牡丹蛋白的安全性評價

鹿 杰，黃志強，劉炎姝，邱 敏，張 麗，袁文鵬,

（1.齊魯工業大學（山東省科學院），山東省科學院菏澤分院，山東省生物工程技術創新中心，山東菏澤 274000；2.海陽市物資和儲備中心，山東煙臺 265100）

油用牡丹作為近年來新興的優良木本油料作物，具有生長適應性強、耐干旱貧瘠，出油率高等特點[1-2]。油用牡丹籽壓榨得到的牡丹籽油富含α-亞麻酸、亞油酸、油酸等不飽和脂肪酸[3-4]。牡丹籽粕是油用牡丹籽經脫殼壓榨制取牡丹籽油后的副產物，產出率高達60%～80%[5-7]。已有研究表明牡丹籽粕中富含蛋白質、脂類和多糖等成分，其中牡丹蛋白含量較高，占牡丹籽粕的28%，且氨基酸種類豐富[8-11]，有研究表明其具有降低膽固醇、改善心血管疾病等效果[12-16]。但牡丹籽粕目前僅被作為肥料或者飼料使用，甚至被當做廢棄物處理，在污染環境的同時，也造成了資源的嚴重浪費[17-18]。

當前我國植物蛋白產業的發展已較為成熟，在植物蛋白中大豆蛋白占據主導地位，廣泛應用于食品領域[19-20]。由于我國可用于種植大豆的耕地僅占全國總耕地面積的2.4%，難以滿足每年1 億多噸大豆需求量[21]，導致我國大豆對外依賴性高的問題十分嚴峻。與大豆蛋白相比，油用牡丹種植范圍寬廣，在干旱、山坡等地均可種植，不與糧食爭地，且原料成本低廉。課題組前期研究利用醇提-堿提-酸沉-閃蒸熱處理法從牡丹籽粕中制備得到牡丹蛋白，其吸油性、起泡性、乳化性、乳化穩定性及泡沫穩定性均優于大豆分離蛋白，吸水性、吸油性及乳化穩定性均高于酪蛋白[22]，具有在食品領域廣泛應用的功能特性。

牡丹蛋白作為新植物蛋白源，其安全性評價研究相對較少，本文以通過醇提-堿提-酸沉-閃蒸熱處理方法得到的牡丹蛋白為受試物，開展小鼠急性經口毒性試驗、大鼠28 d 經口毒性試驗和90 d 經口毒性試驗，從生理指標、血液指標、組織病理學等層面對牡丹蛋白的安全性進行綜合評估，全面了解牡丹蛋白的潛在風險和安全性水平，填補牡丹蛋白在安全性評價領域的研究空白，以期為牡丹蛋白在食品領域中的應用提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

牡丹籽蛋白（純度≥94.32%）實驗室自制[22]；總蛋白測定試劑盒、白蛋白測定試劑盒、葡萄糖測定試劑盒、甘油三酯測定試劑盒、總膽固醇測定試劑盒、丙氨酸氨基轉移酶測定試劑盒、天門冬氨酸氨基轉移酶測定試劑盒、堿性磷酸酶測定試劑盒、肌酐測定試劑盒、尿素測定試劑盒、氯測定試劑盒、鉀測定試劑盒、鈉測定試劑盒 北京豪邁生物工程有限公司；獸用血細胞分析用試劑包 深圳邁瑞生物醫療電子股份公司；SPF 級 ICR 4 周齡小鼠 40 只（雌雄各半）、SPF 級 SD 3 周齡大鼠 100 只（雌雄各半）濟南朋悅實驗動物繁育有限公司提供，許可證號 SCXK魯20190003，經齊魯工業大學（山東省科學院）菏澤分院動物倫理委員會批準使用。

Human star 600 自動生化分析儀 德國胡曼生化診斷有限責任公司；TG16WS 高速離心機 長沙湘智離心機儀器有限公司；BC-5130 五分類血液分析儀 深圳邁瑞生物醫療電子股份公司；BMJ-1B 組織包埋機、RSJ-1A 組織染色機 天津愛華醫療器械有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 急性經口毒性試驗

1.2.1.1 動物分組及灌胃劑量 采用急經口毒性試驗中的限量法進行[3]。小鼠適應性喂養1 周后，隨機分為空白組和試驗組，每組20 只，雌雄各半。配制牡丹蛋白混懸液至最大溶解度（130 mg/mL），試驗前6 h 禁食不禁水。試驗組連續灌胃三次，每次間隔6 h，灌胃總劑量11700 mg/kg，空白組給予等劑量蒸餾水，末次灌胃2 h 后正常進食[23]。

1.2.1.2 測量指標 連續14 d 觀察小鼠活動情況，記錄中毒表現及死亡情況。每3 d 稱量小鼠體重及飼料剩余量，按式（1）計算大鼠對飼料的食物利用率[24]；試驗結束后，處死小鼠，摘取心、肝、脾、肺及腎并稱重，按式（2）計算臟體比[25]。

1.2.2 28 d 經口毒性試驗

1.2.2.1 動物分組及灌胃劑量 大鼠適應性喂養1 周后，隨機分為空白組和牡丹蛋白低、中、高劑量組，每組12 只，雌雄各半。根據市售植物蛋白粉成人（70 kg/人）日推薦攝入量（10 g/次/d）計算牡丹蛋白灌胃劑量。市售植物蛋白粉中蛋白含量為80%，則成人每日推薦攝入蛋白粉劑量約為114 mg/kg，按折算系數6.25 折算成大鼠劑量為712.5 mg/kg[26]。設計低、中、高劑量組灌胃濃度分別為1500、3000、6000 mg/kg（相當于人體推薦攝入量的13.16、26.32、52.63 倍），每組每天灌胃2 次，連續灌胃28 d，每次灌胃體積為20 mL/kg，空白組灌胃等劑量蒸餾水，試驗期間大鼠正常飲食飲水[27]。

1.2.2.2 測量指標 每周稱量大鼠體重和飼料剩余量并計算食物利用率，28 d 后腹主動脈取血，使用五分類血液分析儀測定血常規（血紅蛋白、紅細胞計數、白細胞計數、中性細胞、淋巴細胞、單核細胞、嗜酸、嗜堿細胞含量）和血清生化指標（總蛋白、白蛋白、葡萄糖、甘油三酯、總膽固醇、丙氨酸氨基轉移酶、天門冬氨酸氨基轉移酶、堿性磷酸酶、肌酐、尿素、氯、鉀、鈉），取心、肝、脾、肺及腎稱重并計算臟體比，HE 染色觀察臟器病變情況。

1.2.3 90 d 經口毒性試驗 方案及測量指標同28 d經口毒性試驗，灌胃周期調整為90 d[28]。

1.3 數據處理

采用SPSS 20.0 軟件進行統計分析，數據以平均數±標準差表示，組間比較采用單因素方差分析，多重比較方差齊時用LSD 檢驗，方差不齊時用Dunnett’s T3 檢驗，P＜0.05 為差異具有統計學意義。

2 結果與分析

2.1 急性經口毒性試驗結果

2.1.1 體重及食物利用率 小鼠灌胃牡丹蛋白溶液后，食量、活動均正常。試驗結束后，空白組與試驗組小鼠均未出現死亡，試驗組小鼠的活動、毛色、食量與空白組相比均無明顯差異，且活動狀況與精神狀 態均未有異常。由表1 可知，各組雄性體重大于雌性，雌性食物利用率大于雄性。試驗組與空白組相比，體重、食物利用率均無顯著性差異（P＞0.05），雌性試驗組體重增長量與空白組相比顯著降低（P＜0.05），表明牡丹蛋白對雌性小鼠的體重增長有一定影響。因其他指標無顯著性差異，綜合考慮，牡丹蛋白對小鼠生長發育及飲食無顯著影響。

表1 急毒試驗小鼠體重與食物利用率情況Table 1 Weight and food utilization rate of mice in acute toxicity test

2.1.2 臟體比 臟體比是動物安全性評價試驗中的常用指標[29]，可反映受試物對動物機體的損傷程度。空白組與試驗組的臟體比如圖1 所示，與空白組相比，試驗組小鼠心、肝、脾、肺及腎各臟器的臟體比無明顯差異（P＞0.05），且處于正常水平。表明表明小鼠生長發育正常，牡丹蛋白未對小鼠的器官生長和發育產生不良影響。

圖1 急性毒性試驗小鼠臟體比對比Fig.1 Comparison of visceral body ratio in mice with acute toxicity test

2.1.3 劑量分級 由GB 15193.3-2014《食品安全國家標準 急性經口毒性試驗》表G.1 急性毒性（LD50）劑量分級表可知小鼠一次經口LD50在5001～15000 mg/kg 范圍內為實際無毒。急性毒性試驗表明牡丹蛋白的LD50＞11700 mg/kg，在實際無毒范圍內。

2.2 28 d 經口毒性試驗結果

2.2.1 體重及食物利用率 大鼠連續灌胃牡丹蛋白溶液28 d 內，無死亡情況，未發現大鼠中毒及其他異常現象。大鼠進食量和飲水量正常、大小便無異物、生長發育狀態良好。各組大鼠體重增長與食物利用率情況如表2 所示，牡丹蛋白各劑量組與空白組相比，大鼠體重增長與食物利用率均無顯著性差異（P＞0.05）。表明牡丹蛋白28 d 內對大鼠的攝食行為和能量代謝沒有顯著影響，可以維持大鼠的正常生理功能和體重平衡。

2.2.2 臟體比 測量不同劑量組的大鼠臟體比，結果如圖2 所示。與空白組進行比較，發現牡丹蛋白各劑量組與空白組之間的臟體比沒有顯著性差異（P＞0.05）。結果表明，在實驗過程中，各劑量組的大鼠機體生命活動表現出正常水平，器官的生長和發育也沒有出現異常情況。這意味著牡丹蛋白在各劑量組下對大鼠的整體健康沒有產生不良影響。

2.2.3 血常規指標的測定 血液中的血細胞主要是紅細胞、白細胞和血小板。28 d 經口毒性試驗血常規指標測定結果如表3 所示，牡丹蛋白各劑量組與空白組的各項血細胞數量大體一致，其變化在正常水平范圍內，無顯著性差異（P＞0.05）。表明牡丹蛋白溶液能被大鼠有效吸收和利用，以維持正常的血細胞計數和血紅蛋白水平，滿足大鼠正常的血細胞生成和功能需求。

2.2.4 血生化指標的測定 生化指標檢測主要用于檢測機體肝腎功能、血糖、血脂、電解質水平是否正常，對于評價機體是否處于正常狀態具有重要意義[30]。28 d 經口毒性試驗血生化指標測定結果如表4 所示，牡丹蛋白各劑量組各項生化指標值無異常波動，與空白組相比均無顯著性差異（P＞0.05）。表明牡丹蛋白對大鼠生理機能無影響，在大鼠體內具有良好的生物相容性，不引起明顯的代謝紊亂或毒性反應。

表4 28 d 經口毒性試驗血生化指標Table 4 Blood biochemical indexes of oral toxicity test at 28 d

2.2.5 HE 染色結果 連續灌胃牡丹蛋白溶液28 d后，取大鼠臟器進行HE 染色，觀察各臟器病變情況。結果如圖3 所示，牡丹蛋白各劑量組與空白組大鼠的心臟、肝臟、脾臟、肺臟及腎臟的病理組織學觀察均未見明顯異常。表明連續灌胃大鼠牡丹蛋白28 d 后，并沒有對大鼠的臟器產生明顯的病理變化、 功能紊亂或毒性病變。這進一步證明了牡丹蛋白的安全性和對大鼠健康的無害性。

圖3 28 d 毒性試驗大鼠臟器病理切片圖（400×）Fig.3 Pathological section map of rat organs in 28 d toxicity test (400×)

2.3 90 d 經口毒性試驗結果

2.3.1 體重及食物利用率 連續灌胃牡丹蛋白溶液90 d 內，各組均未出現死亡，且行為活動、精神狀態、排泄物等均表現正常，生長發育狀態良好。各組大鼠體重增長與食物利用率如表5 所示，牡丹蛋白各劑量組與空白組相比，大鼠體重增長與食物利用率均無顯著性差異（P＞0.05）。表明灌胃牡丹蛋白90 d 未對大鼠的生長和發育產生明顯的影響。

表5 90 d 毒性試驗大鼠體重與食物利用率情況Table 5 Weight and food utilization rate of rats in 90 d toxicity test

2.3.2 臟體比 連續灌胃牡丹蛋白90 d 后各組大鼠臟體比情況如圖4 所示，同性別下，牡丹蛋白各劑量組與空白組相比無顯著性差異（P＞0.05）。表明連續灌胃牡丹蛋白90 d 未對大鼠器官生長和發育產生不良影響。

圖4 90 d 經口毒性試驗大鼠臟體比對比Fig.4 Comparison of visceral body ratio in rats with 90 d oral toxicity test

2.3.3 血常規指標的測定 90 d 經口毒性試驗血常規指標如表6 所示，牡丹蛋白各劑量組與空白組的各項血細胞數量大體一致，其變化在正常水平范圍內，無顯著性差異（P＞0.05）。表明連續灌胃牡丹蛋白90 d 未對大鼠血細胞造成損害。

表6 90 d 經口毒性試驗血常規指標Table 6 Blood routine indexes of oral toxicity test at 90 d

2.3.4 血生化指標的測定 90 d 經口毒性試驗生化指標如表7 所示，牡丹蛋白各劑量組各項生化指標值均無異常波動，各項指標均處于正常水平，與空白組相比無顯著性差異（P＞0.05）。表明連續灌胃牡丹蛋白90 d 不影響大鼠的肝臟功能、腎臟排泄和其他重要的代謝機制，機體各器官功能運轉正常。

2.3.5 HE 染色結果 連續灌胃牡丹蛋白溶液90 d后，取大鼠心、肝、脾、肺及腎進行HE 染色。結果如圖5 所示，牡丹蛋白各劑量組與空白組大鼠的心、肝、脾、肺、腎中均未見中毒性病變，表明牡丹蛋白對大鼠各組織的形態結構無明顯影響。

圖5 90 d 毒性試驗大鼠臟器病理切片圖（400×）Fig.5 Pathological section map of rat organs in 90 d toxicity test (400×)

3 結論

急性經口毒性試驗表明，在灌胃牡丹蛋白溶液后14 d 內，各組小鼠均無死亡狀況。與空白組相比，試驗組小鼠體重、食物利用率與臟體比均無顯著性差異（P＞0.05），處于正常水平。

28 d 與90 d 經口毒性試驗結果表明，牡丹蛋白低、中、高劑量組大鼠食物利用率、臟體比及各項生命活動與空白組相比無異常，血常規指標及血生化指標值與空白組無顯著性差異（P＞0.05），臟器病理切片顯示大鼠各組織形態完好，未見中毒性病變。由此可知，長期灌胃牡丹蛋白溶液對大鼠無毒性作用。綜上可知，在11700 mg/kg 劑量范圍內牡丹蛋白安全無毒，可應用于食品領域，同時本研究可為牡丹蛋白的開發提供實驗依據。