干酪乳桿菌LK-1 的發酵特性及其在菠蘿果汁中的應用

楊 蓮，彭芍丹 ，馬俊杰3，章程輝，吳 廣4，黃曉兵，李積華，廖良坤

（1.海南大學食品科學與工程學院，海南海口 570228；2.中國熱帶農業科學院農產品加工研究所，農業農村部熱帶作物產品加工重點實驗室，海南省果蔬貯藏與加工重點實驗室，廣東湛江 524001；3.云南農業大學熱帶作物學院，云南普洱 665000；4.華中農業大學食品科學技術學院，湖北武漢 430070）

益生菌是指攝入一定數量后可對宿主產生有益作用的活性微生物，其已被普遍公認為有助于調節腸道菌群和維持腸道健康[1-2]。目前益生菌在乳制品、果蔬發酵及肉類發酵等方面均有較多的應用和研究。采用果蔬汁制備益生菌發酵產品，不僅為益生菌的生長繁殖提供所需的基本物質，還可通過發酵提高果蔬汁的品質，滿足不同人群對營養健康的需求[3-4]。干酪乳桿菌是研究和應用較多的益生菌之一，其因益生特性而聞名，常用于食品發酵或輔助發酵以改善食品特性[5-6]。研究證實，采用干酪乳桿菌發酵果蔬汁可產生多種有益作用，如提高果蔬抗氧化能力和活性成分[7]、延長果蔬貯藏期[8]、增強果蔬生理功效以及改善果蔬風味等[9-10]，可有效改善和提高產品品質。

菠蘿（Ananas comosus（L.）Merrill），又名鳳梨，是我國主要的熱帶水果之一，其富含維生素C、碳水化合物、有機酸、酚類物質以及蛋白酶等營養和活性成分，具有促進脂肪代謝、抗炎、增強免疫力等多種生理功效[11-12]。目前，我國菠蘿以鮮售為主，其加工產品多為罐頭、果干、果醬等，產品形式單一，附加值低，高值功能性產品較缺乏，有必要進一步豐富菠蘿產品品類，拓寬菠蘿產業鏈條。菠蘿果汁營養豐富，可為微生物生長繁殖及代謝提供所需營養物質，適合開發發酵果汁飲品。目前已有研究人員采用植物乳桿菌、嗜酸乳桿菌以及酵母菌等作為發酵劑制備益生菌發酵菠蘿果汁。李伊娜等[13]研究發現，干酪乳桿菌或植物乳桿菌單獨發酵可獲得品質較好的發酵菠蘿漿。NGUYEN 等[14]采用嗜酸乳桿菌，植物乳桿菌以及乳酸雙歧桿菌等乳酸菌發酵菠蘿果汁，并獲得品質較好的益生菌飲品。趙治巧等[15]采用酵母菌和植物乳桿菌發酵菠蘿果實后獲得營養豐富的菠蘿酵素。就目前研究來看，已有較多的益生菌被應用于菠蘿果汁發酵，但利用干酪乳桿菌發酵菠蘿果汁的研究較少，尤其是系統性地探究干酪乳桿菌在菠蘿果汁中的發酵條件。發酵條件對獲得高活菌數和高品質的益生菌發酵飲品至關重要。

干酪乳桿菌LK-1（Lactobacillus caseiLK-1，L.caseiLK-1）是實驗室前期從傳統發酵泡菜中篩選出的優質菌株，其在火龍果果汁發酵中展現了優質的發酵性能[16]。為進一步探究L.caseiLK-1 在其他果蔬汁中的發酵能力，對L.caseiLK-1 的生長曲線、產酸、耐酸和耐糖等特性進行研究分析，并將其應用于菠蘿果汁的發酵。通過單因素實驗和響應面法確定L.caseiLK-1 在菠蘿果汁中發酵的最佳工藝，并對在最佳工藝下獲得的發酵菠蘿果汁飲品進行感官評價，為L.caseiLK-1 在發酵食品中的進一步應用提供理論基礎和技術支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

干酪乳桿菌LK-1（Lactobacilus caseiLK-1）從傳統發酵泡菜中篩選分離得到，保藏于中國熱帶農業科學院農產品加工研究所實驗室[16]；佳果源100%NFC 菠蘿果汁 市購，其基本營養信息可見表1；MRS 肉湯培養基 廣東環凱微生物科技有限公司；0.1 mol/L 氫氧化鈉標準滴定溶液 山東惠普分化學科技有限公司；NaCl、葡萄糖 西隴科學股份有限公司；食用純堿 湖南海聯三一小蘇打有限公司。

表1 NFC 菠蘿果汁基本營養成分Table 1 NFC pineapple juice essential nutrients

M8 型紫外分光光度計 上海美譜達儀器有限公司；HJ-CJ-2D 型雙人凈化工作臺 上海蘇凈實業有限公司；PHS-3C pH 計 上海儀電科學儀器股份有限公司；HG-50 全自動高壓蒸汽滅菌鍋 日本hirayama 公司；LRH-250A 生化培養箱 廣東泰宏君科學儀器股份有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1L.caseiLK-1 的生長特性

1.2.1.1L.caseiLK-1 生長曲線測定 將甘油保藏的L.caseiLK-1 按1%（v/v）接種量接入MRS 肉湯培養基中，在37 ℃培養箱中靜置培養24 h，在培養0～4 h 期間每隔1 h 取樣，4～24 h 期間每隔2 h 取樣，采用紫外分光光度計在600 nm 波長處測定其吸光值OD600nm。

1.2.1.2L.caseiLK-1 在酸性和高糖環境下的生長及耐性測定 將甘油保存的L.caseiLK-1 按1%（v/v）接種量接入MRS 肉湯培養基，在37 ℃培養箱中靜置培養8 h 后獲得活化的發酵液，按5%（v/v）接種量分別接種于不同pH（3、4、5、6、7）和添加了不同質量分數葡萄糖（0%、10%、20%、30%、40%）的MRS 肉湯培養基，置于37 ℃下培養24 h，每隔2 h取樣測定OD600nm，并于第0、3、14、24 h 分別取樣測定活菌數，按式（1）計算樣品中菌株的存活率：

式中：N0表示第0 h 的活菌數，CFU/mL；Nt表示培養第t h 的活菌數，CFU/mL。

1.2.2L.caseiLK-1 產酸測定 將按1.2.1.2 活化的發酵液以5%（v/v）接種量接入MRS 肉湯培養基中，37 ℃靜置培養48 h，每隔6 h 取樣，測定其pH 和總酸含量。

1.2.3 菠蘿果汁發酵工藝優化

1.2.3.1 單因素實驗設計 以菠蘿果汁初始 pH、發酵溫度、接種量和發酵時間作為實驗因素，考察其對發酵菠蘿果汁中活菌數及總酸含量的影響。具體操作為：在接種量 1%、發酵溫度和時間為 37 ℃ 和 24 h的條件下，考察菠蘿果汁初始 pH（4.7、5.7、6.7、7.7）對發酵菠蘿果汁中活菌數和總酸含量的影響；在菠蘿果汁初始 pH 為 6.7、接種量 1%、發酵時間 24 h 條件下，考察發酵溫度（26、32、37、42 ℃）對發酵菠蘿果汁中活菌數和總酸的影響；在菠蘿果汁初始 pH為6.7、發酵溫度和時間為 37 ℃ 和 24 h 條件下，考察接種量（0.5%、1%、1.5%、2%、2.5%）對發酵菠蘿果汁中活菌數和總酸含量的影響；在初始 pH 為 6.7、發酵溫度 37 ℃和接種量 1% 的條件下，考察發酵時間（0、6、12、24、36、48 h）對發酵菠蘿果汁中活菌數和總酸含量的影響。實驗中使用食用純堿調節菠蘿果汁 pH，并將其置于 90 ℃ 下水浴 10 min 進行滅菌，待冷卻至室溫后再接菌。

1.2.3.2 響應面試驗設計 在單因素實驗確定的因素水平下，對各實驗因素進行響應面試驗，以總酸含量為響應值，利用Design-expert 8.0.6 軟件進行試驗設計（表2）。

表2 菠蘿果汁發酵工藝優化的試驗因素與水平Table 2 Factors and levels for the optimization of the pineapple juice fermentation process

1.2.4 感官評價 由10 個經過感官培訓的學生和老師（男:女=1:1）組成感官評價小組，對常溫下的NFC菠蘿果汁，發酵前菠蘿果汁（pH 調至6.8，并在90 ℃下水浴10 min），發酵后菠蘿果汁進行評分，去掉最高和最低分后取平均值作為最終評分結果[17]，感官評定標準見表3。

表3 感官評定標準Table 3 Sensory evaluation standards

1.2.5 指標測定 活菌數的測定參照GB 4789.35-2016《食品微生物學檢驗乳酸菌檢驗》[18]；總酸的測定參照GB/T 12456-2021《食品中總酸的測定》[19]，以乳酸計；pH 采用pH 計測定。

1.3 數據處理

每個實驗均重復3 次，實驗數據經Excel 2010初步分析整理后，采用Origin Pro 8.0 對數據進行分析和作圖；采用Design-Expert 8.0.6 軟件對響應面試驗設計結果進行分析和作圖。實驗數據采用單因素方差分析，P＜0.05 表示統計學差異顯著，P＞0.05 表示統計學差異不顯著。

2 結果與分析

2.1 L.casei LK-1 的生長特性

2.1.1 生長曲線 由圖1 可知，0～3 h 為L.caseiLK-1的延滯期，3～8 h 為對數生長期，8 h 后進入穩定期。L.caseiLK-1 僅需5 h 左右即可從對數生長期進入穩定期，表明菌株生長繁殖速度較快。快速的生長速度是工業化菌株的要求之一[20]，本研究菌株L.caseiLK-1 具備應用于工業生產的潛力。由于發酵8 h 處于L.caseiLK-1 的對數生長末期和穩定期初期，不僅具有高活菌數，而且菌株生長繁殖能力較強，因此選擇發酵8 h 作為該菌株的最佳接種時間。

圖1 L.casei LK-1 的生長曲線Fig.1 Growth curve of L.casei LK-1

2.1.2 在酸性環境下的生長及耐性 大多果疏汁偏酸性，且乳酸菌在生長繁殖過程中會產生大量的有機酸導致pH 的持續降低[21]，用于果蔬發酵的菌株需要在酸性環境下具備較好的生長繁殖能力和耐受性。同時，優良益生菌也需具備良好的酸耐受性，才能在胃腸道運輸期間保有足夠的活菌數[22]，確保有效地發揮其益生功效。L.caseiLK-1 在酸性條件下生長和耐受情況如圖2 和圖3 所示，隨pH 的上升，L.caseiLK-1 的生長繁殖能力逐漸增強。在pH5～7 環境下，L.caseiLK-1 能夠保持良好的生長繁殖，當pH≤4 時，菌株的生長繁殖被抑制甚至造成菌株的死亡，表明該菌株更適于弱酸性至中性環境下生長。與王帥靜等[20]從西藏牦牛糞和乳源分離篩選出的乳酸菌在酸性環境的生長狀況一致，均表現出低pH 環境下的弱生長能力，可能是由于低pH 環境引起菌株細胞膜的電荷變化，進而影響細胞膜對營養物質的吸收代謝以及酶活性[23]，導致菌株的生長繁殖受到抑制。在pH3 環境下能否存活是衡量菌株酸耐受性的標準之一[24]，相對于0 h（7.65±0.05 lg CFU/mL ），L.caseiLK-1 暴露在pH3 環境下3 h 時具有較高的活菌數，為7.53±0.02 lg CFU/mL，對應的存活率為76%，與徐小輕[25]研究的干酪乳桿菌NA-2 在pH2～4 條件下存活率相近，表明L.caseiLK-1 在短時間內具有較好的酸耐受性。干酪乳桿菌對酸性環境的耐受性，可能與其相關應激蛋白的大量表達有關[26]。

圖2 L.casei LK-1 在不同pH 條件下的生長曲線Fig.2 Growth curve of L.casei LK-1 in different pH conditions

圖3 L.casei LK-1 在不同pH 條件下的活菌數Fig.3 Viable cell counts of L.casei LK-1 in different pH conditions

2.1.3 在高糖環境下的生長及耐性 由圖4 和圖5 可知，隨葡萄糖質量分數的增大，OD600nm和活菌數逐漸降低，說明L.caseiLK-1 受到的抑制作用逐漸增強，對比焦媛媛等[27]研究也有一致的結果。在葡萄糖質量分數為10%環境下培養24 h 后活菌數可達8.72±0.02 lg CFU/mL，而對照組（0%）為8.79±0.05 lg CFU/mL，表明糖添加量在10%以下時，對L.caseiLK-1 的生長繁殖影響較小。當葡萄糖質量分數≥20%時，對菌株的生長繁殖抑制作用較強。當葡萄糖質量分數為40%時，相對于0 h（7.67±0.03 lg CFU/mL），培養3、14 和24 h 后可維持較高的活菌數，分別為7.52±0.03、7.44±0.01 和7.28±0.13 lg CFU/mL，對應的存活率分別為71%、59%、41%，表明L.caseiLK-1 可在高糖環境中長時間存活，展現了較強的耐糖能力。綜上結果，L.caseiLK-1 在一定的糖濃度下可保持較好的生長繁殖能力，并在高糖環境下具有良好的耐受性，具備用于較高糖果汁發酵的潛力。

圖4 L.casei LK-1 在不同質量分數葡萄糖條件下的生長曲線Fig.4 Growth curve of L.casei LK-1 under different mass fractions of glucose

圖5 L.casei LK-1 在不同質量分數葡萄糖條件下的活菌數Fig.5 Viable cell counts of L.casei LK-1 under different mass fractions of glucose

2.2 L.casei LK-1 的產酸特性

菌株的產酸能力是其作為發酵劑的重要指標[28-29]。由圖6 看出，在培養0～12 h 期間，pH 快速下降，總酸含量迅速增加，該時期對應于L.caseiLK-1 的對數生長期，菌株快速的繁殖加快了對基質中碳水化合物的利用和代謝，產生大量的有機酸，從而導致pH 的快速下降和總酸的迅速升高。在培養12 h后，pH 先緩慢降低后趨于穩定，總酸先緩慢增加后趨于穩定，pH 最低為4.28，總酸含量最高可達9.46±0.12 g/kg，相對于發酵前（總酸含量4.11±0.11 g/kg），總酸產量為5.35 g/kg。結果表明，L.caseiLK-1 的產酸速度較快，具備較好的產酸能力。

圖6 L.casei LK-1 在MRS 培養基中的產酸曲線Fig.6 Acid-producing curve of L.casei LK-1 in MRS medium

2.3 菠蘿果汁發酵工藝優化

2.3.1 菠蘿果汁初始pH 對活菌數和總酸的影響pH 會影響菌株在食品中的生長繁殖和代謝[30]。總酸含量是衡量發酵程度的重要指標，其高低可反映發酵菌株的產酸情況，且會直接影響產品的感官品質和保質期[31]。如圖7 所示，菠蘿果汁初始pH 在4.7～7.7范圍內，發酵后果汁的總酸含量變化不顯著（P＞0.05）。菠蘿果汁的初始pH 越大，其發酵前的總酸含量則越少，當發酵24 h 后，總酸含量無顯著性差異，表明隨著pH 的增大，L.caseiLK-1 的產酸量逐漸增加。同時，活菌數隨初始pH 的增大也逐漸增加。推測可能是pH 過低時，導致細胞膜生物功能發生改變和胞內酶活性降低，影響了菌株的代謝以及胞內外物質的進出，使得菌株的生長繁殖和產酸減緩。由圖7 可知，菠蘿果汁初始pH 為5.7～7.7 時，較適宜于發酵菌株的產酸和生長繁殖，故選取初始pH5.7、6.7、7.7 進行響應面試驗。

圖7 初始pH 對發酵菠蘿果汁中活菌數和總酸的影響Fig.7 Effect of the initial pH on viable cell count and total acid in fermented pineapple juice

2.3.2 發酵溫度對活菌數和總酸的影響 溫度會通過影響生物大分子的結構和功能以及酶的活性等來影響菌株的生長繁殖、代謝物產量以及產品的酸度和風味[32]。如圖8 所示，在發酵溫度為26～42 ℃范圍內，發酵菠蘿果汁中活菌數差異不顯著（P＞0.05），表明該溫度范圍均可適宜于L.caseiLK-1 的生長繁殖。在產酸方面，發酵溫度為37 ℃時，L.caseiLK-1具有最高的產酸量，菠蘿果汁中總酸含量由發酵前0.72 g/kg 增加至7.08 g/kg。當發酵溫度低于或高于37 ℃時，可能影響了菌株胞內酶的活性，導致代謝緩慢、產酸減少，因此發酵菠蘿果汁的總酸含量處在較低水平。由圖8 可知，發酵溫度為32～42 ℃時，發酵菠蘿果汁中活菌數和總酸含量較適宜，故選擇32、37 和42 ℃進行響應面試驗。

圖8 發酵溫度對發酵菠蘿果汁中活菌數和總酸的影響Fig.8 Effect of fermentation temperature on viable cell count and total acid in fermented pineapple juice

2.3.3 接種量對活菌數和總酸的影響 如圖9 所示，在接種量0.5%～2.5%的范圍內，發酵菠蘿果汁中活菌數變化不顯著（P＞0.05），但接種量從0.5%增加至1%時，其總酸含量由5.78±0.13 g/kg 顯著增加至6.95±0.21 g/kg（P＜0.05）；當接種量繼續升至2.5%時，發酵菠蘿果汁中總酸含量呈現下降趨勢，但不顯著（P＞0.05）。接種量過低時，菌株初始基數小，菌株的生長空間相對較大，發酵速率慢，導致同發酵時間內產酸量少，發酵不充分[33]，隨接種量的增加，菌株發酵速率增加，可在短時間內產生大量的乳酸，導致總酸含量增加。由圖9 可知，接種量為0.5%～1.5%時，發酵菠蘿果汁中活菌數和總酸含量較高，故選取0.5%、1%、1.5%接種量進行響應面試驗。

圖9 接種量對發酵菠蘿果汁中活菌數和總酸的影響Fig.9 Effect of inoculation amount on viable cell count and total acid in fermented pineapple juice

2.3.4 發酵時間對活菌數和總酸的影響 由圖10 可知，隨著發酵時間的增加，發酵菠蘿果汁中活菌數先增加，后趨于穩定，最后逐漸降低。相對于0 h，發酵6 h 后活菌數顯著增加（P＜0.05）；發酵12～24 h 期間活菌數無顯著變化（P＞0.05），但顯著高于發酵6 h 時活菌數（P＜0.05）；發酵24 h 后活菌數顯著下降（P＜0.05），在發酵36 h 和48 h 時，活菌數分別為8.90±0.03 lg CFU/mL 和8.79±0.04 lg CFU/mL。總酸含量在發酵前24 h 內迅速上升，但在發酵24 h 后無顯著變化（P＞0.05）。推測是由于發酵時間過短時，發酵菌株處于自身繁殖階段，代謝物質較少，隨著發酵時間延長，代謝物質乳酸等的積累，使產品總酸含量逐漸增加。由圖10 可知，發酵時間為24 h 時，發酵菠蘿果汁具有較高的活菌數和總酸含量，分別為9.03±0.02 lg CFU/mL 和6.83±0.17 g/kg，故選取發酵時間12、24 和36 h 進行響應面試驗。

圖10 發酵時間對發酵菠蘿果汁中活菌數和總酸的影響Fig.10 Effect of fermentation time on viable cell count and total acid in fermented pineapple juice

2.4 響應面優化試驗結果

運用Design-Expert 8.0.6 軟件對表4 中總酸含量進行擬合，得到回歸方程為：Y=6.99+0.056A+0.23B+0.22C+0.82D-0.06AB-0.12AC+0.15AD+0.075BC-0.30BD+0.11CD-0.17A2-0.860B2-0.52C2-0.82D2，對上述回歸方程進行方差分析，結果見表5。

表4 菠蘿果汁發酵工藝優化響應面試驗設計方案和結果Table 4 Design scheme and results of response surface experiment for optimization of pineapple juice fermentation process

表5 響應面試驗結果方差分析Table 5 Variance analysis of response surface methodology results

由表5 方差分析可知，所建模型P值＜0.0001、F值為27.98、R2＝0.97 以及失擬誤差（P=0.3121＞0.05）不顯著，表明該方程模型擬合度較好，可用來反映初始pH、發酵溫度、接種量和發酵時間對總酸含量的影響。結果表明，4 個因素中對發酵菠蘿果汁總酸含量影響大小為發酵時間＞發酵溫度＞接種量＞初始pH。其中，發酵時間、發酵溫度、接種量的一次項和二次項均對總酸含量有極顯著性影響（P＜0.01），而初始pH 的一次項和二次項均對總酸含量無顯著性影響（P＞0.05）；發酵時間和發酵溫度的交互項對發酵菠蘿果汁的總酸含量有影響顯著（P＜0.05），其余交互項不顯著（P＞0.05）。

各試驗因素以及兩兩交互作用對總酸含量影響的響應面曲線如圖11 所示。由響應曲面的陡峭程度來看，除發酵溫度與發酵時間的交互作用對發酵菠蘿果汁的總酸含量有著顯著性影響外，其余的各試驗因素交互作用均不明顯，與方差分析結果一致。

圖11 各因素交互作用對總酸含量影響的響應面圖Fig.11 Response surface of the interaction of various factors to the effect of total acid content

通過對模型方程及響應面的分析，確定最佳發酵工藝為初始pH6.82、發酵溫度37.32 ℃，接種量1.14%，發酵時間30.03 h，預測在此條件下總酸含量為7.24 g/kg。為了更好控制和實現生產條件，將優化的工藝條件調整為初始pH6.8、發酵溫度37 ℃、接種量1%、發酵時間30 h。在此發酵條件下，發酵后菠蘿果汁中總酸含量為7.16±0.26 g/kg，活菌數為8.99±0.04 lg CFU/mL，總酸含量與模型預測值較一致，驗證了模型的可靠性。

2.5 感官評價

對在優化工藝條件下獲得的發酵菠蘿果汁進行感官評價，結果見圖12。由圖可知，所選4 個評價指標中除組織指標外，發酵后菠蘿果汁的氣味、色澤和口感評分均高于發酵前菠蘿果汁，但在氣味上略低于NFC 菠蘿果汁，這主要與菠蘿果汁發酵前的處理有關。用于發酵的NFC 菠蘿果汁經過水浴滅菌（90 ℃，10 min）和pH 調節（pH6.8）后，色澤變暗，糖酸比失衡，菠蘿特征風味變淡，經過L.caseiLK-1 發酵后，發酵風味增加，風味層次更為豐富。此外，由于乳酸等有機酸成分的產生，使得發酵菠蘿果汁的酸度增加，相對于發酵前菠蘿果汁，發酵后菠蘿果汁酸甜更為適口，色澤透亮，口感評分與NFC 菠蘿果汁相近。發酵前后菠蘿果汁以及NFC 菠蘿果汁的感官評分分別為48.62、76.75、81.87 分，表明L.caseiLK-1發酵菠蘿果汁具有良好的感官品質。

圖12 不同處理菠蘿果汁感官評價Fig.12 Sensory evaluation of pineapple juice with different treatments

3 結論

干酪乳桿菌是生產和應用中重要的益生菌。本研究以L.caseiLK-1 為研究對象，通過耐酸、耐糖性實驗和產酸性能測定探究該菌株的耐酸、耐糖、產酸等特性。L.caseiLK-1 在pH5～7 和0%～10%質量分數葡萄糖環境下，具備良好的生長繁殖能力；在酸性（pH3）和高糖（40%質量分數葡萄糖）環境中培養3 h，其存活率分別為76%和71%；在MRS 培養基中培養48 h，產酸量為5.35 g/kg，產酸能力良好。結果表明，L.caseiLK-1 在一定的酸性和糖濃度環境下，具有較好的生長繁殖能力，且具備較好的耐酸、耐糖能力和產酸性能，適用于弱酸或較高糖果汁發酵。

將L.caseiLK-1 應用于菠蘿果汁的發酵，建立干酪乳桿菌發酵菠蘿果汁的發酵工藝。以活菌數和總酸含量為指標，對菠蘿果汁初始pH、發酵溫度、接種量和發酵時間進行單因素實驗，以確定實驗因素水平；并以總酸含量為指標，進行響應面試驗。根據響應面試驗結果，獲得最優發酵條件為：菠蘿果汁初始pH6.8、發酵溫度37 ℃、菌種接種量1%、發酵時間30 h，此時發酵菠蘿果汁中總酸含量為7.16±0.26 g/kg，活菌數為8.99±0.04 lg CFU/mL。此條件下發酵的菠蘿果汁飲品色澤鮮亮，酸甜適口，風味較好，具有良好的感官品質，可為干酪乳桿菌在果蔬汁的進一步生產應用提供依據。