬離子。分別在反應時間為1、2、3、4、5、6、7、8、9、10 d 取樣測定反應體系中ZEN 含量的變化，并計算降解率。分析不同時間對蜜環菌Am-07-22 發酵上清液降解ZEN 的影響。另外再取發酵上清液分別調節pH 為3、4、5、6、7、8、9、10，以及向其中加入濃度為10 mmol 的Na+、K+、Mg2+、Zn2+、Cu2+、Fe2+、Fe3+、Mn2+金屬離子，向其中加入濃度為5 μg/mL ZEN 標準溶液，于27 ℃，160 r/min 的條件下振蕩反應，以不添加金屬離子的發酵上清粗酶液反應7 d 作為對照，每組三個重復。反應結束后取1 mL 反應液加入等體積甲醇溶液進行玉米赤霉烯酮的提取，充分搖勻后在10000 r/min 的條件下低溫離心10 min，再經過0.22 μm 濾膜過濾后，使用高效液相色譜儀檢測玉米赤霉烯酮的含量，并計算ZEN 的降解率。分析不同pH 與不同金屬離子對蜜環菌Am-07-22 發酵上清液降解ZEN 的影響。

1.3 數據處理

所有試驗數據均為一式三份，并用“平均值±標準差”的形式表示。采用SPSS 23 進行數據的顯著性分析，P＜0.05 表示具有顯著性差異。使用Pearson相關性分析法來分析ZEN 降解率與漆酶酶活之間的相互關系。最后使用Origin 2019 軟件進行數據處理與圖像繪制。

2 結果與分析

2.1 蜜環菌Am-07-22 對ZEN 的降解效果

通過高效液相色譜法對不同濃度的ZEN 進行測定，最終得到的標準標準曲線線性回歸方程：y=150.13x+5.0423，其中R2=0.9999，表明線性關系良好。通過向培養基中添加5 μg/mL 的ZEN，并利用蜜環菌Am-07-22 菌株進行發酵降解，由圖1 的高效液相色譜圖可知蜜環菌Am-07-22 對5 μg/mL ZEN的降解效果良好，降解率可達73.83%。另外通過添加0.5、2、10 μg/mL 濃度的ZEN，回收率測定分別為96.38%±1.28%、98.64%±0.37%、97.63%±0.95%。表明此方法對ZEN 的回收率較高，準確性良好，符合檢測標準。

圖1 菌株Am-07-22 降解ZEN 的液相色譜圖Fig.1 Liquid chromatogram of strain Am-07-22 degrading ZEN

2.1.1 ZEN 濃度對蜜環菌Am-07-22 降解效果的影響 如圖2 所示，蜜環菌Am-07-22 對不同濃度ZEN的降解率有所不同，當初始濃度為2 μg/mL 時降解率可達97.32%，ZEN 濃度為5 μg/mL 時具有73.83%±1.34%（圖1 中的液相色譜圖出自此次實驗）的降解率，而當ZEN 的濃度升至10 μg/mL 和 15 μg/mL 時，降解率則更低分別為49.47%和32.55%。由此可見降解率隨著ZEN 濃度的升高而下降。但從圖3 中可以看出當初始濃度為2 μg/mL 時對ZEN 的降解量為19.46 μg，初始濃度為5 μg/mL 時對ZEN 的降解量為36.5 μg，而在初始濃度為10 μg/mL 和15 μg/mL時可降解ZEN 的量則均超過了48.82 μg，并且差異不顯著（P＞0.05），因此蜜環菌Am-07-22 對ZEN 的降解量逐漸升高且趨于穩定。在低濃度時，初始ZEN的含量本身較低，盡管降解率很高但最終的降解量依然較低，而在高濃度時初始ZEN 的含量則較高，即使降解率有所下降，但降解量卻不斷增高，最后逐漸穩定達至降解上限。菌株對ZEN 濃度為2 μg/mL 的降解率已經超過97%，降解效果較好，為了節省成本，后續選擇初始濃度為5 μg/mL 的 ZEN 進行實驗。

圖2 ZEN 初始濃度對Am-07-22 降解ZEN 降解率的影響Fig.2 Effect of initial ZEN concentration on the degradation rate of ZEN by Am-07-22

圖3 ZEN 初始濃度對Am-07-22 降解ZEN 降解量的影響Fig.3 Effect of initial ZEN concentration on the degradation content of ZEN by Am-07-22

2.1.2 培養時間對蜜環菌Am-07-22 降解ZEN 的影響 由圖4 可知，蜜環菌Am-07-22 對ZEN 的降解率會隨著培養時間的延長而逐漸增大（P＜0.05），從最開始的第4 d 降解率為52.64%上升至第7 d 的72.08%。而第8、9 d 的降解率升至77.41%和77.23%，此時降解率的差異不顯著（P＞0.05），表明第8～9 d 的降解率最高并已趨于穩定。這可能是因為8 d 為蜜環菌Am-07-22 的最佳生長時間，此時菌種活力最強，對ZEN 的降解率也達到最大，即使延長培養時間，ZEN的降解率也不會有顯著變化，這與Wang 等[27]的研究結論相符。因此最佳的培養時間為第8 d。

圖4 時間對Am-07-22 降解ZEN 降解率的影響Fig.4 Effect of time on the degradation rate of ZEN by Am-07-22

2.1.3 培養溫度對蜜環菌Am-07-22 降解ZEN 的影響 由圖5 可知，在18～27 ℃的范圍內蜜環菌Am-07-22 對ZEN 的降解率隨溫度的升高而顯著增大（P＜0.05），從18 ℃時39.92%的降解率升高至27 ℃時的73.94%。而在27～33 ℃的條件下，降解率反而隨溫度升高而顯著下降（P＜0.05），其中在33 ℃時對ZEN 降解率為45.52%。這表明過高或過低的溫度對蜜環菌Am-07-22 降解ZEN 的影響均較大，在不適宜的溫度條件下蜜環菌的生長環境變差，因此對ZEN 的降解率也會降低，這一結果與Xu 等[15]的研究相符，因此最佳的培養溫度為27 ℃。

圖5 溫度對Am-07-22 降解ZEN 降解率的影響Fig.5 Effect of temperature on the degradation rate of ZEN by Am-07-22

2.1.4 初始pH 對蜜環菌Am-07-22 降解ZEN 的影響 由圖6 可知，在pH4.0～9.0 范圍內隨著pH 的增大，蜜環菌Am-07-22 對ZEN 的降解率呈現先升高后降低的趨勢（P＜0.05），pH 為7.0 時的降解率最高可達75.22%。而pH 為4.0 及9.0 時的降解率僅為45.89%和61.97%。這說明在過酸或過堿的環境下，降解效果均會受到影響。在pH 為7.0～8.0 的環境中降解效果最佳，降解率達到最高（自然pH 為6.2，蜜環菌Am-07-22 在此條件下的生長狀態最好，但不是最佳的降解ZEN 的初始pH），這與Tan 等[28]的研究結果相近。因此選擇初始pH 為7.0 作為降解ZEN最佳的初始pH。

圖6 初始pH 對Am-07-22 降解ZEN 降解率的影響Fig.6 Effect of initial pH on the degradation rate of ZEN by Am-07-22

2.1.5 菌液接種量對蜜環菌Am-07-22 降解ZEN 的影響 由圖7 可知，隨著蜜環菌Am-07-22 菌液接種量的增加，對ZEN 的降解率逐漸升高（P＜0.05）。最終在接種量為10%～15%時趨于恒定，此時的降解率均高于73%。這表明了蜜環菌Am-07-22 在此時的生長環境中已然達到最大的生長量，接種量的增加也不會表現出對ZEN 降解率的升高。為節省蜜環菌Am-07-22 菌種用量，選擇接種量10%作為最佳降解ZEN 的接種量。最終選擇的降解條件為培養時間8 d，培養溫度27 ℃，初始pH7.0，接種量10%，此時對ZEN 的降解率最佳為78.72%。

圖7 菌液接種量對Am-07-22 降解ZEN 降解率的影響Fig.7 Effect of the added amount of fungal liquid on the degradation rate of ZEN by Am-07-22

2.2 蜜環菌Am-07-22 對ZEN 的降解機理初探

2.2.1 蜜環菌Am-07-22 降解ZEN 的活性部位 從圖8 中可以看出蜜環菌Am-07-22 不同組分對ZEN的降解效果差異較為明顯（P＜0.05）。其中發酵上清液對ZEN 的降解率最高為47.42%，而Am-07-22 菌體細胞的降解率為37.05%，破碎后的菌體細胞對ZEN 的降解率最低僅為13.08%。由此可以推斷，蜜環菌Am-07-22 對ZEN 的清除作用不是單一的一種方式，存在多種途徑。最主要的清除作用為發酵上清液對ZEN 的降解作用，而菌體細胞對ZEN 也有一定程度的吸附作用。

圖8 菌株Am-07-22 的不同組分對ZEN 的降解率Fig.8 Degradation rate of ZEN by different components of Am-07-22

2.2.2 蜜環菌Am-07-22 降解ZEN 活性物質的分析

由圖9 可知，通過對蜜環菌發酵上清液進行蛋白酶K、SDS、沸水浴等處理，發現以上幾種處理方式對ZEN 降解有顯著的影響（P＜0.05）。蛋白酶K 和SDS 處理后的降解率分別為12.65%和22.89%，蛋白酶K+SDS 共同處理的降解效果與蛋白酶單獨處理的降解效果差異則不顯著（P＞0.05）。而沸水浴后對ZEN 的降解率僅為5.55%，降解能力明顯下降。推測在蜜環菌分泌的多種活性成分中，發酵上清液中存在的某種酶類會降解ZEN，蛋白酶K 和沸水浴會破壞這種酶的結構導致酶活力下降，對ZEN 的降解率由此下降，這與Imade 等[29]的研究結果相符。而蜜環菌具有良好地產生漆酶的特點，Banu 等[30]也研究發現漆酶對ZEN 具有降解潛力。

圖9 菌株Am-07-22 發酵上清液經不同處理后對ZEN 的降解率Fig.9 Degradation rate of ZEN by fermentation supernatant of strain Am-07-22 after different treatment

2.2.3 發酵時間對蜜環菌Am-07-22 發酵上清液降解ZEN 影響及產漆酶酶活測定 考察了發酵第1 d至第10 d 蜜環菌Am-07-22 發酵上清液中漆酶酶活力的變化及對ZEN 降解效果的影響并側重對兩者之間的相關性進行分析。由圖10 可知，隨著發酵時間的延長蜜環菌Am-07-22 發酵上清液對ZEN 的降解率逐漸增大（P＜0.05），從第1 d 21.69%的降解率上升至第10 d 62.50%的降解率，而蜜環菌產漆酶的酶活力也隨著發酵時間的延長逐漸升高（P＜0.05），由第1 d 的酶活僅為169.26 U/L，到第10 d 的酶活則上升至521.11 U/L，這與ZEN 的降解率升高保持一致。通過Pearson 相關性來分析ZEN 降解率與漆酶酶活之間的相互關系，結果證實在0.05 的顯著性水平上ZEN 降解率與漆酶酶活之間存在著顯著關聯，其相關性為正且r=0.973。由此可以推測蜜環菌Am-07-22 產生的漆酶可能在降解ZEN 中起主要作用，這與Banu 等[30]的研究結果相符。

圖10 不同發酵時間下Am-07-22 上清液對ZEN 的降解率和漆酶酶活的變化規律Fig.10 Change rule of degradation rate of ZEN and laccase activity of Am-07-22 supernatant under different fermentation time

2.2.4 不同pH 對蜜環菌Am-07-22 發酵上清液降解ZEN 的影響 由圖11 可以看出不同pH 對蜜環菌Am-07-22 發酵上清液對ZEN 的降解率影響較大。其中在pH 為6.0～7.0 時，ZEN 的降解率最高為46.98%和51.84%。兩者與不調節pH 的發酵上清液對照組沒有顯著性差異（P＞0.05）。而在酸性及堿性條件下，對ZEN 的降解率顯著降低（P＜0.05），在pH 為3.0 和10.0 時僅有8.29%和11.22%的降解率。表明了在過酸或過堿的條件下，發酵上清液中產生的漆酶會受環境影響結構被破壞，對ZEN 的降解作用因此下降，因此在不適宜的pH 條件下，漆酶無法有效地降解ZEN，致使對ZEN 的降解率降低。在pH 為6.0～7.0 的范圍內，均為降解ZEN 的適宜條件，這與白長勝等[31]的研究結果相符。

圖11 不同pH 對Am-07-22 發酵上清液對ZEN 降解率的影響Fig.11 Effect of different pH on the degradation rate of ZEN by the fermentation supernatant of Am-07-22

2.2.5 不同金屬離子對蜜環菌Am-07-22 發酵上清液降解ZEN 的影響 由圖12 可知，不同金屬離子對蜜環菌Am-07-22 發酵上清液降解ZEN 的影響效果不盡相同，其中Na+、K+和Fe2+的添加對發酵上清液降解ZEN 的效果與未添加金屬離子時的降解效果差異不明顯。Zn2+、Fe3+的添加對ZEN 降解率有一定的抑制作用（P＜0.05），降解率分別為42.09%和37.76%，Fe3+的抑制效果最明顯較對照降低了9.66%。而Cu2+、Mg2+、Mn2+的添加對發酵上清液降解ZEN的效果得到顯著增強（P＜0.05），添加Mg2+和Mn2+對ZEN 的降解率分別為55.57%和57.80%，而添加Cu2+對發酵上清液降解ZEN 的降解效果提升最高為63.37%，較未添加金屬離子的對照組提高了15.95%。由此可以推斷Cu2+會顯著增強漆酶的酶活力，這與祝嫦巍等[32]的研究結果一致，推測原因可能與漆酶本身的結構有關，漆酶為含四個銅離子的多酚氧化酶，屬于銅藍氧化酶類，因此Cu2+存在的環境中會增強漆酶的活性。

圖12 不同金屬離子對Am-07-22 發酵上清液對ZEN 降解率的影響Fig.12 Effect of different metal ions on the degradation rate of ZEN by the fermentation supernatant of Am-07-22

3 結論

本研究以蜜環菌Am-07-22 為試驗菌株，采用真菌生物發酵的方式降解玉米赤霉烯酮（ZEN）。其對5 μg/mL ZEN 的降解率可達78.72%，最適的降解條件為培養時間8 d，培養溫度27 ℃，初始pH7.0，接種量10%。蜜環菌Am-07-22 發酵上清液中的活性成分是降解ZEN 的主要方式，菌體細胞對ZEN 也有一定的吸附作用。另外發酵上清液對ZEN 的降解率與漆酶酶活的相關性較高，而且Cu2+對發酵上清液降解ZEN 具有最佳的促進作用。因此可推斷出蜜環菌Am-07-22 發酵上清液中產生的漆酶在降解ZEN 中起主要作用。本研究結果表明蜜環菌Am-07-22 具有降解玉米赤霉烯酮的能力，為玉米赤霉烯酮的防治提供了新的研究思路。