銀柴胡多糖超聲輔助提取工藝優化及抗氧化活性分析

王 紅，彭 勵,2, ，宋 樂，馮 璐，李振凱，李彥青，高 跳

（1.寧夏大學生命科學學院，寧夏銀川 750021；2.寧夏天然藥物工程技術研究中心，寧夏銀川 750021）

銀柴胡（Stellariae Radix）是我國傳統中藥中常用的根類藥材[1]，作為寧夏道地藥材，其化學成分主要有甾醇類、黃酮類和生物堿等[2-4]。在傳統中醫臨床應用中，銀柴胡具有祛除小兒疳熱，治療骨蒸癆熱等功效[5]。在現代醫藥中，銀柴胡具有抗炎、抗過敏、抗癌、促進血管舒張等作用[6]。近年來，銀柴胡藥材主要食用方式是通過制作銀柴胡粥[7]、延胡索紅棗粥[8]以及與其他藥材制作荷葉包飯團[9]等，綜合利用率低，所以銀柴胡多糖的提取及其抗氧化的研究極其重要。

目前，植物多糖的提取方法主要以水提醇沉、超聲輔助法、微波輔助法為主，雖然近幾年已有新興的提取工藝并取得一定的效果，但是每種方法都有一定程度的局限性，例如：操作不易控制、設備價格昂貴等[10-11]，又因植物多糖是一種極性分子，易溶于水，不溶于有機溶劑[12]，因此水提醇沉是使用最廣泛的方法。

植物多糖大多選擇脂肪提取液為石油醚、乙醚和乙醇等有機溶劑進行除脂，此方法存在操作復雜、效率低、有機溶劑殘留和污染環境等缺點[13-14]。超臨界CO2萃取技術是一種新興的、綠色的提取方法，其原理是利用超臨界下的CO2低極性，高密度等特點，對物料中極性低，分子量小，親脂性強的物質實現提取分離[15]。本課題組[16]采用超臨界CO2萃取技術對實驗材料進行除脂處理，相較于蔡少青等[17]以銀柴胡為原料，采用乙醇、丙酮和乙醚等在索氏抽提器中回流除去非極性成分等方法，不僅減少了脫脂過程中的有機溶劑的使用，也減少多糖在脫脂過程中的損耗。同時，已有研究證明銀柴胡藥材具有清除自由基和活性氧的作用[18]，馮嬌等[19]認為此抗氧化作用與藥材中含有黃酮類成分有關，也有研究報道植物甾醇也具有清除自由基作用[20]，宋樂[21]證明抗氧化作用與脂質類成分有關。但銀柴胡的抗氧化作用是否與多糖成分有關，需要進一步研究。

基于此，本研究以銀柴胡為研究對象，采取單因素結合響應面法得到銀柴胡多糖最佳提取工藝，并通過Sevag 除蛋白后得到銀柴胡粗多糖，并以VC為陽性對照，DPPH·、·OH、ABTS+·清除率為指標探究其體外抗氧化活性。為銀柴胡多糖在功能性藥品或食品開發及傳統中藥藥效物質基礎的研究奠定了基礎，也使優化后的提取工藝參數對指導銀柴胡綜合開發利用具有實踐意義。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

采集3～4 年生人工栽培銀柴胡 產地為寧夏同心縣銀柴胡規范化種植基地，經寧夏大學生科院彭勵教授鑒定為石竹科繁縷屬植物銀柴胡的干燥根；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-trinitrophenylhydrazine，DPPH）上海化成工業發展有限公司；2,2-聯氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）（2,2'-Azin obis-（3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonate），ABTS）上海易恩化學技術有限公司；葡萄糖對照品 HPLC≥98%，上海源葉生物科技有限公司；L-抗壞血酸 天津市凱通化學試劑有限公司；三氯甲烷、硫酸 國藥集團；苯酚、正丁醇、無水乙醇、苯酚 上海廣諾化學科技有限公司；硫酸亞鐵 徐州天鵝化工有限公司；以上均為分析純。

KQ-500DE 型數控超聲機 昆山市超聲儀器有限公司；TU-1810 型紫外可見分光光度計 北京普析通用儀器有限責任公司；HSB-Ш型循環水式多用真空泵 上海振榮科學儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 銀柴胡多糖的提取工藝流程 銀柴胡藥材粉碎過40 目篩，經超臨界CO2萃取脫脂[16]（壓力35 MPa，萃取溫度為47 ℃，CO2流量控制在50 L/h，萃取3 h），脫脂后粉末加水超聲輔助提取（料液比1:20；超聲功率100 W），將提取液過濾濃縮，分級醇沉后凍干獲得銀柴胡多糖粗提物，后經Sevag 法除蛋白5 次獲得銀柴胡粗多糖，進一步通過柱層析分離純化獲得銀柴胡多糖。

1.2.2 多糖得率及含量計算

1.2.2.1 多糖粗提物得率的計算 將水提醇沉之粗提物后的多糖進行冷凍干燥，稱量其重量，根據公式（1）計算多糖粗提物得率[22]。

式中，M：冷凍干燥后的銀柴胡多糖粗提物質量（g），M0：銀柴胡粉末質量（g）。

1.2.2.2 換算因子的測定 參照文獻[22-23]，采用苯酚-硫酸法進行含量測定。以葡萄糖為標準品，在482 nm 處測定吸光度，得到回歸方程為Y=0.0646x-0.0803，R2=0.997。該方程在0.021～0.841 g/L 范圍內呈良好線性關系。參照文獻[17]，精密稱取經柱層析法純化得到的銀柴胡多糖，配制質量濃度為4 mg/mL的多糖溶液，再按上述回歸方程求出銀柴胡多糖中的葡萄糖濃度，并按照式（2）計算換算因子。

式中，W 為銀柴胡多糖質量（g），C 為葡萄糖濃度（mg/mL）；D 為稀釋倍數。

1.2.2.3 含量的測定 準確稱取多糖粉末，配制質量濃度為4 mg/mL 的多糖溶液，按1.2.2.2 中苯酚-硫酸法測得吸光度，根據公式（3）計算多糖含量：

式中，C 為樣品溶液多糖濃度（mg/mL）；D 為樣品溶液稀釋倍數；W 為樣品質量（g）；f 為換算因數（f=1.12）。

1.2.3 單因素實驗

1.2.3.1 提取溫度對銀柴胡多糖粗提物的影響 固定提取時間3 h，提取次數2 次，考察提取溫度（20、30、40、50、60 ℃）對銀柴胡多糖粗提物得率的影響。

1.2.3.2 提取時間對銀柴胡多糖粗提物的影響 固定提取溫度40 ℃，提取次數2 次，考察提取時間（1、2、3、4、5 h）對銀柴胡多糖粗提物得率的影響。

1.2.3.3 提取次數對銀柴胡多糖粗提物的影響 固定提取溫度40 ℃，提取時間3 h，考察提取次數（1、2、3、4、5 次）對銀柴胡多糖粗提物得率的影響。

1.2.4 Box-Behnken 試驗設計 以銀柴胡多糖粗提物得率（Y）為響應值，根據單因素實驗結果，設計3 因素3 水平的Box-Behnken 試驗，對銀柴胡多糖粗提物提取工藝進行優化，響應因素水平設計見表1。

表1 Box-Behnken 試驗因素與水平設計Table 1 Box-Behnken experimental factors and horizontal design

1.2.5 銀柴胡粗多糖抗氧化活性試驗

1.2.5.1 清除DPPH 自由基能力的測定 將不同濃度（1.0、2.0、4.0、8.0、10.0 mg/mL）的銀柴胡溶液與0.2 mmol/L DPPH-無水乙醇溶液按照體積比1:4 充分混勻，在室溫下避光反應30 min，于517 nm 波長處測定吸光度。無DPPH 的反應混合物作為對照，VC作為陽性對照[24-25]。按式（4）計算DPPH 自由基清除率。

式中：A0為無樣品的反應混合物溶液吸光度；A1為樣品與DPPH 溶液的吸光度；A2為無DPPH的反應混合物溶液吸光度。

1.2.5.2 清除OH 自由基能力的測定 取10 mL 刻度試管，加入1 mL 的FeSO4（6 mmol/L），1 mL 的水楊酸-乙醇溶液（6 mmol/L），1 mL 樣品銀柴胡粗多糖溶液，加入1 mL 的H2O2啟動反應，在37 ℃條件下保溫30 min，以超純水為參比，在510 nm 波長處測定吸光度[26]。清除率計算方法如下:

式中：Aa為空白對照的吸光度；Ax為加入銀柴胡粗多糖或L-抗壞血酸溶液后的吸光度；Ay為不加H2O2的樣品液吸光度。

1.2.5.3 清除ABTS+自由基能力的測定 0.384 g 的ABTS 以及0.066 g 過硫酸鉀在100 mL 蒸餾水中，室溫避光反應12 h，得到ABTS 母液。取出10 mL ABTS 母液用0.01 mol/L 磷酸緩沖液（pH7.4）調節至pH8.20，使溶液在734 nm 處的吸光度的范圍為0.70±0.02。將1 mL 不同濃度（1.0、2.0、4.0、8.0、10.0 mg/mL）銀柴胡粗多糖溶液與1 mL 蒸餾水和2 mL ABTS 供試液充分混勻后室溫避光10 min，在734 nm 處測定吸光度。未加入ABTS 的反應混合物作為對照，VC作為陽性對照[27]。按公式（6）計算ABTS+自由基清除率。

式中：A0為無樣品的反應混合物溶液吸光度；A1為樣品組吸光度；A2為無ABTS 的反應混合物溶液吸光度。

1.3 數據處理

所有試驗均重復3 次，數據結果用均值±標準差（SD 值）表示。使用Origin 2018 軟件繪制趨勢圖；使用SPSS 25.0 軟件進行方差分析及顯著性檢驗；Design-Expert 10.0.7 軟件對響應面試驗數據進行分析。

2 結果與分析

2.1 單因素實驗結果

2.1.1 提取溫度對銀柴胡多糖粗提物的影響 提取溫度對銀柴胡多糖粗提物的影響如圖1 所示，提取時間和次數不變，隨著提取溫度增加，多糖粗提物得率呈先上升后下降趨勢，在50 ℃時得率達到最大值，為27.89%，當提取溫度超過50 ℃后，得率逐漸降低。這與柴美靈等[28]研究發現甘草多糖得率隨提取溫度的變化趨勢相同。可能是因為隨著溫度的升高使分子運動加速了提取溶劑的滲入和植物細胞內多糖的釋放，當大部分多糖釋放到溶質中，由于溫度升高可以使部分水溶性的多糖分解，對溫度敏感的多糖結構遭到破壞[29]。所以導致60 ℃的多糖粗提物得率下降。因此超聲溫度以50 ℃為宜。

圖1 提取溫度對多糖粗提物得率的影響Fig.1 Effect of temperature on the yield of polysaccharide crude extract

2.1.2 提取時間對銀柴胡多糖粗提物的影響 提取時間對銀柴胡多糖粗提物的影響如圖2 所示，在提取溫度為40 ℃，提取次數2 次，隨著提取時間延長，得率急速升高，在3 h 時，多糖粗提物得率達到最高水平為27.51%，而繼續延長提取時間，得率呈下降趨勢。分析其原因可能是銀柴胡物料所含的多糖短時間內不能完全釋放，但隨著提取時間的延長，較多的多糖溶解并釋放到溶質中，使得得率提高，但隨時間的持續增加，會使部分多糖被分解，多糖結構破壞而降解，導致多糖得率下降[30]。因此，提取時間選擇3 h為宜。

圖2 提取時間對多糖粗提物得率的影響Fig.2 Effect of time on the yield of polysaccharide crude extract

2.1.3 提取次數對銀柴胡多糖粗提物的影響 提取次數對銀柴胡多糖粗提物的影響如圖3 所示，多糖粗提物得率隨提取次數的增多呈現先增加后降低的趨勢，當提取次數達到2 次時，得率達到最高值，為27.91%。其原因可能是前2 次提取時，大部分多糖已經釋放到溶質中，但是連續多次的提取使多糖的結構被破壞或者物料的水溶液變得黏稠，多糖溶出困難[31]。因此，選擇提取次數2 次，多糖粗提物得率最高。

圖3 提取次數對多糖粗提物得率的影響Fig.3 Effect of times on the yield of polysaccharide crude extract

通過單因素不同水平對多糖粗提物得率影響結果可見，提取溫度為50 ℃、提取時間為3 h、且提取次數為2 次為銀柴胡多糖提取的最佳基本條件。可以獲得最高得率。并以此作為 Box-Behnken 法優化設計的依據。

2.2 Box-Behnken 法優化銀柴胡多糖提取工藝

2.2.1 Box-Behnken 試驗設計與結果 試驗設計和結果如表2 所示。通過對數據進行線性擬合，得到銀柴胡多糖粗提物的二次多元回歸模型方程。

表2 Box-Behnken 優化試驗設計與結果Table 2 Box-Behnken optimization experimental design and results

對銀柴胡多糖粗提物回歸方程進行了方差分析，結果見表3。用F值和P值評價模型的顯著性。F值越大，P值越小，模型越顯著。如表3 所示，該模型的F值為27.47，P=0.0001，表明該模型具有極顯著意義。利用失擬項評價模型的擬合度。該模型失擬項為P=0.3108＞0.05，表示擬合程度較高，表明實驗值是準確可靠的，具有較高的可信度。由F值可知，三個因素對銀柴胡多糖粗提物的影響程度依次為：提取時間＞提取次數＞提取溫度，通過P值可知，B、BC、B2、C2都表現為差異極顯著水平（P＜0.01），A、C、AB 表現為差異顯著水平（P＜0.05）。

表3 回歸方程的方差分析Table 3 Analysis of variance of regression equation

2.2.2 各因素之間的交互作用分析 在單因素影響多糖粗提物得率的基礎上，進一步對3 個關鍵工藝參數超聲提取溫度、提取時間、提取次數的交互作用進行分析，結果見圖4 所示三維響應面曲面圖和等高線圖，曲面圖越陡峭，等高線圖越接近橢圓，說明交互作用越顯著[32]。如圖4（a）所示，提取時間和提取次數的三維響應面圖中曲面陡峭，而且二維圖中等高線也呈明顯的橢圓形，表明提取時間和提取次數的交互作用對多糖粗提物得率的影響極顯著；由圖4（b）可見，提取時間和提取溫度的三維響應面圖中曲面較陡峭，其中提取時間的影響比提取溫度影響大，而且在二維圖中等高線呈橢圓形，表明提取時間和提取溫度的交互作用對多糖粗提物得率具有顯著的影響；由圖4（c）可以看出，三維響應面圖中曲面較為平緩，而且二維等高線圖趨近圓形，說明提取溫度和提取次數交互作用對得率影響較小。與方差分析結果一致。通過3D 圖發現曲面呈中間凸起的形狀，說明曲線有最高點，也表明存在最優條件。

圖4 兩因素交互作用的三維響應面圖和等高線圖Fig.4 Three-dimensional response surface map and contour map of the interaction of two factors

2.2.3 Box-Behnken 優化工藝的驗證結果 根據所得模型，通過Design-Expert10.0.7 軟件對響應面進行分析，確定最佳提取條件為：提取溫度49.87 ℃，提取時間3.17 h，提取次數2.33 次。在此條件下，模型預測銀柴胡多糖粗提物得率為28.41%。考慮到實際應用過程中操作簡便，將工藝條件修正為提取時間3.20 h、提取次數2 次、提取溫度50 ℃，進一步按此工藝條件進行驗證。驗證結果表明，銀柴胡多糖粗提物平均得率為28.24%（SD 值=0.10%，n=3），與理論值相對誤差為0.17%，實際值與理論值基本相符，說明模型對銀柴胡多糖粗提物提取工藝參數的優化結果可靠，具有一定的實用價值。進一步通過柱層析分離純化后多糖含量為59.13%。

2.2.4 銀柴胡粗多糖抗氧化活性測定 銀柴胡粗多糖對DPPH 自由基清除率如圖5（a）所示，隨著銀柴胡粗多糖濃度增加，對DPPH 自由基的清除能力逐漸增強。當粗多糖濃度為10 mg/mL 時，其對DPPH自由基的清除率為87.68%，此時VC的清除率為96.59%。經計算，銀柴胡粗多糖清除DPPH 自由基的IC50為5.47 mg/mL。表明銀柴胡粗多糖具有一定的DPPH 自由基清除能力，但其效果弱于VC。

圖5 銀柴胡粗多糖抗氧化活性的測定結果Fig.5 Determination of antioxidant activity of polysaccharide from Stellariae Radix

銀柴胡粗多糖對OH 自由基清除率如圖5（b）所示，隨著銀柴胡粗多糖濃度增加，對OH 自由基的清除能力逐漸增強。當粗多糖濃度為10 mg/mL 時，其對OH 自由基的清除率為97.74%，此時VC的清除率為99.75%。經計算，銀柴胡粗多糖清除OH 自由基的IC50為2.40 mg/mL。表明銀柴胡粗多糖對OH 自由基有較好的清除能力。

銀柴胡粗多糖對ABTS+自由基清除率如圖5（c）所示，銀柴胡粗多糖對ABTS+自由基清除能力隨著多糖濃度的升高而增加。當質量濃度達到10 mg/mL時，對ABTS+自由基清除率為99.0%，此時VC的清除率為99.85%。經計算，銀柴胡粗多糖清除ABTS+自由基的IC50為1.44 mg/mL。表明銀柴胡粗多糖具有較好的ABTS+自由基清除能力。

3 結論

得到最佳提取條件為提取溫度50 ℃，時間3.20 h，次數2 次。在該條件下多糖的實際得率為28.24%±0.10%，多糖含量為59.13%。優化后的提取條件綜合反映了各因素之間的關系，更加具有可操作性，使銀柴胡多糖能夠充分釋放，有效避免了資源的浪費。體外抗氧化實驗表明，銀柴胡粗多糖對DPPH、OH、ABTS+自由基的IC50分別為5.47、2.40 和1.44 mg/mL，表明銀柴胡多糖具有一定的抗氧化能力。因此，銀柴胡的抗氧化不僅僅與黃酮類、甾醇類及脂質類成分密切相關，還與多糖類成分有關。

綜上所述，本研究通過優化提取工藝，得到高得率的銀柴胡多糖粗提物，粗提物經除蛋白之后所獲得的銀柴胡粗多糖具有一定的抗氧化活性。以期為銀柴胡多糖在功能性藥品或食品開發及傳統中藥藥效物質基礎的研究提供依據，也為銀柴胡藥材多元化開發利用和提高經濟與社會效益提供美好前景。