植物雌激素鷹嘴豆芽素A（BCA）對肝纖維化去勢小鼠模型的改善作用及機制

譚超容，李小飄，冉俊艷，熊 英，廖尚高，張金娟，c，何 迅

貴州醫科大學 a.藥學院，b.基礎醫學院，c.慢性病診療轉化工程研究中心，貴陽 550025

肝纖維化是各種慢性肝病發展為肝硬化及肝癌的必經階段，在早期階段及時干預治療則是可逆的［1］，但若不及時干預，將進展為不可逆的肝硬化，甚至轉變成肝癌［2-4］，因此對肝纖維化的有效干預對于避免其惡性進展具有重要意義。

流行病學研究發現，女性比男性具有更低的肝纖維化和肝硬化的風險［5］，但進入圍絕經期雌激素分泌減少后，肝纖維化的發病率逐漸增加，這表明雌激素對肝臟具有保護作用［6］。內源性的雌激素參與抗肝纖維化的保護作用已有動物實驗［7-9］證據。然而，由于雌激素效應較強，長期過度使用雌激素治療肝纖維化可能導致廣泛的不良反應［10］。相比之下，植物雌激素具有與雌激素相似的結構［11］，被認為具有潛在的弱雌激素效應，臨床應用相對安全［12-14］。鷹嘴豆芽素A（biochanin A，BCA）主要來源于豆科植物鷹嘴豆的種子胚芽部分、紅車軸草全草，屬于異黃酮類植物雌激素，有雌激素樣作用［15-18］。BCA還可延緩高脂飲食誘導的非酒精性肝損傷［19］，本課題組推測BCA 可能通過其弱雌激素作用發揮抗肝纖維作用，為此，本課題以CCl4誘導的雌性雙側卵巢切除（去勢）肝纖維化小鼠為模型，觀察植物雌激素BCA 對肝纖維化的作用及其機制，為開發安全有效的抗肝纖維化植物雌激素藥物提供依據。

1 材料與方法

1.1 主要儀器 YP-SY96 型多功能酶標儀（山東優云譜光電科技有限公司）；101 型恒溫箱（上海市躍進醫療器械有限公司）；AB104-S型電子天平（瑞士梅特勒-托利多公司，感量：0.1 mg）；MIULAB 型離心機（杭州米歐儀器有限公司）；Nikon Eclipse Eclipse E100 型正置光學顯微鏡（日本尼康儀器有限公司）；DYY-6C 電泳液系統（北京六一生物有限公司）；NIKON DS-U3 成像系統（日本尼康儀器有限公司）。

1.2 藥物和試劑 BCA（批號N0901A，純度≥97%）購自大連美侖生物技術有限公司；雌二醇（批號J20171038，規格：1 mg）購自DELPHARM Lille S.A.S；BCA蛋白濃度測定試劑盒（批號20220723）購自北京索萊寶科技有限公司；AST、ALT（批號分別為20220628、20220620）均購自南京建成生物工程研究所；TNF-α、IL-6（批號分別為FU02TDL61345、FU03N42H2910）均購自武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司；兔抗鼠甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）單克隆抗體（批號#62U0922）購自美國Affinity公司；α-平滑肌肌動蛋白（α-SMA）多克隆抗體（批號14395-1-AP）購自武漢三鷹生物技術有限公司；Ⅰ型膠原蛋白（Collagen Ⅰ）單克隆抗體、雌激素受體β（ERβ）多克隆抗體（批號分別為bs-0578R、bs20471R）均購自北京博奧森生物技術有限公司；兔抗鼠轉化生長因子-β1（TGF-β1）單克隆抗體（批號ab179695）購自美國Abcam公司；兔抗鼠細胞核因子-κB（NF-κBp65）、磷酸化細胞核因子κB（p-NF-κBp65）單克隆抗體（批號分別為D14E12、93H1）均購自美國Cell Signaling Technology 公司；PVDF膜（批號R1DB89779）購自德國Merck公司。

1.3 實驗動物 60只昆明小鼠，雌性，體質量18～22 g，購于長沙市天勤生物技術有限公司，實驗動物生產許可證號：SCXK（湘）2019-0014，實驗動物使用許可證號：SYXK（黔）2018-0001，動物房溫度保持在25 ℃左右，適應性飼養1周后用于實驗。

1.4 實驗方法

1.4.1 造模、分組與給藥 造模方法根據文獻［6，20］進行。取50只雌性小鼠切除雙側卵巢以獲得去勢小鼠，同時取10 只同批雌性小鼠切除雙側卵巢旁少量脂肪組織作為假手術組。術后3 天，給予去勢小鼠腹腔注射20%CCl4橄欖油溶液，每周2 次，持續9 周，建立肝纖維化模型。假手術組小鼠以腹腔注射橄欖油代替CCl4。于CCl4誘導的第3周，將50只建模小鼠按體質量隨機分成5組，即模型組、陽性對照組（雌二醇2 mg/kg）、BCA 低劑量組（25 mg/kg）、BCA 中劑量組（50 mg/kg）、BCA 高劑量組（100 mg/kg），每組10 只。分組后，陽性對照組，BCA 低、中、高劑量組分別灌胃溶于0.5%羧甲基纖維素鈉溶液的對應藥物，模型組與假手術組灌胃等體積0.5%羧甲基纖維素鈉溶液，每天1次，連續7周。

1.4.2 取材 末次給藥后24 h，麻醉各組小鼠，取血清，測定血清學指標；剖取小鼠肝臟及子宮，部分肝組織保存于-80 ℃冰箱中，另一部分肝組織固定于10%中性福爾馬林中。

1.4.3 觀察肝臟、子宮外觀及計算肝指數、子宮指數肉眼觀察肝臟及子宮大小、質地、顏色等外觀表現，稱重，按下列公式計算器官（肝、子宮）指數。器官指數（%）=器官質量/末次體質量×100%。

1.4.4 HE、Masson 染色觀察肝組織學改變 固定的肝組織經不同濃度乙醇逐級脫水，浸蠟與包埋，切片，HE和Masson染色，鏡下觀察肝組織學變化。

1.4.5 檢測血清AST、ALT 活性 取血清，采用微板法測定血清中AST、ALT活性。

1.4.6 檢測肝組織中IL-6、TNF-α 水平 取-80 ℃冰箱中保存的肝組織制成勻漿液，采用ELISA 法測定肝組織中IL-6、TNF-α水平，操作步驟按說明書進行。

1.4.7 Wersten Blot 檢測肝組織中Collagen Ⅰ、TGF-β1、α-SMA、ERβ、p-NF-κBp65、NF-κBp65蛋白表達檢測 每組中隨機選取3 只小鼠進行3 次Western Blot 重復實驗。提取肝組織總蛋白，BCA試劑盒檢測蛋白濃度。蛋白變性，SDS 凝膠電泳2 h，濕轉至PVDF 膜，封閉2 h，TBST 緩沖液洗膜3次，分別加入Collagen Ⅰ（1∶2 000）、α-SMA（1∶2 000）、ERβ（1∶500）、TGF-β1（1∶1 000）、NF-κBp65（1∶1 000）、p-NFκBp65（1∶1 000）、GAPDH（1∶5 000）一抗，于4 ℃孵育過夜，隨后用TBST緩沖液洗PVDF膜3次，加二抗孵育2 h，TBST 緩沖液洗膜3 次，ECL 發光顯影，用Image J 軟件對各條帶的灰度值進行分析。

1.5 統計學方法 采用SPSS 24.0 軟件進行數據分析，正態分布的計量資料以表示，兩組間比較采用成組t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用LSD-t檢驗。非正態分布的計量資料以M（P25～P75）表示，多組間比較及進一步兩兩比較均采用Kruskal-WallisH檢驗。P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 BCA對肝纖維化小鼠肝、子宮指數的影響 與假手術組比較，模型組小鼠的子宮指數顯著降低（P＜0.05），肝指數顯著升高（P＜0.05）。與模型組相比，BCA 各劑量組的肝指數均明顯降低（P值均＜0.05），子宮指數無明顯變化（P＞0.05）；陽性對照組肝指數無明顯變化（P＞0.05），子宮指數明顯增大（P＜0.05）（表1）。

表1 BCA對CCl4誘導肝纖維化小鼠肝、子宮指數的影響Table 1 Effects of BCA on liver and uterus weight ratios in CCl4-induced liver fibrosis mice

2.2 BCA 對肝纖維化小鼠肝臟、子宮形態學及肝組織學的影響 肝臟外觀觀察發現：假手術組小鼠肝臟外觀表面光滑，質地柔軟，邊緣銳；模型組小鼠肝臟表面有明顯的粗顆粒狀，質地硬，邊緣圓鈍；與模型組比較，陽性對照組和BCA 各劑量組肝臟表現有不同程度的改善。子宮：假手術組小鼠子宮形態正常，模型小鼠明顯比假手術組小鼠子宮纖細；而陽性對照組小鼠子宮明顯比模型組子宮增粗，BCA 各劑量組小鼠子宮大小與模型組小鼠無明顯差異。HE 染色：假手術組肝細胞形態正常，小葉結構清晰且完整，未出現細胞壞死和脂肪變性、炎癥等；模型組肝細胞有水腫、脂肪空泡、壞死等表現，細胞排列紊亂，小葉結構不完整，并伴有大量炎細胞浸潤；與模型組比較，陽性對照組及BCA 各劑量組肝組織表現較不同程度減輕。Masson 染色：假手術組小鼠肝組織匯管區有少量藍色膠原纖維，小葉結構正常；模型組肝組織內有大量粗大的藍色膠原纖維，交錯分布，導致小葉結構被破壞；與模型組比較，陽性對照組及BCA 各劑量組藍色膠原纖維較細，肝小葉結構破壞程度減輕（圖1）。

圖1 BCA對CCl4誘導肝纖維化小鼠子宮、肝臟形態學及肝臟病理的影響Figure 1 Effects of BCA on the morphological and pathological changes of uterus and liver in CCl4-induced liver fibrosis mice

2.3 BCA 對肝纖維化小鼠血清中AST、ALT 活性的影響與假手術組相比較，模型組小鼠血清AST、ALT均顯著升高（P值均＜0.05）；與模型組相比，陽性對照組及BCA各劑量組小鼠血清AST、ALT均顯著降低（P值均＜0.05）（表2）。

表2 BCA對CCl4誘導肝纖維化小鼠AST、ALT活性的影響Table 2 Effects of BCA on serum activities of AST and ALT in CCl4-induced liver fibrosis mice

2.4 BCA對肝纖維化小鼠肝組織中IL-6、TNF-α水平的影響 與假手術組相比，模型組小鼠肝組織中IL-6、TNF-α 均顯著升高（P值均＜0.05）；與模型組相比，陽性對照組及BCA 各劑量組小鼠肝組織中IL-6、TNF-α 均顯著降低（P值均＜0.05）（表3）。

表3 BCA對CCl4誘導肝纖維化小鼠IL-6、TNF-α水平的影響Table 3 Effects of BCA on serum contents of IL-6 and TNF-α in CCl4-induced liver fibrosis mice

2.5 BCA對肝纖維化小鼠肝組織中Collagen Ⅰ、TGF-β1、α-SMA、ERβ、p-NF-κBp65/NF-κBp65 蛋白表達的影響與假手術組相比較，模型組小鼠肝組織Collagen Ⅰ、TGF-β1、α-SMA 相對表達量均顯著升高（P值均＜0.05），與模型組比，陽性對照組及BCA 低、中、高劑量組小鼠的肝組織Collagen Ⅰ、TGF-β1、α-SMA 相對表達量均顯著降低（P值均＜0.05）。

與假手術組相比，模型組小鼠肝組織ERβ相對表達量無明顯差異（P＞0.05）；與模型組相比，陽性對照組及BCA 中、高劑量組小鼠肝組織ERβ 相對表達量均顯著升高（P值均＜0.05），BCA 低劑量組無明顯差異（P＞0.05）。與假手術組相比較，模型組小鼠的p-NF-κBp65/NF-κBp65相對表達量顯著升高（P＜0.05）；與模型組相比，陽性對照組及BCA中、高劑量組小鼠中的p-NF-κBp65/NF-κBp65相對表達量均顯著降低（P值均＜0.05）（表4，圖2）。

圖2 BCA對CCl4誘導肝纖維化小鼠蛋白表達的影響Figure 2 Effects of BCA on protein expressions in CCl4-induced liver fibrosis mice

表4 BCA對CCl4誘導肝纖維化小鼠肝組織中蛋白表達的影響Table 4 Effects of BCA on protein expressions in CCl4-induced liver fibrosis mice

3 討論

本研究在動物實驗水平上對BCA 可能通過其弱雌激素作用發揮抗肝纖維化作用進行驗證。本課題的創新點在于，為觀察植物雌激素BCA 對子宮的影響選用了雌性小鼠，同時為了避免體內雌激素對實驗的影響，對雌性小鼠進行了去勢處理。CCl4具有肝毒性，以CCl4誘導動物肝纖維化是國內外公認的肝纖維化造模的經典方法［21-22］。本課題對去勢雌性小鼠腹腔注射CCl4制作肝纖維化模型，結果在肉眼及鏡下觀察均可見模型組小鼠肝組織出現了典型的肝纖維化表現，表明造模成功。

血清中AST 和ALT 活性是檢測肝功能損傷程度的靈敏指標［23］，結果顯示，模型組AST、ALT 活性較假手術組顯著升高，表明模型組小鼠存在顯著的肝損傷。肝星狀細胞（HSC）的激活在肝纖維化進展中起著關鍵作用［24］。HSC 合成過量細胞外基質（ECM），在肝內沉積，促進肝纖維化的形成。Collagen Ⅰ是ECM 的主要成分之一，模型組小鼠肝組織中Collagen Ⅰ表達上調，表明模型組小鼠肝組織內存在過多ECM。α-SMA 是肝星狀細胞活化的標志蛋白，其過量表達提示HSC 過度激活分泌ECM，加速肝纖維化的發生、發展［25］，還間接反映HSC 在機體內活化增殖的進度與纖維化進展的嚴重程度［26］。TGF-β1是引起HSC 活化最有效的細胞因子之一，介導HSC 活化和生成ECM，是肝纖維化過程中的關鍵介質，參與肝纖維化的關鍵環節，在肝纖維化的發生、發展中起關鍵作用［27-28］。Western Blot 結果表明，模型組小鼠肝組織α-SMA、TGF-β1表達較假手術組明顯增加，表明模型組小鼠肝組織中肝星狀細胞顯著活化，生成ECM能力明顯增強。

與模型組相比，經高、中、低劑量的BCA 干預后，BCA 各組小鼠血清AST、ALT 活力明顯降低，肝組織中Collagen Ⅰ、α-SMA、TGF-β1表達下調，肝組織病變程度也明顯減輕，表明BCA 處理可減少小鼠肝組織中ECM的生成，降低HSC 的活化，減輕肝組織纖維化病變程度，提示BCA 可有效改善CCl4誘導的雌性去勢小鼠的肝纖維化。與此同時，本實驗還觀察到模型小鼠因體內雌激素缺乏而出現子宮萎縮、子宮指數減小的表現；給予雌激素處理后，改善肝纖維化的同時也使子宮增大。而BCA 僅改善了肝纖維化，對子宮未產生明顯影響，提示BCA 的雌激素樣作用弱，對子宮等其他雌激素相關器官影響不大。可以推測，若將其替代雌激素用于肝纖維治療，可一定程度上降低患子宮癌等疾病的風險。

肝纖維化發展的全過程中伴有炎癥的發生［29］，控制肝臟炎癥可在一定程度上逆轉肝纖維化［30］。NF-κB 是一類重要的核轉錄因子［31］，是NF-κB信號通路中的關鍵分子。NF-κB 信號通路作為經典的炎癥信號通路在炎癥反應中發揮著重要作用。TNF-α、IL-6 等炎癥因子可作為NF-κB 信號通路的配體激活NF-κB 通路，被激活的NF-κB 轉位入核，調控靶基因轉錄。TNF-α、IL-6 等基因的啟動子區具有NF-κB的結合點［32］，被NF-κB激活后又進一步促進炎癥因子表達，形成炎癥反應惡性循環。NF-κB 家族由RelA（p65）、RelB、c-Rel、p50（NF-κB1）和p52（NF-κB2）5 個成員組成，可形成不同形式的同源二聚體或異二聚體。其中p65 蛋白的相關研究最多，是經典的NF-κB 信號通路傳導過程中的關鍵分子，磷酸化后的p65為其活性形式。本研究發現，BCA中劑量、高劑量組肝纖維小鼠肝組織中p65 蛋白的磷酸化修飾水平降低，提示BCA 可抑制NF-κB 信號通路，打破炎癥反應惡性循環，降低TNF-α、IL-6 等炎癥因子水平，減輕肝臟炎癥反應。

BCA 作為植物雌激素，往往可通過雌激素受體發揮作用。本研究發現，BCA 中劑量、高劑量干預的肝纖維化小鼠肝組織中ERβ 表達明顯增高，以BCA 與ERβ 進行分子對接也顯示結合能較好，提示BCA可通過ERβ發揮作用。通過文獻研究發現，上調ERβ可抑制NF-κB信號通路。例如三陰性乳腺癌細胞過表達ERβ 時，NF-κB表達降低，兩者表達呈明顯的相關性［33］。此外，過表達ERβ 可通過降低IκBα 及p65 的磷酸化水平抑制NF-κB信號通路，進而抑制乳腺癌細胞的遷移及增殖［34］。由此，可以合理推測，BCA 可通過上調ERβ 的表達而抑制NF-κB 信號通路，從而減輕肝纖維化小鼠肝組織炎癥反應，進而改善肝纖維化。

綜上所述，BCA 可有效改善CCl4誘導的雌性去勢小鼠的肝纖維化病變，且具有對子宮等雌激素靶器官影響較小的優勢，其作用機制可能是通過上調ERβ 抑制NFκB信號通路，減輕炎癥反應而實現的。

倫理學聲明：本課題實驗方案于2021年7月9日獲得貴州醫科大學實驗動物倫理委員會審批，批號：2100313，符合實驗室動物管理與使用準則。

利益沖突聲明：本文不存在任何利益沖突。

作者貢獻聲明：譚超容參與課題的設計，負責課題實施，數據分析，撰寫論文；李小飄、冉俊艷、熊英、廖尚高參與課題實施，數據收集，修改論文；張金娟、何迅負責課題設計，指導實驗實施及文章撰寫并定稿。