超聲輔助低共熔溶劑制備咖啡果皮可溶性膳食纖維

邵芳芳 胡發廣 董文江 畢曉菲 陳罡 陳艦飛

關鍵詞：咖啡果皮；低共熔溶劑；可溶性膳食纖維；響應面法

咖啡是全球最受歡迎的非酒精飲料之一。近年來，咖啡銷量逐年增加，其種植面積也在不斷擴大，僅2021年全球咖啡豆的產量達1050萬t，其加工產生的咖啡副產物的量也在不斷增加[1]，在我國，咖啡主要種植于云南省和海南省。2021年我國咖啡總產量為1.09887×105t，而每噸成品咖啡豆會產生約1.1t咖啡副產物。因這些副產物中含有高濃度的咖啡因、單寧、茶多酚等物質而不可直接用作生物基質和飼料，通常會被直接丟棄，不僅造成資源的浪費還會污染環境[2]。已有研究表明，這些副產物中含有高附加值的化合物，可利用一定的方法將其中對環境存在污染的部分進行轉化，進而用于提取生物活性化合物和聚合物的原料[3]。因此，咖啡副產物在食品加工中具有重要的應用前景，需要進一步研究以更好地利用它。

在咖啡濕法處理過程中，產生的固體廢棄物中咖啡果皮是主要部分。咖啡果皮含有碳水化合物、膳食纖維、蛋白質和礦物質等成分，其中總膳食纖維含量占70%，可作為優良的膳食纖維來源[4]。目前，對咖啡果皮各成分進行提取分析的研究較多，如HENRIQUE等[5]從阿拉比卡咖啡果皮中提取具有凝膠特性的果膠；TORRESVALENZUELA等[6]利用超分子溶劑對咖啡果皮中的生物活性物質提取并分析了其生物活性；朱珂等[7]對比分析了咖啡果皮與不同來源的可溶性膳食纖維在結構和性質等方面的差異，結果發現咖啡果皮可溶性膳食纖維的熱穩定性和亞硝酸鹽吸附能力顯著優于其他5種樣品；DASILVERIRA等[8]采用固態發酵研究了咖啡果皮中綠原酸的提取和穩定性。

膳食纖維（DF）被認為是生物體中的第7種基本營養素，能通過腸道菌群產生多種有益作用，如抗肥胖、減輕炎癥、降低血糖等，可作為功能性食物成分廣泛應用[9]。根據膳食纖維的溶解性將其分為可溶性膳食纖維（SDF）和不可溶性膳食纖維（IDF），與IDF相比，SDF由于其有效的溶解度、持油/持水能力、界面和表面性質及結合各種分子的潛力而更受青睞[10]。提取方法和條件不同，對SDF的營養和理化性質均有很大影響。目前，對咖啡果皮DF的研究主要集中在DF的制備、改性和功能特性方面的研究。DF常用的制備方法主要有化學法（如酸、堿處理）、物理法（如超聲波法、微波法、高壓均質法）和生物法（如酶法、發酵法），研究中應用較多的是物理法和酶法。化學法雖已被廣泛運用于提取不同來源的纖維，如堿法提取，但因羥基離子會破壞氫鍵和酯鍵，導致SDF、半纖維素和纖維素的損失[11]，而且對環境不友好。酶法提取雖克服了堿提取法的pH值高、易腐蝕、廢物量大等缺點，但其反應時間長、成本高，無法滿足常規需求。因此，探索安全、綠色、高效的提取方法很有必要。

近年來，低共熔溶劑（DES）作為一類綠色可持續溶劑，在功能性成分的提取方面得到較大發展。DES是由氫鍵受體（HBA）和氫鍵供體（HBD）按一定的摩爾比混合而成的二元或三元體系的液體混合物。與離子液體相比，DESs具有物理化學性質穩定、可循環性好和熱穩定性好等特性，而且具有制備簡單、生物相容性和環境友好等優點[12]。基于這些優越的性能，有研究表明，DESs可作為替代溶劑從天然樣品中提取多糖[13]。如GUO等[14]采用遠紅外輻射（FIR）和熱風循環（HAC）的輔助DES提取茯苓中的生物活性多糖，結果表明，優化條件下茯苓多糖的提取效率是傳統提取方法的4～70倍。CHEN等[15]首次采用超聲輔助DES從芒果皮中提取果膠。超聲波作為一種非熱、無毒、安全、高效的綠色技術，已被應用于食品工業中，其產生的空化、剪切和湍流作用能破壞細胞壁，促進溶劑的擴散，加快化合物的溶解，從而提高提取效率[16]。目前，還未見采用UAE-DESs提取咖啡果皮SDF的報道。因此，開發一種綠色的提取咖啡果皮中SDF的方法具有重要意義。

本研究以咖啡果皮為原料，采用UAE-DESs法制備咖啡果皮中可溶性膳食纖維，通過單因素試驗和響應面優化試驗篩選最佳制備條件，進而建立一種綠色高效的提取咖啡果皮中SDF的方法。因此，UAE與DES的結合應用為開發更綠色、更環保、更安全、更易于實施的萃取技術提供了條件，也為咖啡果皮SDF的綠色提取方法提供新思路和理論參考。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1材料與試劑咖啡鮮果（全紅果）采摘于海南省白沙縣咖啡種植基地。乙醇，購自西隴科學有限公司；氯化膽堿為分析純，購自上海源葉公司；1，3-丁二醇、甘油、尿素、蘋果酸、檸檬酸、乳酸、乙酰胺、乙二醇等均為分析純，購自上海阿拉丁公司。

1.1.2儀器與設備集熱式恒溫加熱磁力攪拌器，購自鞏義市予華儀器有限公司；AvantiJXN-26高速冷凍離心機，購自美國貝克曼庫爾特有限公司；VOSHIN-1500C恒溫超聲波萃取儀，購自無錫沃信儀器制造有限公司。

1.2方法1.2.1超聲輔助低共熔溶劑制備咖啡果皮可溶性膳食纖維（1）咖啡果皮預處理。將濕法加工得到的咖啡果皮40℃熱風干燥至水分含量為11%左右，置于高速萬能粉碎機中粉碎，過60目篩，置于密封袋中，4℃保存備用。

（2）DESs的制備。采用加熱攪拌的方法制備DESs[17]，制備步驟如下：將HBA與HBD按一定的摩爾比混合后，加入適量的水，置于80～90℃的磁力攪拌器中連續攪拌約3h，攪拌至形成均勻穩定的透明液體，即低共熔溶劑，制備好的DESs保存在干燥皿中儲存備用。

（3）咖啡果皮可溶性膳食纖維的綠色制備。

參考CHEN等[18]的實驗方法并略作修改，采用超聲輔助低共熔溶劑提取咖啡果皮可溶性膳食纖維：準確稱取3.0g咖啡果皮粉于燒杯中，按照液固比20∶1（mL/g）加入DESs溶劑攪拌均勻，置于超聲設備中，功率300W（頻率20～25KHz，變幅桿Φ12mm），超聲30min后，5000r/min離心10min，分離上清液，真空濃縮至原體積的1/4后，加入4倍體積無水乙醇醇沉5h，將混合物5000r/min離心10min，收集沉淀物，用無水乙醇反復洗滌，真空冷凍干燥，得咖啡果皮可溶性膳食纖維，置于干燥器中保存備用。

超聲輔助水提法提取咖啡果皮可溶性膳食纖維的方法同上，略作修改。

1.2.2DESs的篩選為確定最佳提取溶劑，本研究對8種不同類型的DES進行SDF提取效果的評價。以不同的有機酸、多元醇和尿素與氯化膽堿的混合，在摩爾比和DES體系含水量固定的條件下，分別合成了1種尿素基DES（DES-1）、4種酸基DESs（DES-2、DES-3、DES-4和DES-8）、3種醇基DESs（DES-5、DES-6和DES-7），詳見表1。相比于常規溶劑，由于DESs的不同組分之間的氫鍵、范德華力和靜電相互作用使其具有更高的黏度[19]，為了提高提取效率，將所有不同的DESs體系添加質量分數30%的水。具體操作如下：稱取3.0g咖啡果皮粉于燒杯中，按液固比20∶1（mL/g），分別加入1.2.1（2）中制備好的DES，設置超聲功率300W、超聲時間30min的條件下提取咖啡果皮中的可溶性膳食纖維，計算咖啡果皮可溶性膳食纖維的得率。

1.2.3單因素實驗設計從1.2.2提取結果中選擇可溶性膳食纖維得率最高的DES體系進行實驗，將DES摩爾比、DES含水量、液固比、超聲功率、超聲時間分別設置為1∶2、30%、40mL/g、300W、30min進行提取，考察其他影響因素對SDF得率的影響。各因素設置如下：DES摩爾比（2∶1、1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5）、DES含水量（10%、20%、30%、40%、50%）、液固比（10、20、30、40、50mL/g）、超聲功率（100、200、300、400、500W）、超聲時間（10、20、30、40、50min）。

1.2.4響應面優化實驗在上述實驗結果的基礎上，采用響應面法和Box-Behnken模型設計對4個主要影響因素（X1：DES含水量、X2：液固比、X3：超聲功率、X4：超聲時間）進行優化，并將SDF得率作為響應指標，4個影響因素代碼水平的實驗設計分別為（–1、0和+1）和各變量的實際實驗值見表2。

1.3數據處理

采用SPSS24.0軟件（IBMCorporation，NewYork，NY）進行統計學分析，采用Origin2018軟件（Northampton，MA，USA）進行制圖，BBD的分析使用Design-Expert12軟件（Stat-Ease，Minneapolis，MN）進行回歸分析和圖形優化。所有實驗均重復3次。

2結果與分析

2.1DES的篩選

由于不同的DES在極性、溶解度、黏度、表面張力和物理化學等方面存在差異，導致分子間作用強度不同，使其對目標提取物的提取效率不同[20]。由圖1可知，不同類型DESs溶劑對咖啡果皮SDF得率具有顯著性差異，其中DES-1（氯化膽堿/尿素）組成的DES體系SDF得率最高，為10.10%，顯著高于傳統溶劑水提法，其次為有機酸基DESs，醇基DESs提取效果較差。故確定氯化膽堿與尿素進行后續實驗。

2.2單因素實驗

2.2.1氯化膽堿/尿素摩爾比對咖啡果皮SDF得率的影響HBA/HBD摩爾比是影響DESs理化性質的重要因素，HBD的比例越高，黏度越小。但當HBD比例過高時，不容易形成DESs[21]。由圖2可知，咖啡果皮SDF得率隨摩爾比的增大呈先增大后減小，當氯化膽堿/尿素的摩爾比為1∶2時，SDF得率最高，為9.87%，這可能是由于HBD的增加，使DES黏度和表面張力降低，有利于SDF的傳質和溶出，導致SDF得率提高；當摩爾比繼續增大時，SDF得率反而降低，這可能是因為不同的摩爾比使DES體系的黏度和表面張力不同，過高的摩爾比反而會弱化溶劑與目標物的相互作用[22]。故確定摩爾比1∶2進行后續實驗。

2.2.2DES含水量對咖啡果皮SDF得率的影響由于大多數DESs的黏度很高，過高的黏度會導致質量傳遞的速度緩慢，溶劑的萃取速率降低，所以通過含水量來調節DESs的黏度和極性[23-24]，但最佳含水量也與特定的化合物有關。由圖3可知，DES含水量在10%～40%之間時，SDF得率逐漸增大，可能是由于在DES中加入適量水，增加了DES分子流動性，降低了黏度，增加了擴散能力，使其能夠與咖啡果皮SDF充分接觸，SDF溶解度增大，當DES含水量為40%時SDF得率最大，為10.35%；但當DES含水量繼續增大時，過量的水可能限制了SDF與DES組分之間的相互作用，使SDF在DES中的溶解度大大降低，從而導致SDF提取效率下降[25]。故選擇DES含水量40%進行后續實驗。

2.2.3液固比對咖啡果皮SDF得率的影響由圖4可知，隨著液固比的增加，SDF得率顯著提高，當液固比為30mL/g時，SDF得率最高，為10.79%，但隨著液固比繼續增大，SDF得率逐漸降低。因為過低或過高的液固比會導致萃取不充分，或者隨著溶液用量的增加而增加不必要的消耗[26]。故選擇固液比30mL/g進行后續實驗。

2.2.4超聲功率對咖啡果皮SDF得率的影響由圖5可知，隨超聲功率的增大，SDF得率先逐漸增大，超聲功率在300W時，SDF得率最高，為10.64%；這可能是由于超聲波的空化效應、機械效應和熱效應增強，原料細胞被破壞，加快了胞內物質的釋放，并且強化了溶質擴散，促進了目標物質的溶出[27]；超聲功率在300～500W時，SDF得率減小，可能是因為超聲功率強度增加時，空化效應限制了聲波在萃取介質中的循環，給系統提供了不可控的機械剪切。此外，超聲功率過高，破壞了物料中已釋放的可溶性成分，使其進一步分解為小分子物質而無法被乙醇沉淀[28]。故選擇超聲功率300W進行后續實驗。

2.2.5超聲時間對咖啡果皮SDF得率的影響由圖6可知，在10～30min時，SDF得率隨時間的延長而增加。超聲30min得率最高，為10.63%；但當時間超過30min后，SDF得率下降。其原因可能是細胞內外SDF濃度在30min前未達到平衡。隨著時間的增加，SDF逐漸溶解，當細胞內外達到平衡狀態時，提取溶劑中SDF的濃度不再增加，達到平衡后，SDF由于結構不穩定，在超聲的作用下發生水解[29-30]。

2.3響應面試驗優化

2.3.1試驗設計與結果分析根據2.2結果分析，確定氯化膽堿/尿素的摩爾比為1∶2，以DES含水量、液固比、超聲功率和超聲時間作為主要影響因素，SDF得率（Y）為響應值，進行響應面優化實驗，Box-Behnken試驗設計與結果見表3。

2.3.2回歸模型顯著性檢驗及方差分析采用Design-Expert12對BBD獲得的實驗數據進行回歸分析，得到DES含水量、液固比、超聲功率、超聲時間對響應值Y的二次多項式回歸方程如下：Y=–48.44181+1.60843X1+0.669012X2+0.054241X3+0.469143X4–0.005016X1X2–0.000054X1X3–0.004544X1X4–0.000210X2X3+0.002862X2X4+0.000262X3X4–0.016000X12–0.007701X22–0.000087X32–0.006849X42。

由表4可知，模型P<0.0001，F值為125.42，失擬項差異不顯著，證實了模型的高度顯著性。擬合優度可以通過確定系數（R2）、調整確定系數（RAdj2）和方差系數（CV）來驗證。確定系數（R2=0.9932）和調整后的確定系數（RAdj2=0.9853）表明該模型證實了模型的高度擬合優度。同時，CV值為1.23，顯示了數據極好的可靠性。模型的有效性較低證實了回歸模型實驗值的準確性和可靠性。P值不僅揭示了各系數的顯著性，而且解釋了自變量的相互作用模式。一次項和二次項X1、X2、X3、X4、X12、X22、X32、X42對SDF得率的影響極顯著（P<0.01）；交互項X1X2、X1X4、X2X3、X2X4、X3X4極顯著（P<0.01），說明DES含水量和液固比、DES含水量和超聲功率、液固比和超聲功率、液固比和超聲時間、超聲功率和超聲時間之間的交互作用對SDF得率的影響較強；其余因子影響不顯著。根據表4中各因子的P值和F值可知，各因子對SDF得率影響大小為：超聲時間>液固比>DES含水量>超聲功率。

2.3.3響應面結果分析基于模型的3D響應面圖，通過超聲輔助DES提取SDF的得率顯然與主要變量相關。3D響應面圖反映了各因素對SDF得率的相互影響。如圖7～圖11所示，DES水含量與液固比、DES含水量與超聲時間、液固比與超聲功率、液固比和超聲時間、超聲功率與超聲時間對得率有顯著的正向影響。響應等高線圖顯示了各因素對SDF得率的顯著性，且等高線圖趨于橢圓形，說明交互作用顯著；圖12響應曲面較平緩，且等高線圖趨于圓形，說明DES含水量與超聲功率的交互作用對SDF得率不顯著，這與方差分析結果一致。

2.3.4預測模型驗證實驗由圖13A可知，殘差正態分布圖的點接近直線，表明其滿足了正態性假設；由圖13B可知，殘差隨機分散，表明觀察的原始方差對所有值都是確定的；由13圖C可知，實驗預測值與實際值之間的誤差較小。因此，該模型可預測響應面的提取得率。

使用DesignExpert12軟件分析，確定提取咖啡果皮SDF得率最大的提取條件：DES含水量為39.91%，液固比為32.37mL/g，超聲功率為305.20W，超聲時間為33.80min，在此條件下提取咖啡果皮SDF的得率可達到理論最大值10.80%。考慮到實際操作和儀器的可行性，將最佳提取工藝參數分別修改為X1=40%、X2=32mL/g、X3=305W、X4=34min，利用改進后的提取參數重復實驗3次，SDF得率為10.74%±0.14%，與模型預測值10.80%接近，說明該模型適用于超聲輔助DESs法提取咖啡果皮SDF的優化。

3討論

本研究初步探索采用超聲輔助DES法制備咖啡果皮SDF的綠色新方法。通過單因素試驗和響應面優化試驗，確定了最佳的制備條件，結果表明，UAE-DES法提取得率為10.74%±0.14%，顯著高于傳統水提法6.50%±0.22%。DONG等[31]研究了不同提取方法（化學法、酶法、化學-酶法、超聲輔助酶法和剪切乳化輔助酶法）對咖啡皮SDF的理化、結構和功能特性的影響。結果表明，剪切乳化輔助酶法提取SDF的得率最高（13.96%），其次是超聲輔助酶法（13.04%）、酸-酶法（11.38%）和酶法（9.54%），酸提取的得率最低（9.16%）。與本研究結果相比，復合法（物理結合酶法）中，雖然部分方法提取SDF的得率高于UAE-DES法，但酶法提取的條件要求比較嚴格，且生產成本較高，而UAE-DES法提取有諸多優點，如成本低、簡單易得、安全、可生物降解、具有可設計性等，而且可從不同的食品基質中提取化學成分，滿足了現代加工對環境友好的需求。WANG等[32]采用天然低共熔溶劑（NADES）結合超聲輔助酶解（UAEE）提取柴胡多糖，結果表明，最佳DES體系為摩爾比為1∶3的尿素與氯化膽堿，其含水量為20%，這與本研究的最佳DES體系一致；CHEN等[15]采用超聲輔助天然低共熔溶劑提取芒果皮中的果膠，篩選了甜菜堿-檸檬酸和氯化膽堿-蘋果酸2種新型綠色溶劑，并通過單因素試驗和響應面試驗進一步優化提取條件，結果表明，2種DES提取的果膠含量顯著高于鹽酸提取的果膠含量。由于不同物質本身的結構和組成不同，因此，DES與目標物質間的相互作用力不同，故篩選出的最佳DES不同，基于上述文獻表明，不同物質在結構和組成方面的差異，使得DES與目標物質間的相互作用力不同，進而篩選得到的最佳DES不同。但UAE-DES法在提取食品功能性成分方面依然存在巨大潛力。然而，DES的高黏度仍是提取過程中最主要的缺點，如何降低DES黏度是今后研究的重點，同時明確HBA與HBD的選擇，使其提取優勢最大化，最終為生物活性物質的提取和食品分析預處理等方面提供更多的選擇。因此，本研究為咖啡果皮SDF的提取提供了一種綠色、經濟、環保的替代方法，為SDF的綠色提取提供了新思路，在未來設計使用咖啡副產品的功能性食品配方時具有重要意義。