紫菜多糖硫酸化修飾及生物活性分析

李 瑤，熊欣琪，徐 暢，馮學珍，馮書珍,

（1.廣西科技大學醫學部，廣西柳州 545006；2.廣西科技大學理學院，廣西柳州 545006）

紫菜（Porphyra）是我國重要的藥食同源紅藻，紫菜中含有多糖、蛋白質、維生素等多種活性物質[1]。其中，紫菜多糖的結構與瓊膠類似，占紫菜干質量的20%～40%，含量豐富且易提取[2]，在抗氧化、降血糖等生物活性方面發揮著重要作用[3-5]。

天然多糖生物活性相對較弱，常采用化學修飾的方法改善其生物活性，其中，硫酸化修飾是多糖化學修飾中常用的修飾方法之一[6-7]。硫酸化修飾主要通過在多糖的糖基上引入硫酸基團，使多糖結構發生改變進而增加多糖的生物活性[8-9]。濃硫酸法[10]和氯磺酸-吡啶法[11]是多糖硫酸化修飾的主要方法。氯磺酸-吡啶法進行硫酸化修飾，具有取代度高、產物回收率高的優點，但腐蝕性極強，對人體危害巨大[12-13]；而濃硫酸法則具有產物雜質少，且易分離的優勢[14]。現有研究指征不同硫酸化修飾方法對多糖生物活性的影響不一，如：濃硫酸法進行硫酸化修飾能顯著提高老鴉瓣多糖對DPPH 自由基的清除能力，但對羥自由基的清除能力的影響較弱[15]；氯磺酸-吡啶法進行硫酸化修飾顯著增強了雞腿菇多糖對羥自由基的清除能力，但對超氧陰離子自由基的清除作用較弱[16]。尚不明確與氯磺酸-吡啶法相比，濃硫酸法修飾紫菜多糖是否更適用于生物活性的提高。

以廣西北部灣紫菜為研究對象，采用濃硫酸法對紫菜多糖進行硫酸化修飾，通過單因素和正交試驗獲取最佳酯化條件，初步鑒定修飾前后的多糖結構，比較不同硫酸化修飾方法（氯磺酸-吡啶法和濃硫酸法）對紫菜多糖抗氧化活性和降血糖活性的影響，以期明確紫菜多糖的硫酸化修飾方法，進一步提高其原有生物活性，為紫菜多糖的進一步開發與利用提供參考依據和數據支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

紫菜 采自廣西北部灣海域（20°54'10″～21°40'30″ N，109°05'20″～109°11'35″ E），經大連海洋大學邢坤副教授鑒定為紅藻門紫菜屬；阿卡波糖（99%）、4-硝基苯-α-D-葡萄糖苷（98%）、α-葡萄糖苷酶（10 U/mg）Sigma 公司；中性蛋白酶（50 U/mg）北京索萊寶科技有限公司；其余試劑均為國產分析純。

DFT-200 高速萬能粉碎機 溫嶺市林大機械有限公司；AL104 高密度電子天平 梅特力-托利多儀器公司；LGJ-50C 冷凍干燥機 上海精宏實驗設備有限公司；DH-9077A 電熱恒溫干燥箱 上海精宏實驗設備有限公司；TDL-5000bR 臺式離心機 上海安亭科學儀器廠；KW-1000DC 水浴鍋 州蒙特儀器制造公司；UV-2600 紫外分光光度計 株式會社島津制作所；DF-101S 恒溫加熱磁力攪拌器 鞏義市予華儀器有限責任公司；MultiskanGO 全波長掃描酶標儀 賽默飛世爾科技有限公司；Nicolet6700 傅里葉紅外光譜儀 上海萊睿科學儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 紫菜多糖的提取 參照馮學珍等[17]的方法，略作修改。取新鮮采集的紫菜反復清洗，自然風干后粉碎、過篩于干燥器中備用。準確稱取粉末5.00 g，95%無水乙醇浸泡過夜，冷凍干燥，加適量蒸餾水調節溶液pH 至7.0，600 W 微波輔助提取90 s，離心，濃縮，醇沉，靜置過夜，沉淀干燥得紫菜粗多糖。將紫菜粗多糖與中性蛋白酶按1:0.5 于50 ℃水浴反應2 h，后沸水滅活5 min，重復多次，直至測定280 nm處無吸收峰，說明蛋白質已除。將酶解液離心，減壓濃縮，干燥得紫菜多糖（Porphyrapolysaccharide，PP）。

1.2.2 濃硫酸法制備硫酸化紫菜多糖的工藝優化

1.2.2.1 濃硫酸法 稱取0.10 g 紫菜多糖與濃硫酸按照一定料液比混合后置于帶有干燥管和攪拌裝置的三頸燒瓶中，加入2.5 mL 正丁醇，通過溫和攪拌的方法，冰浴冷卻至0 ℃，加入一定量的硫酸銨，反應一定時間。反應結束后調節溶液pH 至7.0，透析，離心，上清液減壓濃縮，冷凍干燥即得硫酸化紫菜多糖（SulfatedPorphyrapolysaccharide，SPP）。

1.2.2.2 單因素實驗方法 準確量取2.5 mL 正丁醇，在料液比1:80 g/mL、紫菜多糖與硫酸銨質量比10:6 g/g、反應時間25 min 條件下，研究料液比（1:70、1:80、1:90、1:100、1:110 g/mL）、紫菜多糖與硫酸銨質量比（10:4、10:6、10:8、10:10、10:12 g/g）、反應時間（15、20、25、30、35 min）對硫酸化紫菜多糖取代度的影響。

1.2.2.3 正交試驗設計 在單因素實驗設計的條件下，選取料液比（A）、紫菜多糖與硫酸銨質量比（B）和反應時間（C）作為正交試驗因素，每個因素選擇3 個水平，以SPP 取代度為指標，采用L9（34）正交試驗進行工藝優化。具體的正交試驗設計因素及水平見表1。

表1 硫酸化紫菜多糖的正交試驗設計因素及水平Table 1 Levels and factors of orthogonal experiments of SPP

1.2.3 氯磺酸-吡啶法制備硫酸化紫菜多糖 參照CHEN 等[18]的方法，略作修改。準確稱取0.1 g 紫菜多糖懸浮于10.0 mL 的N,N-二甲基甲酰胺中，攪拌20 min 后，加入裝有酯化試劑（V 氯磺酸:V 吡啶=1:3）的三頸瓶中，75 ℃水浴條件下反應1.5 h。反應完成后，加入適量冰水，以2.5 mol/L 的NaOH 調節溶液pH 至中性。加入三倍體積的無水乙醇于4 ℃冰箱中過夜，離心、透析、濃縮、冷凍干燥即得硫酸化紫菜多糖（SPP1）。

1.2.4 取代度測定

1.2.4.1 硫酸根含量測定 標準曲線的繪制采用氯化鋇-明膠法[19]。稱取干燥至恒重的硫酸鉀粉末217.50 mg，以1.0 mol/L 的鹽酸定容至50.0 mL 容量瓶，得硫酸根標準溶液。準確吸取不同體積的硫酸鉀標準溶液（0.08、0.16、0.24、0.32、0.40 mL），加入1.0 mol/L 的鹽酸補足至0.4 mL，加入7.6 mL 3%三氯乙酸和2.0 mL 0.2%的氯化鋇-明膠溶液，充分搖勻，靜置15 min 后，在360 nm 處測定吸光度A1，以2.0 mL 0.5%的明膠溶液代替氯化鋇-明膠溶液，重復上述操作，在360 nm 處測定吸光度A2。以硫酸根的濃度為橫坐標，A1-A2為縱坐標繪制標準曲線。

1.2.4.2 取代度的測定 取硫酸化紫菜多糖2.00 mg，溶于1.0 mol/L 鹽酸中，充分振搖，待完全溶解后置沸水浴中反應1 h，吸取0.2 mL 反應液進行樣品分析，按照1.2.4.1 測定吸光值，根據標準曲線計算硫酸根的百分含量后按式（1）計算取代度DS（Degree of substitution，DS）：

式中：DS 為樣品取代度，S 為硫酸根的百分含量（%）。

1.2.5 紅外光譜分析 分別稱取2.00 g 硫酸化修飾前后的紫菜多糖樣品，溴化鉀壓片，在4000～500 cm-1的波數范圍內經傅里葉變換紅外光譜儀測定。

1.2.6 生物活性分析

1.2.6.1 抗氧化活性分析 分別配制不同質量濃度修飾前后的紫菜多糖溶液，以相同質量濃度的維生素C 作為陽性對照，參考馮書珍等[20]的方法，測定其對DPPH、O2-和OH 自由基的清除能力并計算IC50值。紫菜多糖對DPPH、O2-和OH 自由基的清除率按式（2）計算。

式中：A樣品是樣品組的吸光度值，A對照是對照組的吸光度值，A空白是空白組的吸光度值。

1.2.6.2 降血糖活性分析 以阿卡波糖為陽性對照，參考馮學珍等[21]的方法，測定不同質量濃度下硫酸化前后的紫菜多糖對α-葡萄糖苷酶的抑制作用并計算IC50值。紫菜多糖對α-葡萄糖苷酶的抑制率按式（3）計算。

式中：A藥物反應是藥物反應組的吸光度值，A藥物對照是藥物對照組的吸光度值，A空白反應是空白反應組的吸光度值，A空白對照是空白對照組的吸光度值。

1.3 數據處理

采用Microsoft Excel 2021、SPSS（SPSS 22.0 Windows，SPSS Inc，Chicago，USA）、Origin 2022、正交設計助手II（V 3.1）和Graphpad Prism 9 對數據進行統計分析與作圖。硫酸化前后的紫菜多糖的抗氧化活性和降血糖活性進行單因素方差分析（Oneway ANOVA，置信水平95%），多重比較用S-N-K法，結果以的形式表示。

2 結果與分析

2.1 單因素實驗結果

2.1.1 料液比對取代度的影響 隨著料液比的增大，SPP 的取代度呈現先升高后降低的趨勢（圖1）。在料液比為1:80 g/mL 時，取代度達到最大值2.07±0.01，當料液比大于1:80 g/mL 后，取代度呈現逐漸顯著下降的趨勢（P＜0.05），分析原因可能是由于過高的濃硫酸含量會破壞多糖結構[22]，導致取代度降低。因此，將料液比確定在1:75～1:85 g/mL 范圍內最合適。

圖1 料液比對取代度的影響Fig.1 Effect of the ratio of solid to liquid on the DS

2.1.2 紫菜多糖與硫酸銨質量比對取代度的影響隨著紫菜多糖與硫酸銨質量比的增加，其取代度呈現先顯著增大后顯著減小趨勢（P＜0.05，圖2），在10:10 g/g 時達到最大，為2.81±0.02，說明此時硫酸化反應完全，取代度最高；當紫菜多糖與硫酸銨質量比大于10:10 g/g 時，多糖溶液中硫酸銨含量過高，酸性太強，容易造成多糖降解，且易造成板結現象，硫酸化反應不充分，導致取代度降低[23]。因此，紫菜多糖與硫酸銨質量比選擇10:8～10:12 g/g 范圍內最合適。

圖2 紫菜多糖與硫酸銨質量比對取代度的影響Fig.2 Effect of the mass ratio of Porphyra polysaccharide to ammonium sulfate on the DS

2.1.3 反應時間對取代度的影響 由圖3 可知，在15～30 min 內，SPP 的取代度隨反應時間的延長逐漸增大，在反應時間為30 min 時，SPP 的取代度最高，為2.850±0.001，當反應時間大于30 min 時（35 min），取代度顯著下降（P＜0.05）。推測原因可能是在30 min內，利于酯化劑的擴散，進而促進酯化劑與多糖分子結合，取代度升高；隨著時間進一步增加，反應體系中硫酸濃度過高，導致糖苷鍵斷裂，取代度降低[24]。因此，反應時間確定為25～35 min 合適。

圖3 反應時間對取代度的影響Fig.3 Effect of reaction time on the DS

2.2 紫菜多糖硫酸化最佳工藝條件的確定

2.2.1 正交試驗結果 影響硫酸化紫菜多糖取代度的因素依次為A＞C＞B，即料液比＞反應時間＞紫菜多糖與硫酸銨質量比（表2）。方差分析結果（表3）表明，料液比顯著影響硫酸化紫菜多糖的取代度（P＜0.05），反應時間、紫菜多糖與硫酸銨質量比對取代度無顯著影響（P＞0.05）。硫酸化修飾紫菜多糖SPP 的最優條件組合為A2C3B1，結合單因素實驗結果，最終確 定SPP 的最佳工藝為：料液比1:80 g/mL、反應時間為33 min、紫菜多糖與硫酸銨質量比為10:9 g/g，最高取代度為2.94，高于楊燕敏等[25]對紅棗多糖硫酸化修飾的研究。

表2 硫酸化紫菜多糖的正交試驗結果Table 2 Orthogonal experimental results of SPP

表3 方差分析結果Table 3 Variance analysis results

2.2.2 驗證實驗 稱取1.00 g 紫菜多糖，在最佳硫酸化工藝條件下（料液比1:80 g/mL、反應時間33 min、紫菜多糖與硫酸銨質量比10:9 g/g）進行實驗，計算硫酸化紫菜多糖的取代度。結果表明，硫酸化紫菜多糖的平均取代度為2.94，與正交試驗結果一致。

2.3 紅外光譜分析

如圖4 所示，SPP 和PP 均在3500～3300、3000～2800、2000～1500、1400～700 cm-1范圍內顯示出多糖的特征吸收峰[26-28]。與PP 相比，SPP 在1100～1250 和800～850 cm-1范圍內出現吸收峰，均提示存在硫酸基團[29-30]，即在1123.29 cm-1出現的吸收峰，對應S=O 的不對稱伸縮振動；在801.47 cm-1出現的吸收峰，可能與半乳糖C-6 上C-O-S 的對稱伸縮振動有關，說明硫酸基團在C-6 上發生了較大的取代[31]。結果表明采用濃硫酸法對紫菜多糖進行硫酸化修飾是成功的。紫菜多糖經硫酸化修飾后其主體結構基本未被破壞，但由于受硫酸基團的影響，多糖的透光率也發生變化，其它特征吸收峰相比原始位置發生了偏移[32]。

圖4 硫酸化修飾前后的紫菜多糖紅外譜圖Fig.4 FT-IR of Porphyra polysaccharide before and after sulfate modification

2.4 硫酸化修飾前后的生物活性分析

2.4.1 抗氧化活性分析 SPP、SPP1 和PP 對DPPH、超氧陰離子、羥自由基的清除作用均隨著濃度的增大而增大（圖5）。與XU 等[33]的研究不同，在0～5 mg/mL 濃度范圍內，SPP、SPP1 對DPPH、超氧陰離子、羥自由基三種自由基清除率的IC50均顯著低于PP（P＜0.05，表4），說明硫酸化修飾后的紫菜多糖抗氧化活性顯著高于修飾前，這可能是由于硫酸基團的加入對自由基的清除能力存在促進作用，進而增強紫菜多糖的抗氧化活性[32]。濃硫酸法修飾后的紫菜多糖，其對三種自由基的清除率均顯著高于氯磺酸-吡啶法（P＜0.05），說明濃硫酸法更適用于促進紫菜多糖的抗氧化活性。

圖5 硫酸化修飾前后紫菜多糖的抗氧化活性Fig.5 Antioxidant activity of Porphyra polysaccharide before and after sulfate modification

表4 硫酸化修飾前后紫菜多糖生物活性的半抑制濃度（IC50）Table 4 IC50 of Porphyra polysaccharide before and after sulfate modification

2.4.2 降血糖活性分析 SPP、SPP1 和PP 均對α-葡萄糖苷酶具有一定的抑制作用，且隨著濃度的增加，抑制作用逐漸增強（圖6）。當濃度達到20 mg/mL時，SPP、SPP1 和PP 對α-葡萄糖苷酶的抑制率最高，分別為24.27%、23.17%、11.89%；在0～20 mg/mL濃度范圍內，SPP、SPP1 對α-葡萄糖苷酶抑制作用的IC50值顯著低于PP（P＜0.05，表4），分別為13.56±0.35、16.24±1.47、26.18±4.66 mg/mL，說明硫酸化修飾可以顯著增強紫菜多糖的降血糖活性，與XIAO等[34]的研究一致，這可能是由于硫酸基團的加入，增強了多糖對α-葡萄糖苷酶的抑制作用，導致葡萄糖從活性位點的擴散變慢，延緩了葡萄糖的吸收速度[35-36]。其中，SPP1 的降血糖活性的IC50顯著高于SPP（P＜0.05），說明與氯磺酸-吡啶法相比，濃硫酸法修飾能顯著提高紫菜多糖的降血糖活性。

圖6 硫酸化修飾前后紫菜多糖的降血糖活性Fig.6 Hypoglycemic activity of Porphyra polysaccharide before and after sulfate modification

3 結論

采用濃硫酸法對廣西北部灣紫菜多糖進行硫酸化修飾，影響取代度的關鍵因素為：料液比＞反應時間＞紫菜多糖與硫酸銨質量比。確定最佳工藝優化條件為：料液比1:80 g/mL，反應時間33 min，紫菜多糖與硫酸銨質量比10:9 g/g，最高取代度為2.94。紅外光譜表明，紫菜多糖經硫酸化修飾后出現硫酸基團特征吸收峰，其硫酸基團的可能取代位置為C-6。

硫酸化修飾后的紫菜多糖，其對DPPH、超氧陰離子、羥自由基的清除作用及α-葡萄糖苷酶的抑制作用，均顯著高于硫酸化前（P＜0.05），說明應用硫酸化修飾提高紫菜多糖生物活性是可行的。同時，濃硫酸法對紫菜多糖抗氧化活性、降血糖活性的促進作用顯著高于氯磺酸-吡啶法（P＜0.05），約高1.59%～12.28%，說明應用硫酸化修飾促進紫菜多糖生物活性時，可優先考慮濃硫酸法。

本文基于前期研究結果，側重解析了硫酸化修飾對廣西北部灣紫菜多糖原有生物活性如抗氧化活性、降血糖活性的促進作用，濃硫酸法是否同樣適用于顯著增加食源性海藻多糖新的生物活性，如抗凝血活性、降血脂活性等，值得進一步研究。