PB 試驗(yàn)結(jié)合BBD 響應(yīng)面法優(yōu)化納豆γ-聚谷氨酸發(fā)酵條件

嚴(yán)德林，黃 雷，邱 婧，陳世浪，梅芷晴，張凱旋，楊存義，高向陽(yáng),

（1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院廣東省功能食品活性物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東廣州 510642；2.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)廣州都柏林國(guó)際生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，廣東廣州 510642；3.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院廣東省分子育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東廣州 510642）

納豆由大豆蒸煮后接種納豆芽孢桿菌（Bacillus subtilisnatto）發(fā)酵而成，起源于日本，日本人食用納豆的歷史已長(zhǎng)達(dá)兩千多年[1-3]。納豆含有豐富的功能物質(zhì)，如納豆激酶、維生素K2等，具有預(yù)防心血管疾病、預(yù)防骨質(zhì)疏松、降血糖、降低血壓和抗氧化等保健功能[4-9]。目前，對(duì)納豆的功能物質(zhì)研究主要集中在納豆激酶和維生素K2，對(duì)其他功能物質(zhì)報(bào)道較少。γ-聚谷氨酸（poly-γ-glutamic acid，γ-PGA）是納豆發(fā)酵過程產(chǎn)生的一種重要的活性物質(zhì)，具有抗肥胖、促進(jìn)鈣吸收等功能[10-12]。γ-PGA 也是納豆黏液的主要成分[13-14]。優(yōu)質(zhì)的納豆黏液呈白色，味道清淡或微酸，質(zhì)地柔軟粘稠，拉絲長(zhǎng)，這也是評(píng)判優(yōu)質(zhì)納豆的重要標(biāo)準(zhǔn)[15-17]。

γ-PGA 是由D/L 谷氨酸單體或兩個(gè)對(duì)映體通過α-氨基和γ-羧酸基之間的酰胺鍵連接在一起的陰離子多肽，其聚合度在1000～15000 之間，分子量越高，黏度越高[18-19]。γ-PGA 具有良好的水溶性，并且能完全被生物降解，對(duì)人體和環(huán)境無毒害無污染，在食品、農(nóng)業(yè)、化妝品和醫(yī)藥等方面具有廣泛的應(yīng)用[20-24]。合成γ-PGA 的方法主要有化學(xué)合成、肽合成、生物轉(zhuǎn)化和微生物發(fā)酵[25]。微生物發(fā)酵法生產(chǎn)γ-PGA 具有效率高、環(huán)境污染小、反應(yīng)條件溫和等優(yōu)點(diǎn)[26]。

目前，微生物發(fā)酵產(chǎn)γ-PGA 多數(shù)采用液態(tài)發(fā)酵，缺乏對(duì)納豆食品發(fā)酵產(chǎn)γ-PGA 條件優(yōu)化的相關(guān)研究。本實(shí)驗(yàn)采用納豆芽孢桿菌發(fā)酵納豆，利用Plackett-Burman 試驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)合Box-Behnken 響應(yīng)面法，以γ-PGA 產(chǎn)生量和納豆感官品質(zhì)的加權(quán)綜合評(píng)分為指標(biāo)，對(duì)納豆發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化。確定了納豆γ-PGA 的最佳發(fā)酵條件，推動(dòng)了高產(chǎn)γ-PGA 納豆的市場(chǎng)發(fā)展。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

納豆芽孢桿菌（Bacillus subtilisnatto）本實(shí)驗(yàn)室保藏；巴西10 號(hào)、巴西13 號(hào)、華夏3 號(hào)、粵小黃1 號(hào)、粵小黃2 號(hào)、粵小黃3 號(hào)6 種品種大豆 華南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院大豆分子設(shè)計(jì)育種實(shí)驗(yàn)室提供；氯化鈉 天津市大茂化學(xué)試劑廠；牛肉膏 廣州環(huán)凱微生物科技有限公司；蛋白胨、瓊脂粉 北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；γ-聚谷氨酸標(biāo)準(zhǔn)品 南京賽泰斯生物科技有限公司；十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）上海麥克林生化科技有限公司；氫氧化鈉天津福晨化學(xué)試劑有限公司；鹽酸 廣州化學(xué)試劑廠；無水乙醇 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

HZS-H 水浴振蕩器 哈爾濱東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司；HYL-C3 組合式搖床 山東博科科學(xué)儀器有限公司；SW-CJ-2F 潔凈工作臺(tái) 蘇靜集團(tuán)蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；YX-24HDD 手提式壓力蒸汽滅菌器 江陰濱江醫(yī)療設(shè)備有限公司；HC-3018 高速離心機(jī) 安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司；UV-1750 紫外可見分光光度計(jì) 日本島津公司；BCD-215YD 冰箱 青島海爾股份有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 培養(yǎng)基的配制 斜面培養(yǎng)基：牛肉膏0.5%，蛋白胨1%，氯化鈉0.9%，瓊脂1.5%，pH7.2；種子培養(yǎng)基：牛肉膏0.5%，蛋白胨1%，氯化鈉0.9%，pH7.2。上述所有培養(yǎng)基于121 ℃下滅菌30 min 后冷卻待用。

1.2.2 納豆芽孢桿菌的活化和培養(yǎng) 將納豆芽孢桿菌接種于LB 斜面固體培養(yǎng)基上，37 ℃活化24 h，活化2 次。將平板上的納豆芽孢桿菌接種到液體培養(yǎng)基中，在37 ℃恒溫水浴中180 r/min 搖瓶培養(yǎng)24 h，隨后5000 r/min 離心10 min，再加入無菌水，形成1×107CFU/mL 的菌懸液，作為種子液保存。

1.2.3 納豆發(fā)酵產(chǎn)γ-PGA 的工藝流程

1.2.3.1 納豆發(fā)酵 對(duì)大豆進(jìn)行挑選、清洗，隨后用干凈自來水常溫浸泡18 h。將浸泡好的大豆瀝干，于常壓、121 ℃下蒸煮30 min，自然冷卻至37 ℃左右進(jìn)行接種（接種后需要攪拌均勻大豆和種子液），發(fā)酵。發(fā)酵完成后放于4 ℃冰箱下進(jìn)行后熟24 h[27-28]。

1.2.3.2γ-PGA 的初步純化 稱取1 g 納豆于離心管中，加入10 mL 蒸餾水，8000 r/min 離心15 min，除去菌體，取上清液，加入3 倍體積的無水乙醇，在4 ℃下靜置過夜后，8000 r/min 離心15 min，取沉淀，加入與上清液體積相等的蒸餾水溶解，隨后稀釋20 倍后進(jìn)行測(cè)定。

1.2.4 單因素實(shí)驗(yàn) 通過不同品種大豆發(fā)酵納豆，根據(jù)發(fā)酵結(jié)果取最優(yōu)大豆進(jìn)行后續(xù)發(fā)酵工藝實(shí)驗(yàn)。在大豆浸泡pH7.0、接種量4%、裝瓶量15%、發(fā)酵溫度37 ℃和發(fā)酵時(shí)間24 h 的固定條件下，分別考察大豆浸泡pH（6.6、6.8、7.0、7.2、7.4）、接種量（1%、2%、4%、6%、8%）、裝瓶量（5%、10%、15%、20%、25%）、發(fā)酵溫度（33、35、37、39、41 ℃）和發(fā)酵時(shí)間（18、21、24、27、30 h）對(duì)納豆發(fā)酵工藝的影響。每個(gè)因素進(jìn)行3 次平行實(shí)驗(yàn)，記錄平均值。

1.2.5 Plackett-Burman 試驗(yàn)設(shè)計(jì) Plackett-Burma（PB）是一種2 水平的試驗(yàn)方法，可以用較少的實(shí)驗(yàn)從眾多影響因素中快速篩選出顯著影響因素[29]。根據(jù)前期單因素預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，對(duì)大豆浸泡pH、接種量、裝瓶量、發(fā)酵溫度、發(fā)酵時(shí)間5 個(gè)因素進(jìn)行考察。每個(gè)因素選取高（1）和低（-1）兩個(gè)水平，設(shè)置3 個(gè)虛擬列。設(shè)計(jì)N=12 的PB 試驗(yàn)（表1）。

表1 Plackett-Burman 試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素水平Table 1 Plackett-Burman experimental design factor level

1.2.6 最陡爬坡試驗(yàn) 響應(yīng)面擬合方程只有在接近最優(yōu)值（綜合得分最高）的區(qū)域才能完全模擬真實(shí)情況。因此，需要通過最陡爬坡試驗(yàn)逼近最優(yōu)值區(qū)域，進(jìn)行有效的響應(yīng)面分析。根據(jù)PB 試驗(yàn)結(jié)果，得到對(duì)綜合得分影響最明顯的3 個(gè)因素，并根據(jù)其正負(fù)效應(yīng)設(shè)計(jì)步長(zhǎng)和變化方向。估計(jì)值為正則為正效應(yīng)，反之則為負(fù)效應(yīng)，快速達(dá)到最優(yōu)響應(yīng)區(qū)域[30]。

1.2.7 Box-Behnken 響應(yīng)面試驗(yàn) 根據(jù)PB 試驗(yàn)和最陡爬坡試驗(yàn)分析結(jié)果確定的3 個(gè)因素，以綜合評(píng)分為響應(yīng)值，對(duì)每個(gè)因素的3 個(gè)水平進(jìn)行（-1、0、+1）編碼。每個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)平行3 次。呈現(xiàn)正效應(yīng)的因素采用高水平，呈現(xiàn)負(fù)效應(yīng)的因素采用低水平。Box-Behnken 試驗(yàn)設(shè)計(jì)（BBD）的因素及水平見表2。

表2 Box-Behnken 試驗(yàn)因素與水平Table 2 Factors and levels of Box-Behnken test

1.2.8γ-PGA 測(cè)定 本文參考Yan 等[31]的方法進(jìn)行發(fā)酵納豆γ-PGA 測(cè)定。

1.2.8.1γ-PGA 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制 精確稱取一定量的γ-聚谷氨酸標(biāo)準(zhǔn)品，用蒸餾水溶解，稀釋至含量為100 μg/mL 的γ-PGA 標(biāo)準(zhǔn)液。精密量取10、20、30、40、50 mL 上述溶液，分別置于1～5 號(hào)容量瓶中，用蒸餾水定容至100 mL，搖勻，得到10～50 μg/mL 的γ-PGA 標(biāo)準(zhǔn)液，待檢測(cè)。

1.2.8.2 CTAB 溶液的配制 配制2% NaOH 溶液，并以此為溶劑，加入CTAB，攪拌溶解，配制成5 g/L的CTAB 試液。

1.2.8.3 CTAB 比濁法 取2 mL 待測(cè)液于試管中，準(zhǔn)確加入2 mL CTAB 試液，輕微振蕩，靜置3 min，將反應(yīng)液倒入比色皿中，以蒸餾水和CTAB 試液混合作為空白，測(cè)定在波長(zhǎng)224 nm 下的吸光值。以γ-PGA 標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)，224 nm 處的吸光值為縱坐標(biāo)，得到γ-PGA 標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性方程為Y=0.0216X+0.0734，R2=0.9913。將所測(cè)得的樣品吸光值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線，并根據(jù)下式（1）計(jì)算γ-PGA 含量：

1.2.9 感官評(píng)價(jià)方法 由經(jīng)過專業(yè)培訓(xùn)的人員組成評(píng)價(jià)小組（5 男5 女）對(duì)納豆的色澤、氣味、滋味和拉絲進(jìn)行評(píng)分，分值范圍為0～10 分[32]。納豆感官評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)見表3。

表3 納豆感官評(píng)價(jià)表Table 3 Natto sensory evaluation table

1.2.10 綜合評(píng)分的計(jì)算方法 以γ-PGA 產(chǎn)量和感官評(píng)價(jià)的綜合評(píng)分為指標(biāo)進(jìn)行分析[33]，如下式（2）：

1.3 數(shù)據(jù)處理

每個(gè)樣品重復(fù)測(cè)定3 次，利用Desgin-Expert 8.06 軟件對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析，優(yōu)化各因素最優(yōu)條件并根據(jù)預(yù)測(cè)結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證。采用SPSS 16.0 對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行顯著性和誤差分析，采用Origin 2018 作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素優(yōu)化發(fā)酵條件

2.1.1 不同大豆品種篩選 在一定發(fā)酵條件下，測(cè)定巴西10 號(hào)、巴西13 號(hào)、華夏3 號(hào)、粵小黃1 號(hào)、粵小黃2 號(hào)、粵小黃3 號(hào)6 種品種納豆的感官總分及γ-PGA 含量，計(jì)算綜合評(píng)分。由圖1 可知，6 種品種大豆發(fā)酵納豆產(chǎn)γ-PGA 及其感官品質(zhì)有一定的差異。整體上看，華夏大豆和粵小黃大豆發(fā)酵納豆γ-PGA產(chǎn)生量及其感官品質(zhì)高于巴西大豆發(fā)酵納豆，且γ-PGA 產(chǎn)生量和納豆感官品質(zhì)呈一定的正比關(guān)系。粵小黃2 號(hào)納豆γ-PGA 產(chǎn)生量和綜合評(píng)分最高，分別達(dá)到3.28 mg/g 和9.45，華夏3 號(hào)感官總分最高為31.83。巴西10 號(hào)納豆γ-PGA 產(chǎn)生量和綜合評(píng)分最低，分別為2.30 mg/g 和8.07，粵小黃3 號(hào)感官總分最低為30.00。根據(jù)以上結(jié)果，選用γ-PGA 產(chǎn)生量和綜合評(píng)分最高的粵小黃2 號(hào)進(jìn)行后續(xù)的發(fā)酵實(shí)驗(yàn)。

圖1 不同大豆品種發(fā)酵納豆產(chǎn)γ-PGA 的差異Fig.1 The difference of γ-PGA produced by fermented natto from different soybean varieties

2.1.2 不同大豆浸泡pH 對(duì)納豆發(fā)酵產(chǎn)γ-PGA 的影響 測(cè)定大豆浸泡pH6.6、6.8、7.0、7.2、7.4 的粵小 黃2 號(hào)納豆的感官總分及γ-PGA 含量，計(jì)算綜合評(píng)分，大豆浸泡pH 對(duì)納豆品質(zhì)的影響如圖2 所示。由圖2 可知，隨著浸泡pH 的增大，γ-PGA 產(chǎn)生量及綜合評(píng)分呈現(xiàn)出先上升后下降的趨勢(shì)，當(dāng)浸泡pH 達(dá)到7.2 時(shí)，γ-PGA 產(chǎn)生量及綜合評(píng)分達(dá)到最大值，之后開始降低?？赡苁且?yàn)閜H 過高或者過低，不利于菌株生長(zhǎng)繁殖，最終形成芽孢，停止產(chǎn)γ-PGA[34]。但是納豆的感官總分幾乎保持不變，說明此pH 區(qū)間對(duì)納豆感官品質(zhì)的影響不大。因此，納豆發(fā)酵產(chǎn)γ-PGA的大豆最佳pH 為7.2。

圖2 不同大豆浸泡pH 對(duì)納豆發(fā)酵產(chǎn)γ-PGA 的影響Fig.2 Effects of different soybean soaking pH values on the production of γ-PGA by natto fermentation

2.1.3 不同接種量對(duì)納豆發(fā)酵產(chǎn)γ-PGA 的影響 測(cè)定接種量為1%、2%、4%、6%、8%的粵小黃2 號(hào)納豆的感官總分及γ-PGA 含量，計(jì)算綜合評(píng)分。接種量對(duì)納豆品質(zhì)的影響如圖3 所示，由圖3 可得，隨著接種量的增大，納豆γ-PGA 產(chǎn)生量、感官總分和綜合評(píng)分呈現(xiàn)出先急速上升后緩慢下降的趨勢(shì)。當(dāng)接種量小于4%時(shí)，三個(gè)評(píng)價(jià)指標(biāo)均處于低水平。這是因?yàn)楫?dāng)接種量較低時(shí)，納豆芽孢桿菌不能將納豆充分發(fā)酵，但當(dāng)接種量達(dá)4%時(shí)，納豆芽孢桿菌能最大程度地利用大豆中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，使γ-PGA 產(chǎn)生量、感官總分和綜合評(píng)分達(dá)到最佳。當(dāng)接種量大于4%時(shí)，三個(gè)評(píng)價(jià)指標(biāo)緩慢下降?？赡苁蔷窟^多，形成競(jìng)爭(zhēng)。也可能是由于營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的減少與其代謝產(chǎn)物的增加抑制了發(fā)酵過程，導(dǎo)致納豆γ-PGA 產(chǎn)生量變少，感官總分和綜合評(píng)分降低[3]。因此，納豆發(fā)酵產(chǎn)γ-PGA 的最佳接種量為4%。

2.1.4 不同裝瓶量對(duì)納豆發(fā)酵產(chǎn)γ-PGA 的影響 測(cè)定裝瓶量為5%、10%、15%、20%、25%的粵小黃2 號(hào)納豆的感官總分及γ-PGA 含量，計(jì)算綜合評(píng)分，裝瓶量對(duì)納豆品質(zhì)的影響如圖4 所示。由圖4 可得，隨著裝瓶量的增大，納豆γ-PGA 產(chǎn)生量、感官總分和綜合評(píng)分呈現(xiàn)出先急速上升后下降的趨勢(shì)。當(dāng)裝瓶量為20%時(shí)，納豆γ-PGA 產(chǎn)生量、感官總分和綜合評(píng)分最高，這與周雪琴等[34]、Yang 等[35]的研究結(jié)果一致。這可能是因?yàn)檠b瓶量過少時(shí)，營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)缺乏，不足以支撐菌株的生長(zhǎng)繁殖，最終形成芽孢，停止產(chǎn)γ-PGA；當(dāng)裝瓶量過多時(shí)，會(huì)導(dǎo)致營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)不能被最大利用，發(fā)酵不完全，感官品質(zhì)不夠好。因此，納豆發(fā)酵產(chǎn)γ-PGA 的最佳裝瓶量為20%。

圖4 不同裝瓶量對(duì)納豆發(fā)酵產(chǎn)γ-PGA 的影響Fig.4 Effects of different bottling quantities on production of γ-PGA by natto fermentation

2.1.5 不同發(fā)酵溫度對(duì)納豆發(fā)酵產(chǎn)γ-PGA 的影響溫度是影響微生物生長(zhǎng)與代謝的重要原因。測(cè)定發(fā)酵溫度為33、35、37、39、41 ℃的粵小黃2 號(hào)納豆的感官總分及γ-PGA 含量，計(jì)算綜合評(píng)分。發(fā)酵溫度對(duì)納豆品質(zhì)的影響如圖5 所示，由圖5 可知，隨著發(fā)酵溫度的增大，納豆γ-PGA 產(chǎn)生量、感官總分和綜合評(píng)分呈現(xiàn)出先急速上升后緩慢下降的趨勢(shì)。當(dāng)發(fā)酵溫度為37 ℃時(shí)，納豆γ-PGA 產(chǎn)生量、感官總分和綜合評(píng)分最高，這與Feng 等[36]的研究結(jié)果相近。溫度過高或過低不僅對(duì)菌株的正常生長(zhǎng)有影響，而且發(fā)生反應(yīng)所需要的酶在高溫下失活，在低溫下活性受到較大的抑制，從而導(dǎo)致γ-PGA 的產(chǎn)量降低，發(fā)酵不完全，感官品質(zhì)變差[26]。因此，納豆發(fā)酵產(chǎn)γ-PGA 的最佳發(fā)酵溫度為37 ℃。

圖5 不同發(fā)酵溫度對(duì)納豆發(fā)酵產(chǎn)γ-PGA 的影響Fig.5 Effects of different fermentation temperatures on γ-PGA production by natto fermentation

2.1.6 不同發(fā)酵時(shí)間對(duì)納豆發(fā)酵產(chǎn)γ-PGA 的影響測(cè)定發(fā)酵時(shí)間為18、21、24、27、30 h 的粵小黃2 號(hào)納豆的感官總分及γ-PGA 含量，計(jì)算綜合評(píng)分。發(fā)酵時(shí)間對(duì)納豆品質(zhì)的影響如圖6 所示，由圖6 可知，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，納豆γ-PGA 產(chǎn)生量、感官總分和綜合評(píng)分迅速增長(zhǎng)，當(dāng)發(fā)酵時(shí)間達(dá)24 h 時(shí)，三個(gè)評(píng)價(jià)指標(biāo)達(dá)到最大，這與陳樂樂等[3]、Yang 等[35]的研究結(jié)果一致。之后γ-PGA 產(chǎn)生量、感官總分和綜合評(píng)分隨時(shí)間的增加趨于平穩(wěn)或緩慢降低。發(fā)酵時(shí)間的長(zhǎng)短對(duì)菌株的繁殖及成品納豆的性質(zhì)都會(huì)有一定影響。發(fā)酵初期，納豆菌代謝加快產(chǎn)物積累，γ-PGA產(chǎn)生量、感官總分升高；隨著發(fā)酵時(shí)間到一定的范圍，納豆菌代謝下降，逐漸不轉(zhuǎn)化剩余的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，故γ-PGA 產(chǎn)生量、感官總分趨于平穩(wěn)或者緩慢降低[37]。因此，納豆發(fā)酵產(chǎn)γ-PGA 的最佳發(fā)酵時(shí)間為24 h。

圖6 不同發(fā)酵時(shí)間對(duì)納豆發(fā)酵產(chǎn)γ-PGA 的影響Fig.6 Effects of different fermentation time on the production of γ-PGA by natto fermentation

2.2 Plackett-Burman 試驗(yàn)

納豆發(fā)酵產(chǎn)γ-PGA 綜合評(píng)分的Plackett-Burman試驗(yàn)結(jié)果及方差分析見表4、表5。利用 Design Expert 8.0.6 軟件，以綜合評(píng)分Y 為響應(yīng)值，得到回歸方程為Y=7.81-0.018A-0.017B-0.050C+0.66D+0.33E，R2=0.9987。表明該回歸方程模型的擬合度良好，回歸方程具有代表性。其中R2adj=0.9976，表明模型適用于99.76%的效應(yīng)值。表5 方差分析結(jié)果顯示，發(fā)酵溫度（D）、發(fā)酵時(shí)間（E）、裝瓶量（C）的結(jié)果對(duì)綜合分?jǐn)?shù)（Y）有較顯著影響（P＜0.01），各因素影響的大小為D＞E＞C，其他2 個(gè)因素影響不顯著，故取發(fā)酵溫度、發(fā)酵時(shí)間和裝瓶量這三個(gè)因素進(jìn)行后續(xù)爬坡試驗(yàn)。

表4 Plackett-Burman 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 4 Plackett-Burman test design and results

表5 Plackett-Burman 試驗(yàn)設(shè)計(jì)方差分析Table 5 Analysis of variance for Plackett-Burman trial design

2.3 最陡爬坡試驗(yàn)結(jié)果

從表6 中可以看出，隨著裝瓶量、發(fā)酵溫度、發(fā)酵時(shí)間這三個(gè)重要因素的趨勢(shì)性變化，納豆γ-PGA 產(chǎn)生量、感官總分和綜合評(píng)分呈先上升后下降的趨勢(shì)，并且在第3 組實(shí)驗(yàn)的條件下，三個(gè)指標(biāo)達(dá)到最高。因此，以該試驗(yàn)組為下一步響應(yīng)面的中心試驗(yàn)點(diǎn)，進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)。

表6 最陡爬坡試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 6 Test design and results of steepest climb

2.4 響應(yīng)面分析結(jié)果

納豆發(fā)酵產(chǎn)γ-PGA 綜合評(píng)分的響應(yīng)面分析試驗(yàn)結(jié)果見表7，回歸模型的方差分析見表8。利用Design Expert 8.0.6 軟件對(duì)表7 中綜合評(píng)分?jǐn)?shù)據(jù)進(jìn)行二次多元回歸擬合，回歸方程如下：Y綜合評(píng)分=10.04-0.029A+0.065B+0.096C+5.000E-003AB-7.500E-003AC+0.010BC-0.27A2-0.60B2-0.25C2。

表7 Box-Behnken 試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 7 Box-Behnken test design and results

表8 Box-Behnken 試驗(yàn)回歸模型及方差分析Table 8 Box-Behnken test regression model and variance analysis

由表8 可知，綜合評(píng)分模型的F值為47.09，P＜0.0001，說明模型均高度顯著，模型成立。失擬項(xiàng)為4.14，P＞0.05 不顯著，說明未知因素對(duì)實(shí)驗(yàn)的影響小。該模型R2為0.9838，R2adj為0.9629，即表明該模型可以解釋96.29%的納豆發(fā)酵綜合評(píng)分的變化，僅有大概3.71%變化不能被預(yù)測(cè)。模型與實(shí)際實(shí)驗(yàn)的擬合程度好，可用于分析與預(yù)測(cè)各因素對(duì)納豆發(fā)酵產(chǎn)γ-PGA 綜合評(píng)分的影響。由表8 可知，方程中一次項(xiàng)B 對(duì)納豆發(fā)酵產(chǎn)γ-PGA 的綜合評(píng)分影響顯著（P＜0.05），而一次項(xiàng)C 對(duì)納豆發(fā)酵產(chǎn)γ-PGA 的綜合評(píng)分影響較顯著（P＜0.01），二次項(xiàng)A2、B2、C2的影響極顯著（P＜0.001），說明各因素對(duì)納豆發(fā)酵產(chǎn)γ-PGA 綜合評(píng)分的影響呈二次關(guān)系，而非簡(jiǎn)單的線性關(guān)系。由F值檢驗(yàn)可知各因素對(duì)綜合評(píng)分影響的大小順序?yàn)椋篊＞B＞A，即發(fā)酵時(shí)間＞發(fā)酵溫度＞裝瓶量。

2.5 響應(yīng)面因素間的交互作用分析

為了更直觀地觀察3 因素之間的交互作用，確定綜合評(píng)分最高點(diǎn)。根據(jù)上述回歸方程和回歸模型方差分析表，利用Design-expert 軟件繪制響應(yīng)面分析圖及其等高線圖（圖7）。每個(gè)響應(yīng)面代表在保持一個(gè)變量的最優(yōu)條件下，其他兩個(gè)自變量之間的交互作用對(duì)納豆發(fā)酵產(chǎn)γ-PGA 綜合評(píng)分的影響。

圖7 兩兩因素交互作用對(duì)綜合評(píng)分影響的響應(yīng)面和等高線圖Fig.7 Response surface and contour map of the interaction of pairwise factors on the comprehensive score

從圖7 的響應(yīng)面分析圖可以看出，在一個(gè)變量確定的情況下，其他兩個(gè)因素對(duì)綜合評(píng)分的影響基本呈拋物線狀，且存在極大值點(diǎn)，變化趨勢(shì)為先增大后減小。響應(yīng)面越陡，等高線的疏密度分布越不均勻，說明交互作用越大。圖7 的（a）、（c）圖中曲面相對(duì)較為陡峭，（b）、（d）圖中等高線的疏密度分布較不均勻、呈近似馬鞍形[38]，說明裝瓶量與發(fā)酵溫度、裝瓶量與發(fā)酵時(shí)間均有一定交互作用，對(duì)綜合評(píng)分有一定的影響，但不顯著，與表8 中的P值相對(duì)應(yīng)（P＞0.05）。圖7 的（e）圖雖然曲面相對(duì)較為陡峭，但是其等高線（f）圖近似圓形，說明發(fā)酵溫度與發(fā)酵時(shí)間的交互作用不顯著，這與回歸模型中的方差分析結(jié)果一致。

2.6 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

回歸模型預(yù)測(cè)的納豆發(fā)酵產(chǎn)γ-PGA 最優(yōu)發(fā)酵條件及綜合評(píng)分為：裝瓶量19.89%，發(fā)酵溫度37.06 ℃，發(fā)酵時(shí)間24.20 h，綜合評(píng)分為10.05。根據(jù)實(shí)際情況，將發(fā)酵條件修正為裝瓶量19.90%、發(fā)酵溫度37.10 ℃、發(fā)酵時(shí)間24.20 h，進(jìn)行3 次平行發(fā)酵驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。結(jié)果得出，γ-PGA 產(chǎn)量為3.65 mg/g，感官總評(píng)分為31.67 分，綜合評(píng)分為10.04 分。實(shí)際值與預(yù)測(cè)值無顯著性差異（P＞0.05），說明得到的最優(yōu)發(fā)酵條件參數(shù)可靠，模型得到的實(shí)驗(yàn)結(jié)果具有較強(qiáng)的實(shí)際意義。

3 結(jié)論

以γ-PGA 產(chǎn)生量和納豆感官總分的綜合評(píng)分為依據(jù)，對(duì)納豆發(fā)酵產(chǎn)γ-PGA 進(jìn)行工藝優(yōu)化。結(jié)果表明：在大豆浸泡pH、接種量、裝瓶量、發(fā)酵溫度和發(fā)酵時(shí)間單因素優(yōu)化實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用Plackett-Burman 試驗(yàn)設(shè)計(jì)方法篩選出對(duì)綜合評(píng)分影響最大的3 個(gè)因素是裝瓶量、發(fā)酵溫度和發(fā)酵時(shí)間。通過最陡爬坡試驗(yàn)選取接近綜合得分最高的3 個(gè)重要水平，最后通過Box-Behnken 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)，得到納豆發(fā)酵產(chǎn)γ-PGA 的最優(yōu)實(shí)際發(fā)酵條件：裝瓶量19.90%、發(fā)酵溫度37.10 ℃、發(fā)酵時(shí)間24.20 h，此時(shí)，綜合評(píng)分為10.05。最終驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)的綜合評(píng)分為10.04，與預(yù)測(cè)值相差不大。這說明模型得到的預(yù)測(cè)結(jié)果穩(wěn)定可靠，能夠指導(dǎo)實(shí)際生產(chǎn)應(yīng)用。