超高效液相色譜-串聯質譜法檢測鹵肉中4 種β-受體激動劑殘留

孟春楊，吳玉田，彭 蕾，鐘 雪，鄒 璐，劉文政，周貽兵

（貴州省疾病預防控制中心，貴州貴陽 550004）

β-受體激動劑又稱瘦肉精，是苯乙醇胺類化合物，該類藥物可明顯提高動物的瘦肉率，因此會被非法添加于畜禽類飼料中[1-3]。當人體食入含有β-受體激動劑的動物組織將會出現心悸、惡心、肌肉震顫和緊張等癥狀[4-6]。我國已禁止在畜禽類養殖中使用β-受體激動劑[7]，但在利益的驅使下，還是存在β-受體激動劑非法添加的情況[8-10]。

目前對于β-受體激動劑的檢測方法，常用酶聯免疫法[11-12]、氣相色譜-串聯質譜法[13-15]和液相色譜-串聯質譜法[16-18]等。酶聯免疫法假陽性率較高，氣相色譜-質譜法需要進行衍生后測定，操作過程復雜，且檢測靈敏度低，不適用于多種目標物同時分析[19-21]。相較于其他的檢測技術，液相色譜-串聯質譜法具有靈敏度高、選擇性強、分析速度快和樣品使用量少等優點，已經廣泛應用于食品污染物監測[10,22-23]。市場監管部門對肉制品的監督檢測主要是新鮮肉，一些在飼養中有非法添加的肉就存在制成鹵肉售賣的風險。鹵料成分極其復雜，因此鹵肉基質效應大，容易受到干擾出現假陽性。目前動物源性食品中β-受體激動劑的國標檢測方法（GB 31658.22-2022）[24]實驗前處理操作過程繁瑣，提取的樣品溶液非緩沖鹽體系，需要兩次調節pH，兩次氮吹復溶，操作繁瑣耗時，不適合大批量樣品的檢測。近幾年文獻報道的QuEChERS EMR-Lipid 凈化快速檢測肉制品中β-受體激動劑的方法[25-27]，操作簡單，但主要是除去樣品中的脂肪，無法完全去除鹵肉中的雜質，檢測鹵肉易出現假陽性。

為最大限度地消除基質干擾，本實驗采用基質標準曲線，同時采用同位素內標矯正。采用基質標準曲線可使樣品溶液和標準溶液有相同的離子化環境，從而減小基質效應[25-26,28]，采用與待測化合物相對應的同位素內標校正，同位素內標稀釋技術提高了β-受體激動劑定量分析的準確性和回收率，消除基質的干擾[27,29-30]。本文在國標方法GB31658.22-2022 的基礎上，簡化了萃取步驟，且僅需調節pH 一次，氮吹復溶一次，建立了將鹵肉樣品用乙酸鈉-醋酸緩沖液提取，仍采用經典的SLS 固相萃取柱凈化，UPLC-MS測定鹵肉中4 種β-受體激動劑的方法，為鹵肉中β-受體激動劑的檢測提供了新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

甲醇、乙腈 色譜純，Thermo 公司；甲酸 色譜純，中國阿拉丁公司；濃氨水 優級純，滬試公司；乙酸乙酯、鹽酸、乙酸鈉、醋酸 均為分析純，均為國藥集團化學試劑有限公司；β-葡萄糖醛苷酸酶/芳基硫酸酯酶 硫酸酯酶活性＜20000 units/mL，美國CNW；特布他林、克侖特羅、萊克多巴胺、沙丁胺醇、D9-特布他林、D9-克侖特羅、D5-萊克多巴胺、D3-沙丁胺醇 均為TRC 加拿大公司，純度均大于95%；鹵肉：鹵羊肉、鹵牛肉、鹵豬肉等 來自于貴州省的九個市州。

SLS 固相萃取柱（500 mg/6 mL）福州勤鵬生物科技有限公司；QuEChERS dSPE EMR-Lipid、QuEChERS Final Polish 美國安捷倫科技有限公司；Oasis MCX 固相萃取柱（500 mg/6 mL）、Oasis HLB 固相萃取柱（200 mg/6 mL）Waters 公司；Millipore A10 超純水機 美國密理博公司；SCIEX 6500 三重四極桿串聯質譜儀 美國AB SCIEX 公司；3-30KS 離心機 德國Sigma 公司；DMV-16 渦旋混勻儀 廣東科寅設備有限公司；N-EVAP 氮吹儀 上海安普科技有限公司；SHA-C 水浴恒溫振蕩器 金壇市恒豐儀器廠；F2 pH 計 梅特勒-托利多儀器上海有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 標準溶液的配制

1.2.1.1 混合標準儲備溶液 分別準確稱取0.010 g的特布他林、克侖特羅、萊克多巴胺、沙丁胺醇的標準品于4 個10 mL 容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，搖勻，得到1000 mg/L 的各單標儲備液。取各單標儲備液各0.1 mL 于10 mL 容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，搖勻，得到10 mg/L 的混合標準儲備溶液。臨用前逐級稀釋成10 μg/L 的混合標準使用液。

1.2.1.2 混合同位素內標儲備液 分別準確稱取0.010 g 的D9-特布他林、D9-克侖特羅、D5-萊克多巴胺、D3-沙丁胺醇標準品于4 個10 mL 容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，搖勻，得到1000 mg/L 的各同位素內標儲備液。取各同位素內標儲備液各0.1 mL 于10 mL 容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，搖勻，得到10 mg/L 的混合同位素內標儲備溶液。臨用前逐級稀釋成100 μg/L 的混合同位素內標使用液。

1.2.2 樣品的前處理 稱取絞碎鹵肉2.00 g 樣品于50 mL 離心管中，加100 μL 100 μg/Lβ-受體激動劑混合同位素內標使用液靜置10 min，加10 mL 0.2 mol/L pH5.2 的乙酸鈉-醋酸緩沖液，均質20 s，加入20 μLβ-葡萄糖醛苷酶/芳基硫酸酯酶液，37 ℃水浴振蕩器水解16 h，取出冷卻，10000 r/min 離心10 min，取上清液，用3.0 mol/L 鹽酸溶液調節pH 至2.0±0.1（pH 測定儀），10000 r/min 離心10 min，上清液待凈化。

SLS 固相萃取柱依次用5 mL 水、5 mL 甲醇、5 mL 水、5 mL 40 mmol/L 的鹽酸溶液活化后，取5 mL 上述樣品上清液至柱內過柱，然后用5 mL 水、5 mL 甲醇依次淋洗除雜，抽干，用10 mL 5%氨化乙酸乙酯洗脫，收集洗脫液于10 mL 聚丙烯離心管中，50 ℃水浴中氮吹干。初始流動相復溶，渦旋混勻，0 ℃ 7000 r/min 離心5 min，上清液進UPLC-MS 測定。

1.2.3 儀器條件

1.2.3.1 色譜條件 色譜柱：Thermo Hypersil Gold C18（100 mm×2.1 mm，1.9 μm）；柱溫：35 ℃；進樣量：5 μL；流速0.3 mL/min；流動相A 為0.1%甲酸-水；流動相B 為乙腈；梯度洗脫條件：0～0.5 min 95%A，0.5～8.0 min 95%的A 線性變化為40%，8.0～9.0 min 40%A，9.1～13.0 min 95%A。

1.2.3.2 質譜條件 離子源：ESI+；離子化電壓：4500 V；氣簾氣壓強：35 psi；噴霧氣壓強：50 psi；輔助加熱氣壓強：50 psi；碰撞氣：Medium。多反應監測（MRM）模式進行采集。

1.3 數據處理

UPLC-MS 配有SCIEX OS 數據處理軟件建立標準曲線、計算結果，采用Microsoft Excel 處理數據及繪制圖表。譜圖為Photoshop 作圖軟件繪制。本文凈化柱的選擇和回收率均采用6 個平行樣品計算。

2 結果與分析

2.1 液相條件的確定

在電噴霧離子源正離子模式下，流動相中加入適量甲酸可增強待測組分離子化效率，提高檢測響應強度，且乙腈比甲醇有更強的洗脫能力，因此選擇乙腈-0.1%甲酸水作為流動相，4 種β-受體激動劑的色譜峰形和響應信號的強度也較好。調整洗脫程序，使各組分分離，優化后的色譜條件見1.2.3.1，優化后的譜圖如圖1 所示。

圖1 4 種 β-受體激動劑的離子流色譜圖Fig.1 Ion chromatograms of 4 kinds of β-agonists

2.2 質譜條件的確定

選擇ESI+模式對目標物進行質譜掃描。將質量濃度為50 μg/L 的各標準液進入質譜，通過Q1 掃描找到各目標物的母離子，再對母離子施加一定的碰撞能量進行Product Ion（MS2）掃描，獲得各自的二級碎片離子，選擇2 個信號較強且干擾小的碎片離子與其母離子組成監測離子對。優化碰撞能量、錐孔電壓等各項質譜參數，建立MRM 的檢測模式。最終確定的離子對信息及質譜參數如表1 所示。

表1 質譜參數Table 1 Mass spectrometric parameters

2.3 凈化條件的選擇

本課題組李磊等[31]已確證QuEChERS EMRLipid 凈化HPLC-MS 測定豬肉豬肝中β-受體激動劑簡便可行，在實驗中發現此凈化方法測定鹵肉中β-受體激動劑，高檢出率和同一樣品同時檢出多種β-受體激動劑，數據可疑，可能出現假陽性。如圖2所示，同一鹵肉樣品經SLS 柱凈化后上機為a 圖，克倫特羅和萊克多巴胺均未檢出。QuEChERS EMRLipid 凈化后上機如b 圖，在5.28 min 處出峰，說明萊克多巴胺有檢出；在5.74 min 處出峰，說明克倫特羅有檢出。采用國標法對這一鹵肉樣品進行凈化復檢，克倫特羅和萊克多巴胺均未檢出。結果證實QuEChERS EMR-Lipid 凈化雖然快速簡便，但清除不干凈鹵肉樣品中雜質，容易導致假陽性結果，不適合鹵肉樣品的凈化。QuEChERS EMR-Lipid 是一種分散固相萃取技術，原理是特殊聚合物基質EMR 專門吸附脂質中C5 及以上的碳鏈，對脂質具有非常強的選擇吸附性，主要用途是在前處理過程中去除食品基質中的脂質。而經典的SLS 柱是利用選擇性吸附與選擇性洗脫的液相色譜法分離原理，是使液體樣品溶液通過吸附劑，保留其中被測物質，再選用適當強度溶劑沖去雜質，然后用少量溶劑迅速洗脫被測物質，從而能更加完全地清除雜質，更適用于復雜基質。

圖2 SLS 柱凈化上機（a）和QuEChERS EMR-Lipid 凈化上機（b）的MRM 離子提取色譜圖Fig.2 MRM extracted ion chromatograms of SLS column purification (a) and QuEChERS EMR-Lipid purification (b)

為了使目標化合物的定量分析更加準確，采用的凈化柱要能夠降低或消除樣品基質帶來的干擾。肉類中β-受體激動劑的前處理多采用PXC 柱、HLB 柱、SLS 柱、MCX 柱、QuEChERS EMR-Lipid等凈化，本研究排除了QuEChERS EMR-Lipid，又對比了SLS 柱、HLB 柱和MCX 柱凈化的效果。對加標量5.0 μg/kg 空白鹵牛肉的凈化效率，平行測定6 次，對比其平均回收率，RSD 在1.23%～7.92%之間，結果見圖3。

圖3 不同類型凈化柱的回收率Fig.3 Average recovery of different purification columns

結果顯示：HLB 柱凈化，4 種β-受體激動劑的回收率都不高，這是因為HLB 柱是共價鍵結合分配原理，不適用于β-受體激動劑這類中等強極性化合物[32]。SLS 柱和MCX 柱凈化均為強陽離子交換柱，但SLS 柱的回收率為89.2%～97.9%優于MCX 柱的83.2%～90.4%（詳細結果見圖3），因此選擇SLS柱作為凈化柱。

2.4 標準曲線、檢出限與定量限

取適量的10 μg/L 的混合標準使用液和100 μg/L的混合同位素內標使用液，用空白基質溶液配制成含混合內標5 μg/L 的0.5、1.0、2.0、4.0、6.0、8.0、9.5 μg/L基質匹配標準系列溶液。以系列標準溶液中分析物的濃度（μg/L）與對應的同位素內標的峰面積比值繪制校正曲線，按內標法計算試樣中β-受體激動劑含量。以3 倍信噪比計算方法的檢出限（3S/N），以10倍信噪比計算方法的定量限（10S/N），結果見表2。

表2 β-激動劑線性方程、檢出限和定量限Table 2 Linear equation,detection limit and quantitation limit of β-agonists

由表2 可知4 種β-受體激動劑在0.5～9.5 μg/L濃度范圍內r值＞0.9988，計算特布他林、克侖特羅、萊克多巴胺、沙丁胺醇的檢出限均為0.1 μg/kg，定量限為0.3 μg/kg。與部分已有方法[21,29]相比檢出限和定量限更低，定量更為精準可靠。

2.5 回收率與精密度

在2.0 g 空白鹵肉樣品中加入1、5、9 μg/kg 的3 個不同濃度水平的4 種β-受體激動劑標準溶液，同時加入含有和標準曲線相同濃度的內標溶液，每個濃度水平平行測定6 次，計算回收率及測定值的相對標準偏差（RSD），結果見表3。

表3 β-激動劑回收率與精密度結果Table 3 Spiked recoveries and RSDs of β-agonists

由表3 可知，4 種β-受體激動劑的回收率在87.9%～113.7%之間，RSD 在1.48%～9.32%之間，表明方法回收率和精密度良好。

2.6 實際樣品測定

從貴州省的九個市州每個市（州）采集18 份樣本，其中18 份樣本要求區域內的每個縣（區）至少采集2 份，所有采集的樣本均為當地集市隨機抽取。用SLS 固相萃取柱凈化，超高效液相色譜-串聯質譜法對采集的162 批次鹵肉試樣（有鹵羊肉，鹵牛肉，鹵豬肉等）中的4 種β-受體激動劑進行檢測，結果有2 份陽性樣品。其中采自遵義市農貿市場的一份鹵豬蹄樣品克倫特羅含量為1.51±0.16 μg/kg，萊克多巴胺為3.65±0.28 μg/kg；另外一份采自遵義市農貿市場的鹵羊肉樣品克倫特羅含量為11.5±0.29 μg/kg。用國標方法對陽性樣本進行復檢，鹵豬蹄樣品克倫特羅含量為1.56±0.07 μg/kg，萊克多巴胺為3.51±0.15 μg/kg；鹵羊肉樣品克倫特羅含量為11.7±0.20 μg/kg。食品中獸藥最大殘留限量標準GB 31650-2019和食品中41 種獸藥最大殘留限量GB 31650.1-2022中克倫特羅、特布他林、萊克多巴胺、沙丁胺醇都是禁用藥物，而本實驗在鹵肉中檢出，已有食品風險安全隱患，相關部門應引起重視。

3 結論

本研究建立了SLS 固相萃取柱凈化，超高效液相色譜-串聯質譜法檢測鹵肉中克倫特羅、特布他林、萊克多巴胺、沙丁胺醇4 種β-受體激動劑殘留的方法，并對儀器條件以及前處理方法進行了優化。該方法能有效地除去基質干擾，檢出限為0.1 μg/kg，定量限為0.3 μg/kg，加標回收率在87.9%～113.7%之間，相對標準偏差1.48%～9.32%。該方法方便快速、準確可靠，滿足實際樣品檢測要求，可為鹵肉中β-受體激動劑類化合物獸藥殘留的監測提供技術支撐，有助于鹵肉中β-受體激動劑類化合物獸藥殘留的市場監管。