乳雙歧桿菌Y6 活菌型發酵乳對消化功能障礙人群腸道健康的影響

黎 旭，黃志鈺，黃 娟，陶純長，金庭飛,

（1.廣東益可維生物技術有限公司，廣東廣州 510630；2.廣東燕塘乳業股份有限公司，廣東廣州 511356）

人體腸道中包含著數以萬計、種類豐富的微生物，它們與宿主間存在著相互依存、相互制約的關系。腸道菌群失衡會對宿主健康產生不良影響，導致一些腸道疾病的發生。較為常見的腸道疾病包括功能性消化不良（functional dyspepsia，FD）和腸易激綜合征（irritable bowel syndrome，IBS）。前者的主要癥狀表現為上腹部疼痛或有燒灼感、餐后飽脹感或早飽等[1]。后者的癥狀表現為與大便形式或頻率變化相關的腹痛[2]。此外，神經及心理不適、無明顯腸功能障礙但伴隨疼痛感增加的健康損害也是IBS 多種亞型的重要典型特征[3]，且IBS 常與FD 并存伴發[4]。患有FD 和IBS 會對人們的生活和工作產生不利影響[5-6]，統計顯示全球范圍內患FD 和IBS 的人群占比分別約為7%～45%和11%（成年人）[7-8]，人群規模相對較大。腸道健康問題備受科學研究者的關注，已成為健康醫療等領域的研究熱點[9-10]。

益生菌具有改善腸道健康的功能[11]，可通過調節腸道菌群，產生抗菌物質，修復和維護腸道粘膜屏障，激活機體免疫等方式來緩解IBS 的臨床癥狀[12]。研究表明攝入長雙歧桿菌可以改善IBS 的臨床癥狀同時提高患者的生活質量[13]。Christopher 等[14]分別利用嗜酸乳桿菌和乳雙歧桿菌對IBS 患者進行6 周干預，結果表明2 個益生菌組的IBS 癥狀嚴重程度評分均顯著下降（包括腹痛、腹脹、排便習慣和生活質量相關評分），且2 個益生菌組的糞便性狀均趨向正常化。有研究者發現，限制可發酵碳水化合物的攝入和補充益生元可以減輕一些IBS 患者的癥狀，這可能跟飲食對腸道菌群的調節有關[15-16]。在FD 治療方面，Shahram 等[17]、Zhang 等[18]和Igarashi 等[19]研究發現益生菌可以通過改變腸胃微生物組成從而改善整體消化不良的情況。Xue 等[20]在FD 大鼠模型中發現SCFAs 濃度異常是FD 的誘因之一。研究表明，腸道微生物群及其代謝產物SCFAs 可能導致IBS 的發病[21]。SCFAs 可以維護腸道屏障、參與機體的代謝及免疫調節，維持中樞神經系統的發育和穩態等[22-23]，能夠通過微生物-腸-腦軸，在神經內分泌系統中參與疼痛、焦慮和壓力的傳遞。因此，深入研究SCFAs 在腸道健康中發揮的作用很有意義。

活菌型發酵乳是活性益生菌攝入的優良載體，能相對穩定地保持益生菌的活性[11]。當前研究活菌型發酵乳通過膳食干預影響人體腸道健康的文獻并不多。本文通過膳食干預試驗，探究了乳雙歧桿菌Y6 的活菌型發酵乳對人體腸胃不適癥狀的改善情況，同時對干預后的人體腸道菌群和腸道內SCFAs的含量進行了測定評估。本研究為乳雙歧桿菌Y6的產品開發和應用研究提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

乳雙歧桿菌Y6（保藏號：CGMCC NO.15026）廣東益可維生物技術有限公司提供；生牛乳 廣東燕塘乳業股份有限公司提供；發酵劑 美國丹尼斯克公司；含乳雙歧桿菌Y6 活菌型發酵乳，乳雙歧桿菌Y6 活菌數≥2×108CFU/mL，200 mL/瓶 廣東燕塘乳業股份有限公司提供；硫酸、乙醚 分析純，國藥集團化學試劑有限公司；0.22 μm 濾膜 美國Millipore 公司；乙酸、丙酸、丁酸均為色譜級，純度大于99.0% 美國 Sigma 公司。

7890 氣相色譜分析儀 美國安捷倫公司；5424R高速冷凍離心機 德國Eppendorf 公司；Vortex-5 漩渦混勻儀 上海滬析公司；FA2104S 電子天平 上海恒平公司；BCD-181MLC 冷藏冷凍箱 合肥美菱公司；MDF-86V338 醫用低溫保存箱 安徽中科都菱公司；巴氏殺菌機 利樂公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品制備 含乳雙歧桿菌Y6 活菌型發酵乳的制備：生牛乳85 ℃、15 s 巴氏殺菌處理后冷卻至40～45 ℃接種發酵劑與乳雙歧桿菌Y6，灌裝后拉入43 ℃溫房發酵至終點酸度為70 吉爾涅爾度后進行冷卻后熟，成品2～8 ℃冷藏保存。

吉爾涅爾度的測定參照《GB 5009.239-2016 食品安全國家標準 食品酸度的測定》方法測定樣品滴定酸度值，每個樣品測定3 次取其均值。

1.2.2 受試者選擇及試驗設計

1.2.2.1 納入標準 選擇功能性消化不良，伴有長期胃腸不適，主訴食欲不振、早飽、氣多，胃腸脹滿，嘔吐，不明原因慢性腹瀉或大便秘結等自愿受試者。

1.2.2.2 排除標準 急性腹瀉者；嚴重器質性病變引起的消化不良者；體質虛弱無法接受試驗者；合并有心血管、肝、腎和造血系統等嚴重全身性疾病患者；未按要求服用受試樣品，無法判斷飲用結果者；乳糖不耐受或牛奶過敏者；在受試前1 周內服用過抗生素，在受試前1 個月內服用過瀉藥抗腹瀉藥物，在受試前2 個月內參加過其他研究項目，受試前2 周內連續服用過益生菌及其產品者。

1.2.2.3 受試對象 試驗共招募30 人，男女不限，年齡20～60 歲，試驗前均簽署知情同意書。

1.2.2.4 食用方法 膳食干預實驗共35 d，包括7 d排空期和28 d 飲用期。乳雙歧桿菌Y6 活菌型發酵乳樣品置于4 ℃冰箱存放，受試者在飲用期內每日午飯或晚飯后1 h 以內飲用，1 瓶/日。分別在排空期結束和飲用期結束時收集糞便樣本，并由醫生進行臨床癥狀評分[24]（如表1 所示），其中無明顯癥狀者可打0 分。在整個實驗過程中，受試者不可食用任何發酵食品（包括泡菜、腐乳、酸奶、奶酪、活性乳酸菌飲料等），但可飲用牛奶。

表1 臨床癥狀評分[24]Table 1 Clinical symptom score[24]

1.2.3 腸道菌群測定 糞便收集后快速密封并于-81 ℃速凍保存，使用干冰寄送至上海美吉生物，按照糞便DNA 提取試劑盒說明書對樣本進行總DNA的提取，腸道菌群多樣性測序利用Illumina PE300測序平臺，對16S rDNA PCR 產物片段進行高通量測序，測序工作由上海美吉生物醫藥科技有限公司完成，基于I-Sanger 云平臺（https://www.i-sanger.com/）進行生物信息學及數據統計分析。

生物信息分析方法：依據overlap 關系對PE reads 進行拼接，同時對序列質量質控和過濾，各樣本進行OTU 聚類分析和物種分類學分析，基于OTU 進行多樣性指數分析。在各分類水平上進行群落結構的統計分析。并對多樣本的群落組成信息進行分析和差異顯著性檢驗等。

1.2.4 短鏈脂肪酸（SCFAs）含量測定 標準品配制：取適量乙酸、丙酸、丁酸標準品，用乙醚配制成0.1、0.5、2、5、10、50、100、250、500 μg/mL 的混合標準濃度梯度。母液及工作標準溶液均保存于0 ℃。

糞便樣品處理根據張炎等[25]方法加以改進，稱取1.0 g 糞便置于15 mL 離心管，加入10 mL ddH2O和適量玻璃珠振蕩分散10 min，4000×g 離心15 min，取上清液，過0.22 μm 濾膜收集濾液，取2 mL 過濾液于離心管，加入50%的硫酸溶液0.2 mL，乙醚2.0 mL，振蕩10 min 后4000×g 離心15 min，10 ℃靜置30 min，取上層乙醚溶液進行氣相色譜分析，將樣品與標品譜圖對比進行定性，采用外標法繪制標準曲線進行定量分析。

色譜條件：FID 氫火焰離子檢測器；60～80 目（酸洗、硅烷化）不銹鋼柱（25 m×0.320 mm）色譜柱，涂漬填充10% FFAD 和1% H3PO4；升溫程序：80 ℃保持1 min，以10 ℃/min 升至140 ℃，保持5 min，以25 ℃/min 升至240 ℃，保持4 min；載氣（N2）壓力260 kPa；氮氣流速為40 mL/min，氫氣流速為30 mL/min，空氣流速為400 mL/min；進樣量1 μL；檢測溫度280 ℃。N2000 色譜工作站收集信號并檢測。

1.3 數據處理

利用SPSS 21.0 軟件對結果進行統計分析，各項指標結果以“平均值±標準差”（mean±SD）表示。自身對照資料采用配對t檢驗，P＜0.05 視為顯著性差異，具有統計學意義。

2 結果與分析

2.1 受試者基本情況

受試者30 人，脫落5 人，有效受試樣本25 人，基本情況（年齡、性別、BMI 等）見表2。

表2 受試者飲用前基本情況Table 2 Basic information of subjects before ingesting

2.2 臨床癥狀評分變化

受試者飲用前后的臨床癥狀評分如圖1 所示。飲用28 d，受試者噯氣、泛酸、食欲不振癥狀完全消失（癥狀積分＜0.1），腹痛、腹脹、腹瀉或便秘等其他癥狀評分極顯著降低（P＜0.01），說明乳雙歧桿菌Y6 活菌型發酵乳對功能性消化不良人群的臨床癥狀有顯著的改善效果。

圖1 人群飲用前后臨床癥狀積分的變化Fig.1 Change in clinical symptom score before and after ingesting

2.3 腸道菌群的變化

2.3.1 糞便樣本的稀釋曲線與Rank-Abundance 曲線 由圖2 可知，對50 個樣本進行測序，基于97%相似度的分類水平，共注釋到2019 個OTUs，測序深度可以覆蓋樣品中的絕大部分微生物種類。Rank-Abundance 曲線顯示相對豐度高于1%的細菌種類在各樣本中均較少，隨樣本中物種組成豐富度的增加，曲線逐漸平坦，物種組成的均勻度逐漸提高。當樣本中相對豐度低于0.01%時，曲線趨于水平，不同樣本在不同OTU 豐度達到平臺期。

圖2 稀釋曲線與Rank-Abundance 曲線Fig.2 Rarefaction curve and Rank-Abundance curve

2.3.2 多樣性指數 如圖3 所示，飲用后與飲用前相比，Chao 指數與Sobs 有所增加但不顯著（P＞0.05），Shannon 指數無顯著性差異（P＞0.05），說明飲用前后腸道菌群的物種多樣性和豐富度沒有顯著改變。

2.3.3 物種組成分析 在門水平，如圖4 所示，干預前后腸道菌群中的優勢菌門均為擬桿菌門（Bacteroidetes）、變形菌門（Proteobacteria）、放線菌門（Actinobacteria）等。與飲用前相比，飲用期第28 d，厚壁菌門（Firmicutes）、擬桿菌門、放線菌門相對豐度增加，變形菌門、疣微菌門（Verrucomicrobia）相對豐度減少。IBS 是一種常見的功能性腸性疾病，具有復雜的病理生理學機制，可能跟胃腸道的異常運動，腸道的過敏反應，腸道微生物群的改變，胃腸道感染后的低度炎癥等因素有關[26]。有文獻報道，IBS 患者腸道內的厚壁菌門數量較多，擬桿菌門和放線菌門數量相對較少[27-28]。裘建明等[29]對腸道微生物菌群進行研究，發現厚壁菌門的部分菌屬能夠降解腸道黏蛋白，改變腸道黏膜的通透性，導致炎性反應的發生。擬桿菌門的部分菌屬能夠輔助刺激T 細胞介導從而出現腸道黏膜的炎性反應。以上結果表明，腸道中厚壁菌門和擬桿菌門數量的降低，能夠在一定程度減少腸道炎性反應的發生，從而在一定程度上緩解IBS 的癥狀，與本文的干預結果相似。

圖4 飲用前后腸道菌群門水平的變化Fig.4 Change in intestinal flora at phylum level before and after ingesting

在屬水平，對相對豐度大于1%的菌屬進行分析，結果如圖5，與飲用前相比，飲用期第28 d，顯著增加的有益菌屬為阿克曼氏菌（Akkermansia），有害菌屬Lachnoclostridium的相對豐度顯著降低（P＜0.05）。Akkermansia屬于疣微菌門，可以改善腸道屏障功能，增加黏液層厚度，降解黏蛋白，具有免疫調節作用，能夠緩解結腸炎的部分癥狀[30]。Lachnoclostridium菌屬于厚壁菌門，其相對豐度在不同的健康狀態下存在差異，在潰瘍性結腸炎和腸易激綜合征患者的腸道菌群中，Lachnoclostridium屬的含量較高[31]。綜合以上結果可以看出，飲用乳雙歧桿菌Y6 活菌型發酵乳可以改變腸道菌群屬的水平，使其中的有益菌Akkermansia增加，有害菌Lachnoclostridium降低，從而改善腸道不適癥狀。

圖5 飲用前后腸道菌群屬水平的變化情況Fig.5 Change in intestinal flora at genus level before and after ingesting

2.3.4 干預人群腸道菌群群體間多樣性分析 飲用前后人群腸道菌群結構的PCA 分析如圖6 所示，PC1 為第一主坐標，對整體菌群的代表性為60.48%，PC2 為第二主坐標，對整體菌群的代表性為24.3%，飲用前后，群落整體位于右側，各組之間未分開，說明各組菌群組成未發生顯著改變。

圖6 飲用前后人群腸道菌群結構的PCA 分析Fig.6 PCA analysis of intestinal flora structure before and after ingesting

2.3.5 物種差異分析 飲用前后人群腸道菌群LEfSe（wilcox test，P＜0.05，LDA=3.0）多級物種差異判別分析如圖7 所示，在飲用前，受試者腸道中主要富集的菌為Negativicutes，Selenomonadales，瘤胃球菌科（Ruminococcaceae），糞桿菌屬（Faecalibacterium）和Lachnoclostridium。在飲用乳雙歧桿菌Y6 活菌型發酵乳28 d 后，受試者腸道中主要富集的菌為芽孢桿菌綱（Bacilli），丹毒絲菌綱（Erysipelotrichia），乳桿菌目（Lactobacillales），丹毒絲菌目（Erysipelotrichales），鏈球菌科（Streptococcaceae），紅蝽菌科（Coriobacteriaceae），丹 毒 絲 菌 科（Erysipelotrichaceae），Eggerthellaceae，鏈球菌綱（Streptococcus），柯林斯菌屬（Collinsella）和Erysipelotrichaceae_UCG_003。

圖7 飲用前后腸道菌群的物種差異判別分析Fig.7 LEfSe analysis of intestinal flora before and after ingesting

Bacilli 在腸道中處于正常水平時是有益菌，能夠產生多種酶類，促進營養物質的消化吸收。Erysipelotrichia、Erysipelotrichales 當前在人類腸道微生物群中的重要性仍未得到明確研究[32]。而Lactobacillales 是腸道中的重要益生菌，其代謝產物可以有效降低腸道內pH，促進腸蠕動，調節腸道健康[33]。Streptococcaceae、Streptococcus 是腸道中多樣性的菌屬[34]，正常情況下對人體無害。Coriobacteriaceae可以產生短鏈脂肪酸從而維持腸道健康穩定[35]。

Eggerthellacea在腸道中能夠分解鞣花酸產生尿石素，增加連接蛋白的緊密水平，減少腸道炎癥，從而改善腸道健康[36]。Collinsella屬于放線菌門，與高水平馬尿酸有關，馬尿酸是腸道衍生的代謝產物，可作為健康的表征，Erysipelotrichaceae_UCG_003 屬能夠將復雜的碳水化合物消化并代謝為SCFAs[34]。由以上結果可知，飲用Y6 活菌型發酵乳能夠增加受試者腸道中的Lactobacillales、Coriobacteriaceae、Collinsella和Erysipelotrichaceae_UCG_003，可以通過在腸道中產生有益代謝產物從而改善腸道健康。

已有研究表明，食用益生菌產品主要通過調節腸道菌群，改善不正常的腸道微生物結構來緩解受試者的腸道不適癥狀，使其恢復正常的生理機能[37]。Harata 等[38]使用LGG-TMC0356 發酵乳對相關人群進行干預，結束時發現Collinsella和Lactobacillus等菌屬的豐度顯著增加，有效調節受試者的腸道菌群，從而改善相關不適癥狀。臧凱麗等[39]研究表明，益生菌干預能夠調控腸道菌群多樣性，同時提高腸道菌群的相對豐度，可以增加腸道不健康人群Lactobacillus和Collinsella的豐度，且能保持一段時間的穩定。孫二娜等[40]發現食用乳酸菌發酵飲料可以顯著增加腸道內的有益菌Lactobacillus和Muribaculaceae菌屬的豐度，從而緩解消化不良表現出的噯氣、泛酸、腹脹、腹痛等癥狀。Yang 等[41]用植物乳桿菌CCFM1143 治療慢性腹瀉，結果表明植物乳桿菌CCFM1143 治療組顯著降低了慢性腹瀉患者腸道內的Lachnoclostridium和Lachnospira的相對豐度，能夠減輕患者的臨床癥狀，改善生活質量。

2.4 人群糞便SCFAs 含量變化

受試者飲用前后糞便樣本SCFAs 的含量變化如圖8 所示，飲用后第28 d 與飲用第0 d 相比，糞便中乙酸、丙酸、丁酸含量顯著增加（P＜0.05），表明飲用乳雙歧桿菌Y6 活菌型發酵乳28 d 可以增加腸道內SCFAs 含量。SCFAs 對腸黏膜屏障的維護、腸易激綜合征的調節、免疫調節、抗癌等有積極效果[42]。張浩[43]研究發現SCFAs 在IBS 等患者糞便中顯著減少，其中丁酸減少的最為明顯。在腸道多種微生物混合發酵的體系中，糖分解代謝的主要最終產物是SCFAs、乙酸鹽、丙酸鹽和丁酸鹽，它們占結腸總SCFAs 的85%～95%[44]。大多數產丁酸的細菌不能直接利用某些益生元物質，但乳酸菌可以將這些益生元完全分解，產生乙酸和乳酸等代謝終產物。產丁酸細菌能夠進一步將這兩種類型的產物作為次生基質，發酵產生丁酸[45-46]。因此乳酸菌與產丁酸細菌的交互共生關系也是受試者在飲用Y6 活菌型發酵乳后丁酸含量增加的可能原因之一。

3 結論

本試驗研究表明，受試者在飲用28 d 乳雙歧桿菌Y6 活菌型發酵乳后，臨床癥狀評分結果表明噯氣、泛酸、食欲不振等癥狀完全消失，腹痛、腹脹、腹瀉或便秘等其他癥狀評分極顯著降低（P＜0.01），乳雙歧桿菌Y6 活菌型發酵乳對功能性消化不良人群的臨床癥狀有顯著的改善效果。另外，乳雙歧桿菌Y6 活菌型發酵乳可調節腸道菌群，與飲用前相比，人群腸道的厚壁菌門、擬桿菌門、放線菌門相對豐度增加，變形菌門、疣微菌門相對豐度減少。屬水平上，Akkermansia菌屬顯著增加，Lachnoclostridium菌屬的相對豐度顯著降低（P＜0.05）；物種差異分析表明Y6 活菌型發酵乳膳食干預后可以增加受試者腸道中Collinsella和Erysipelotrichaceae_UCG_003 屬；此外，隨著腸道菌群的改變，腸道中的SCFAs 含量增加。因此，飲用乳雙歧桿菌Y6 活菌型發酵乳有助于改善腸道微生態環境，調節腸道菌群，對促進腸道健康具有積極的作用。