氣相色譜法測定堅果中16 種有機氯、擬除蟲菊酯類農藥殘留量

李 娜，朱文峰，程國棟，江婷婷，王 婷，冀常菲

（安徽中創食品檢測有限公司，安徽蕪湖 241000）

堅果中含有不飽和脂肪酸、蛋白質、礦物質、維生素、纖維素、以及幫助催化脂肪的其他微量元素，具有保護心臟、美肌，抗氧化、改善視力、補腦等特殊的功能[1-2]。美國食品藥品監督管理局（Food and Drug Administration，FDA）在2007 年向全球提出將堅果食品列為B 級健康食品[3-4]。堅果果樹生長過程中容易受到病蟲害的侵害，噴灑農藥是果樹的病蟲害防治重要手段之一。以六六六、滴滴涕、五氯硝基苯為代表的有機氯殺蟲劑為堅果禁用農藥，但因具備殺蟲種類多，高效、低毒、經濟效益好等特點，容易在堅果果樹的病蟲害防治過程中被果農誤用；菊酯類農藥可以高效殺滅鱗翅目幼蟲，可噴灑防治蝽象類害蟲。噴灑到果樹上的農藥需要一定周期降解，果農對噴灑農藥的時間掌握不準或違規使用，容易造成果實中農藥殘留出現超標的現象的發生，加之隨著人們生活水平的提高，堅果的質量安全問題越來越受到人們的重視[5-6]，我國GB 2763-2014《食品安全國家標準食品中農藥最大殘留限量》標準中對各類堅果農藥殘留限量作出了明確規定。

目前，關于有機氯及擬除蟲菊酯農藥多殘留檢測方法主要有氣相色譜（gas chromatography，GC）、高效液相色譜-質譜法（high performance liquid chromatography-mass spectrography，HPLC-MS）[7-11]、氣相色譜-質譜法（gas chromatography-mass spectrography，GC-MS）等[12-13]，前處理方法有凝膠滲透[14]、固相萃取[15-17]、QuECHERS[16-18]等方法。GC-MS和HPLC-MS 相對GC 來說，設備價格、后期維護成本較高、對人員的基本操作專業技能有比較高的要求，其次，因電子捕獲檢測器（electron capture detector，GC-ECD）對電負性強的化合物有響應，可以用來測定有機氯和擬除蟲菊酯類農藥，所以本研究選擇GC-ECD 進行有機氯、擬除蟲菊酯檢測[19]。前處理方面采用濃硫酸磺化樣本提取液能夠達到有效凈化雜質目的，避免污染進樣口、石英毛細管柱。采用硫酸磺化處理相對于固相萃取和QuECHERS 進行前處理[20]，避免了農藥殘留在濃縮、換相過程中的損失，提升檢測效率、節約檢測成本。

因此，本研究以堅果為實驗對象，丙酮:正己烷（V:V=3:7）為提取溶劑，運用磺化法進行樣本凈化，GC-ECD 檢測有機氯和擬除蟲菊酯。以期為檢測人員準確測定堅果中有機氯和擬除蟲菊酯類農藥殘留量提供技術參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

乙腈、正己烷 色譜純，天津市富宇精細化工有限公司；丙酮、無水硫酸鈉、硫酸 分析純，國藥集團化學試劑有限公司；標準溶液：α-六六六、β-六六六、γ-六六六、δ-六六六、p,p’-滴滴滴（p,p’-DDD）、p,p’-滴滴伊（p,p’-DDE）、p,p’-滴滴涕（p,p’-DDT）、o,p’-滴滴涕（o,p’-DDT）、α-硫丹、β-硫丹、甲氰菊酯、氯氟氰菊酯、氯菊酯、氰戊菊酯、溴氰菊酯、五氯硝基苯 100 μg/mL，壇墨質檢科技股份有限公司；開心果、澳洲堅果、紫皮腰果、碧根果、核桃、巴旦木各500 g，三只松鼠股份有限公司。

GC-7890B 氣相色譜儀 配備ECD 檢測器及Agilent OpenLAB CDS 工作站、DB-17MS、DB-1701石英毛細管色譜柱 30 m×0.32 mm，0.25 μm，美國安捷倫公司；AUW220D 電子分析天平（精度0.01 mg）

日本島津公司；N1-28 全自動氮吹濃縮儀 上海屹堯儀器科技發展有限公司；XK80-A 渦旋混合器 江蘇新康醫療器械有限公司；T25 均質器 德國IKA公司；Milli-Q Direct 8 超純水機 美國默克公司；TDZ5-WS 低速離心機、TG16-WS 高速離心機 湖南湘儀離心機儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 有機氯、擬除蟲菊酯類農藥混合標準溶液的配制 分別移取100 μg/mL 的α-六六六、β-六六六、γ-六六六、δ-六六六、p,p’-DDD、p,p’-DDE、p,p’-DDT、o,p’-DDT、五氯硝基苯、硫丹（α-硫丹、β-硫丹）、甲氰菊酯、氯氟氰菊酯、氯菊酯、氯菊酯、氰戊菊酯、氰戊菊酯、溴氰菊酯標準儲備液100 μL 于10 mL 容量瓶中，用正己烷定容至刻度，配制成濃度為1.0 μg/mL 的有機氯、擬除蟲菊酯類農藥混合標準溶液，將混合標準溶液用正己烷稀釋成質量濃度為0.01、0.02、0.05、0.10、0.20 μg/mL 的系列標準溶液。

1.2.2 樣品前處理 稱取2.0 g（精確到0.01 g）粉末狀堅果（去殼研磨成粉狀過80 目篩）樣品置于50 mL塑料離心管中，分別加入2.0 mL 水、1.0 g 無水硫酸鈉，振蕩混勻后加入丙酮:正己烷（3:7，V:V）試劑10 mL，置振蕩器上劇烈振蕩5 min，1342×g 離心3 min，取全部上清液，將上清液置于氮吹儀中，40 ℃水浴氮吹至近干，將濃縮溶液用正己烷定容至1.0 mL，定容液中加入0.2 mL 硫酸除去脂質等雜質，棄去硫酸，有機相用2 mL 2%硫酸鈉溶液清洗，以2683×g 離心3 min，有機相過0.45 μm 有機系濾膜上機供GC-ECD 測定。

1.2.3 條件優化

1.2.3.1 提取溶劑的選擇 選擇乙腈、丙酮、正己烷、乙腈:丙酮（1:9、3:7、5:5、7:3、9:1 V:V）、乙腈:正己烷（1:9、3:7、5:5、7:3、9:1 V:V）、丙酮:正己烷（1:9、3:7、5:5、7:3、9:1 V:V）不同比例提取溶劑，考察對有機氯、擬除蟲菊酯類農藥的提取率的影響。

1.2.3.2 提取次數的選擇 為了實現對堅果樣品中農殘的充分提取，使用相同提取試劑對堅果樣品中農殘的提取次數分別為1、2、3 次，考察對檢測結果的影響。

1.2.3.3 氮吹溫度的選擇 為了考察氮吹溫度對檢測結果的影響，分別使用40、50、60、70 ℃對堅果樣品進行氮吹。

1.2.3.4 定容試劑的選擇 本文用丙酮：正己烷（3:7 V:V）提取，為了考察定容試劑對提取率的影響，分別用丙酮、正己烷對堅果樣品進行最終定容。

1.2.3.5 磺化試劑體積的選擇 考慮到定容后會有雜質產生，污染進樣口、檢測器等，研究使用0.5、1.0、2.0 mL 濃硫酸對樣本進行磺化凈化。

1.2.4 色譜條件 檢測器：ECD；進樣器溫度：250 ℃；檢測器溫度：300 ℃；進樣量：1.0 μL；不分流進樣；載氣：N2（純度≥99.999%）；流速：1 mL/min。升溫程序為初始溫度設置為100 ℃，保留1 min，以15 ℃/min升溫至160 ℃，保留1.5 min，再以5 ℃/min 升溫至280 ℃，保留10 min。

1.2.5 提取率的計算

式中：W 表示有機氯和擬除蟲菊酯提取率，%；C樣表示樣品中有機氯和擬除蟲菊酯的質量濃度，mg/mL；V樣表示樣品最終定容體積，mL；C標表示添加標品中有機氯和擬除蟲菊酯的質量濃度，mg/mL；V標表示添加標品體積，mL。

1.3 數據處理

本實驗數據經Origin Pro 9.0 繪圖軟件分析處理作出相應色譜圖，采用WPS 2022 軟件處理提取率、相對標準偏差等相關實驗數據。

2 結果與分析

2.1 樣品前處理條件的優化

2.1.1 提取溶劑的選擇 農藥殘留分析中，根據農藥極性、樣本性質的不同選擇不同極性的提取劑，常用的提取劑有乙腈、甲醇、丙酮、二氯甲烷、正己烷、石油醚。分別用乙腈、丙酮、正己烷，乙腈:丙酮（1:9、3:7、5:5、7:3、9:1 V:V）、乙腈:正己烷（1:9、3:7、5:5、7:3、9:1 V:V）、丙酮:正己烷（1:9、3:7、5:5、7:3、9:1 V:V）不同比例進行提取，考慮到使用正己烷提取樣品時，提取率低，不能有效提取堅果組織中的殘留農藥；使用丙酮提取堅果樣本時，提取油脂較多，不利于樣本的下一步凈化；乙腈能夠有效提取多種農藥殘留，但價格相對較貴，且濃縮時間長，為了克服單一提取溶劑提取樣本的不足，且正己烷:乙腈、丙酮:乙腈組合試劑提取率沒有丙酮:正己烷組合試劑好，提取率為65.2%～115.7%，72.1%～116.3%，而丙酮:正己烷混合提取劑在后續的氮吹、凈化效果，提取率方面均有較好的表現且通過數據得知用丙酮:正己烷（3:7，V:V）為提取試劑時，16 種有機氯、擬除蟲菊酯類農藥殘留量提取率為93.5%～103.5%，相對標準偏差（relative standard deviation，RSDs）值為1.11%～3.62%。提取溶劑是確保樣品中各類農藥殘留提取效率、準確度的關鍵因素[21-23]，本文最終選擇丙酮:正己烷（3:7，V:V）為提取試劑，具體結果如圖1。

圖1 不同提取試劑的提取率（n=6）Fig.1 The extraction rate of different extraction reagents (n=6)

2.1.2 提取次數的選擇 采用丙酮:正己烷（V:V=3:7）對堅果樣品提取1、2、3 次，考察提取次數對檢測結果的影響。結果顯示，提取1 次的提取率為93.9%～104.6%，RSDs 為1.11%～5.71%；提取2 次的提取率為93.1%～102.6%，RSDs 為1.21%～5.51%；提取3 次的提取率為93.5%～106.4%，RSDs 為1.0%～5.9%。具體結果見圖2。提取次數的選擇是16 種農藥殘留的提取效率的關鍵控制點[24]，但隨著提取次數的增加，提取液里面的雜質也顯著上升，為后續除雜過程增加難度，且從成本，效率上考慮，試劑、人員花費時間較多，結合綜合情況考慮將樣品提取次數確定為1 次。

圖2 提取次數對提取率的影響（n=6）Fig.2 Effects of extraction times on extraction rate (n=6)

2.1.3 氮吹溫度的選擇 本實驗分別考察40、50、60、70 ℃氮吹溫度對檢測結果的影響，結果顯示不同氮吹溫度對堅果中有機氯、擬除蟲菊酯的農藥殘留影響較大，40、50 ℃氮吹溫度對有機氯影響不大，提取率為92.2%～107.9%，RSDs 為1.22%～4.91%，但隨著溫度的升高提取率有著明顯的降低，擬除蟲菊酯類農藥殘留在40 ℃氮吹溫度下提取率均在92.4%～97.5%之間，RSDs 為1.11%～5.22%，在50、60、70 ℃氮吹溫度提取率隨著溫度的升高越來越低，50 ℃提取率為85.1%～89.5%，60 ℃提取率為69.8%～77.4%，70 ℃提取率只有62.5%～67.4%，在較高溫度氮吹下所檢測物質可能發生分解，影響檢測結果的準確性。不同氮吹溫度的選擇是16 種農藥殘留的提取效率的關鍵控制點[25]，控制提取溫度在40 ℃左右時，提取效果明顯提升，但超過該溫度后，提取效果相差較大[26]。所以研究選擇40 ℃氮吹溫度。具體實驗結果見圖3。

圖3 不同氮吹溫度對提取率的影響（n=6）Fig.3 Effects of different nitrogen blowing temperature on extraction rate (n=6)

2.1.4 定容試劑的選擇 研究分別考察丙酮、正己烷作為樣品上機定容試劑對檢測結果的影響。用丙酮定容提取率為93.1%～112.6%，RSDs 為1.50%～5.31%；用正己烷定容提取率為92.9%～107.5%，RSDs為1.30%～5.14%，結果顯示兩者作為定容試劑，結果無差異。定容試劑的選擇是16 種農藥殘留復溶提取的關鍵控制點[27-28]，同時也影響實驗色譜柱的使用壽命，常用的定容劑有丙酮、乙酸乙酯、正己烷、石油醚等。但是丙酮極性相對較大，對色譜柱損傷較大，對堅果中其他雜質也有很好的溶解效果，且與濃硫酸發生反應。所以研究選用正己烷作為定容試劑。具體結果見圖4。

2.1.5 磺化試劑體積的選擇 研究使用0.2、0.5、1.0 mL 濃硫酸對樣本進行磺化處理，經不同體積濃硫酸磺化后，樣本色譜峰無明顯差異，雜質均能有效去除，提取率均能達到80%以上。磺化試劑體積的選擇是16 種農藥殘留凈化技術的關鍵控制點[29-30]，添加體積較多的濃硫酸時，16 種農藥殘留的提取率沒有明顯提升，而過多的濃硫酸對色譜柱和儀器有較大的傷害，SN/T 0145-2010《進出口植物產品中六六六、滴滴涕殘留量測定方法 磺化法》需要2～3 次磺化，六六六和滴滴涕提取率范圍在77.8%～104.0%，而本實驗選用0.2 mL 的濃硫酸作為磺化試劑體積一次磺化，且提取率在83.2%～101.1%。單樣品檢測時間短，提高了16 種農藥殘留檢測效率。具體結果見圖5。

圖5 不同體積濃硫酸磺化樣本對檢測結果的影響（n=6）Fig.5 Effects of sulfonated samples with different volumes of concentrated sulfuric acid on test results (n=6)

2.2 方法學驗證

2.2.1 線性關系與檢出限 本研究采用在空白基質堅果樣品中添加經逐級稀釋的混合標準工作液進行加標實驗，以各農藥的質量濃度（X，μg/mL）為橫坐標，峰面積（Y）為縱坐標，繪制標準曲線。考察16 種有機氯、有機磷、擬除蟲菊酯類的農藥殘留。在相應線性范圍內，各農藥分離效果較好，結果見圖6，且線性關系良好，決定系數（r2）均在0.996 以上。結果按照3 倍信噪比（S/N=3）計算方法檢出限滿足檢測的要求。計算得出本方法中的各物質檢出限在0.1～0.4 μg/kg 之間，結果見圖6 和表1。結果表明基于GC 檢測堅果中的16 種農藥殘留具有較高的靈敏度，檢出限較低，具有較強的可行性。

圖6 16 種有機氯、擬除蟲菊酯類農藥混合標準色譜圖（0.10 μg/mL）Fig.6 Standard chromatograms of 16 organochlorine and pyrethroid pesticides (0.10 μg/mL)

2.2.2 加標提取率及精密度 為了考察方法的準確性，分別于開心果、澳洲堅果、紫皮腰果、碧根果、核桃、巴旦木基質的空白樣品中加入不同濃度水平的混合標準溶液，分別制備得到為10、40、100 μg/kg不同質量濃度的3 個加標樣品，每個加標濃度分別制備6 個平行樣品，計算其平均提取率及精密度。檢測結果顯示樣品檢測提取率為81.6%～119.5%，RSDs 為1.03%～5.36%，滿足GB/T 27404-2008《實驗室質量控制規范 食品理化檢測》附錄F.1 和F.3相關要求，采用本研究方法與GB/T 5009.19-2008《食品中有機氯農藥多組分殘留量的測定》、GB/T 5009.110-2003《植物性食品中氯氰菊酯、氰戊菊酯和溴氰菊酯殘留量的測定》、SN/T 0145-2010《進出口植物產品中六六六、滴滴涕殘留量測定方法 磺化法》、NY/T 761-2008《蔬菜和水果中有機磷、有機氯、擬除蟲菊酯和氨基甲酸酯類農藥多殘留的測定》方法進行對比實驗，本研究方法檢測開心果、澳洲堅果、紫皮腰果、碧根果、核桃和巴旦木平均提取率為87.2%～103.5%，國家標準方法的提取率范圍為82.6%～105.1%，結果優于國家標準方法。表明本方法的準確度和精密度較好，能夠用于堅果中16 種有機氯、擬除蟲菊酯類農藥殘留量的測定。具體數據見表2、圖7。

表2 不同基質的加標提取率和精密度（n=6）Table 2 Spiked extraction rates and RSDs of spiked standard in different matrices (n=6)

圖7 不同檢測方法提取率對比（n=3）Fig.7 Comparison of extraction rates of different detection methods (n=3)

2.2.3 準確度 本研究的準確度采用GB/T 27404-2008 附錄F.5 中提出的“重復分析標準物質（實物標樣）或水平測試品，測定含量（經提取率校正后）平均值與真值的偏差”的方法進行評定。由于尋找16 種農殘質控樣較為困難，所以實驗采樣空白樣品加標的方式，約定理論加標量為真值。實驗制備20 μg/kg加標樣品，進行6 次平行檢測，同時檢測樣品的提取率，計算平均值，經提取率校正后得到測定值，測定值與約定真值的偏差范圍在-6.5%～+9.0%，滿足GB/T 27404-2008 附錄F.5 中規定的測定真值在0.010～10.000 mg/kg 范圍內，偏差范圍為-20%～+10%的要求，說明本方法檢測結果準確、可信，具體結果見表3。

表3 檢測結果與約定真值的偏差（n=6）Table 3 Detection deviations of measured values and the conventional true value (n=6)

2.3 實際樣品的測定

從市面上購買開心果、澳洲堅果、紫皮腰果、碧根果、核桃、巴旦木各5 份樣品采用本研究方法進行檢測，均未檢出上述16 種有機氯、擬除蟲菊酯類農藥殘留，檢測結果均符合GB 2763-2014 要求。

3 結論

本研究基于濃硫酸磺化凈化技術，建立了一種氣相色譜法測定堅果中16 種有機氯、擬除蟲菊酯類農藥殘留量的分析方法。通過對樣品提取條件的優化，采用丙酮：正己烷（3:7，V:V）提取堅果中16 種有機氯、擬除蟲菊酯類農藥殘留，對6 種堅果樣品提取1 次，用40 ℃氮吹溫度，最終用正己烷定容，0.2 mL濃硫酸磺化凈化，探索出適用于16 種有機氯、擬除蟲菊酯類農藥殘留檢測方法。有機氯、擬除蟲菊酯類農藥殘留在35 min 內達到完全分離，本研究方法16 種物質的檢測限在0.1～0.4 μg/kg 之間，決定系數（r2）均大于0.996，提取率為81.6%～119.5%，RSDs為1.03%～5.36%。本研究方法前處理簡單高效、提取率、精密度良好，可作為堅果企業實驗室農藥殘留檢測篩查參考方法，能夠滿足科學研究、監管監測要求，具有較高的實際應用價值。