芪冬活血飲通過干擾素調節因子5抑制肺組織M1 巨噬細胞募集治療急性肺損傷的作用機制研究

王維斯 陳 曄 張麗婷 凌明珠 馬兆娟 葉柏春

急性肺損傷（acute lung injury，ALI）是由多種致病因素引起的臨床綜合征，包括急性肺炎、敗血癥、嚴重創傷和急性胰腺炎等，該綜合征最初以肺部炎癥和微血管通透性為特征，最終發展為急性呼吸窘迫綜合征[1]。盡管機械通氣改善了患者預后，但急性呼吸窘迫綜合征的死亡率仍高達35%～55%，缺乏有效的治療會使病情進一步惡化[2]。臨床研究表明，芪冬活血飲對ALI 有良好的治療效果[3]。芪冬活血飲由黃芪、麥冬、虎杖、當歸、大黃共五味藥物組成，以清熱解毒、祛瘀通腑、益氣養陰為治療原則，具有抗炎、抗肺水腫等多種作用[4]。然而，其在ALI 治療過程中發揮作用的分子機制尚未明確。因此，本研究使用脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）誘導ALI 小鼠模型，以探究芪冬活血飲對抑制肺組織M1 巨噬細胞募集從而治療ALI 的作用及其分子機制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 芪冬活血飲：黃芪20 g，麥冬12 g，虎杖20 g，當歸12 g，大黃9 g，購自浙江中醫藥大學附屬第二醫院中藥房（浙江天道醫藥有限公司）。藥材用8 倍水浸泡30min，將煎得藥汁濃縮至含生藥1 g/mL和2 g/mL 藥汁，分裝滅菌后低溫保存。

PBS 緩沖液（批號72013561）、二甲苯（批號40091060）、乙醇（批號100092008）購自國藥集團化學試劑有限公司；蘇木精（批號G1080）、伊紅（批號G1100）購自索萊寶生物科技有限公司；小鼠腫瘤壞死因子α（TNF-α）（批號PMTA00B）、白細胞介素6（IL-6）（批號M6000B-1）、白細胞介素1β（IL-1β）（批號MLB00C）酶聯免疫吸附試驗（ELISA）試劑盒購自美國R&D System 公司；原位末端轉移酶標記技術（TUNEL）試劑盒（批號40306ES50）購自翌圣生物科技（上海）股份有限公司；TRIzol 試劑（批號15596026）、HiFiScript cDNA 合 成 試 劑 盒（批 號CW2569）、SYBR Green PCR Matser Mix （批 號CW0955）購自北京康為世紀生物科技有限公司；放射免疫沉淀法緩沖液（RIPA）（批號P0013B）、BCA 蛋白測定試劑盒（批號P0009）、TBST（批號ST673）、增強型化學發光法（ECL）顯影液（批號P0018M）購自碧云天生物技術有限公司；牛血清蛋白（BSA）（批號V900933） 購自美國Sigma 公司；氨水（批號M10542301）、中性樹脂（批號M10086901）購自國藥集團化學試劑有限公司。實驗所用干擾素調節因子5（IRF5）引物購自上海生工生物工程有限公司，引物序列：Forward 5'-CAGTGGG-TCAACGGGGAAAA GAAAC-3'；Reverse 5'-CTTTA-GCCCAGGCCTTGAAGATGG-3'。實驗所用抗體：流式抗體PE-CD11c（批號#117307）、FITC-CD206（批號#141706）購自BIOLEGEND（北京）生物科技有限公司；蛋白質免疫印跡抗體：半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3 剪切體（cleaved caspase3）（批 號ab214430）、B 淋 巴 細 胞瘤-2 蛋白（Bcl-2）（批號ab182858）、BCL2 相關X 蛋白（Bax）（批號ab32503）、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）（批號ab9485）和羊抗兔免疫球蛋白（IgG）（批號ab150077）購自美國Abcam 公司。免疫熒光抗體：IRF5（批號ab181553）、羊抗兔IgG H&L（批號ab150077）購自美國Abcam 公司。

1.2 主要儀器 EG1150H 組織包埋機、RM2235 組織切片機購于上海徠卡儀器有限公司；C2500-R-230V 型微型高速離心機購于Labnet 公司；Multiskan MK3 型全自動酶標儀購于Thermo scientific 公司；ChemiDocTMXRS+凝膠成像系統為Bio-rad 公司產品；UltraVIEW VoX& IX81 激光共聚焦顯微鏡成像系統及BX53 正置熒光顯微鏡均購于Olympus 公司；NanoDrop 2000 型超微量分光光度計購于Thermo公司。

1.3 動物模型

1.3.1 實驗動物 24 只8 ～10 周齡野生型雄性C57BL/6 小鼠購自杭州醫學院實驗動物中心[許可證號：SYXK（浙）2019-0011]。在SPF 級環境中，將小鼠置于12∶12 h 明暗循環下，給予標準飲食和自由飲水。所有涉及動物的程序均獲得浙江省實驗動物中心實驗動物福利倫理委員會批準（倫理批號：ZJCLAIACUC-20040158）。

1.3.2 分組與造模 將24 只小鼠，按照隨機數字表法分為四組：空白組、模型組、芪冬活血飲低劑量組和芪冬活血飲高劑量組，每組6 只。通過鼻內滴入LPS（5 mg/kg，溶于50 μL 生理鹽水）誘導ALI[5]。空白組小鼠鼻內滴入等量生理鹽水。

1.3.3 給藥方式[6]芪冬活血飲低劑量組和芪冬活血飲高劑量組：誘導ALI 前4 d、誘導ALI 當日及誘導ALI 次日分別以1 g/mL 和2 g/mL 濃度芪冬活血飲每日灌胃0.2 mL，共計6 次；空白組和模型組每日灌胃0.2 mL 生理鹽水，共計6 次。

1.3.4 動物組織取材與處理 所有小鼠末次灌胃2 h后安樂死，打開胸腔，右肺用于肺泡灌洗液制備：右肺注入1 mL 生理鹽水，輕輕按摩右肺30 s，抽回右肺內液體，間隔10 min 反復3 次，回收液體3000 r/min離心10 min，取上清。取1/3 左肺，10%多聚甲醛固定24 h，石蠟包埋切片進行后續實驗。剩余肺組織-80 ℃保存，用于實時熒光定量聚合酶鏈式反應（qRT-PCR）和流式細胞術測定。

1.4 蘇木素-伊紅（HE）染色[7]HE 染色觀察各組小鼠肺組織形態。將肺組織切片，二甲苯脫蠟，100%、90%和70%梯度乙醇水合。然后用蘇木精染色7 min，用95%乙醇水化5 s。隨后將切片在氨水中浸泡30 s，直至呈藍色。切片用伊紅染色約1 min，100%、95%、75%、50%梯度乙醇水合2 次（每次2 min），二甲苯漂洗2 次（每次5 min）。中性樹脂封片后，顯微鏡下觀察不同肺組織的組織病理學改變。

1.5 ELISA 采用小鼠IL-6、IL-1β、TNF-α ELISA試劑盒檢測小鼠支氣管肺泡灌洗液中IL-6、IL-1β、TNF-α 的水平。按照試劑盒說明書進行檢測。采用全自動酶標儀測定450 nm 處吸光度值。

1.6 原位末端轉移酶標記技術（TUNEL） 將各組小鼠肺組織切片與蛋白酶K 孵育后根據TUNEL 檢測試劑盒說明書進行操作。用熒光共聚焦顯微鏡觀察樣本。

1.7 流式細胞術 用抗表面蛋白的抗體對各組小鼠肺組織細胞進行免疫標記。收集各組小鼠肺組織，剪碎后加入0.5%膠原蛋白酶和0.25%胰酶，37 ℃孵育1 h。將肺組織細胞懸液離心、漂洗、重懸后，4 ℃與PE-CD11c 和FITC-CD206 抗體避光孵育30 min，然后用PBS 洗滌。采用流式細胞儀采集數據，采用FlowJo 軟件進行分析。

1.8 qRT-PCR 使用TRIzol 試劑從各組小鼠肺組織中提取總RNA。根據HiFiScript cDNA 合成試劑盒的說明書，等量的RNA 在八聯管中逆轉錄。采用SYBR Green PCR Matser Mix 進行實時聚合酶鏈反應。

1.9 蛋白質免疫印跡 使用含有蛋白酶抑制劑混合物的RIPA 緩沖液提取總蛋白。BCA 蛋白測定法測定蛋白濃度。總蛋白（30 μg）通過SDS-PAGE 分離，并濕轉至PVDF 膜上。在TBST 中用5%BSA 封閉后，與特異性一抗在4 ℃孵育過夜，隨后，將膜分別與HRP 標記的山羊抗兔IgG 在室溫下孵育1 h。使用ECL 試劑顯影，并在ECL 成像系統上檢測信號。

1.10 免疫熒光檢測 各組小鼠肺組織切片脫蠟水合后，在3%BSA 中封閉1 h，然后與特異性IRF5 抗體反應過夜。隨后用Alexa Fluor 488 山羊抗兔IgG避光孵育1 h。用PBS 洗滌后，切片用DAPI 染色10 min，用PBS 洗滌，并添加抗熒光猝滅劑，然后安裝到顯微鏡載玻片上，中性樹脂封片。使用激光共聚焦顯微鏡對切片進行觀察。

1.11 統計學方法 應用GraphPad Prism 8.0 軟件進行圖形和統計學分析。計量資料均符合正態分布，以均數±標準差（±s）表示。兩組間比較采用獨立樣本t 檢驗。P＜0.05 認為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 芪冬活血飲對小鼠肺組織病理的影響 對各組小鼠肺組織進行HE 染色，結果見圖1。空白組肺泡結構清晰完整，偶見部分部位較少炎性細胞。模型組大部分肺泡壁增寬伴水腫，肺泡腔塌陷，肺泡壁及肺泡腔內可見大量炎癥細胞浸潤及紅細胞滲出。經芪冬活血飲治療后，低劑量組小鼠肺泡壁稍增寬，炎癥細胞浸潤、紅細胞滲出癥狀減輕。高劑量組小鼠肺組織損傷情況較模型組更顯著，較低劑量組更輕。這說明芪冬活血飲能促進小鼠恢復LPS 誘導的ALI。

2.2 芪冬活血飲抑制小鼠肺組織細胞凋亡 對各組小鼠肺組織切片進行TUNEL 染色，模型組熒光強度顯著高于空白組，芪冬活血飲低劑量組和高劑量組小鼠肺組織熒光強度顯著低于模型組，且高劑量組熒光強度低于低劑量組（見圖2A）。同時，提取各組小鼠肺組織總蛋白，使用蛋白質免疫印跡實驗檢測凋亡相關蛋白表達情況，顯影結果顯示，促凋亡蛋白cleaved caspase3、Bax 在模型組中表達量顯著高于空白組，凋亡抑制蛋白Bcl-2 在模型組中表達量顯著低于空白組；與模型組比較，芪冬活血飲低劑量組和高劑量組中cleaved caspase3、Bax 蛋白表達量均顯著低于模型組、Bcl-2 表達量均顯著高于模型組，且高劑量組中cleaved caspase3、Bax 表達量較低劑量組更低、Bcl-2 表達量較低劑量組更高（見圖2B）。以上結果說明芪冬活血飲能抑制小鼠肺組織細胞凋亡。

圖1 芪冬活血飲對小鼠肺組織形態的影響（HE 染色，×400）注：芪冬活血飲低劑量組每日灌胃1 g/mL 芪冬活血飲0.2 mL；芪冬活血飲高劑量組每日灌胃2 g/mL 芪冬活血飲0.2 mL；空白組和模型組每日灌胃生理鹽水0.2 mL

2.3 芪冬活血飲抑制小鼠肺組織炎癥反應 使用ELISA 檢測各組小鼠肺泡灌洗液中炎癥因子的表達情況。模型組中IL-6、IL-1β、TNF-α 表達量均顯著高于空白組（P＜0.01），芪冬活血飲低、高劑量組中IL-6、IL-1β、TNF-α 表達量均顯著低于模型組（P＜0.05 或P＜0.01），且呈劑量依賴，見表1。

2.4 芪冬活血飲抑制M1 巨噬細胞極化和募集 流式細胞術檢測CD11c 和CD206 標志物，以判斷小鼠組織中M1 巨噬細胞的極化和募集情況。模型組中M1 巨噬細胞占比顯著高于空白組，芪冬活血飲低、高劑量組小鼠肺組織中M1 巨噬細胞占比均顯著低于模型組，且高劑量組中M1 巨噬細胞占比低于低劑量組，見圖3。

2.5 芪冬活血飲抑制IRF5 的表達 使用qRT-PCR和免疫熒光分別檢測IRF5 mRNA 和蛋白表達情況。qRT-PCR 結果顯示，模型組中IRF5 mRNA 表達顯著高于空白組（P＜0.01），芪冬活血飲低、高劑量組中IRF5 mRNA 表達量顯著低于模型組，且呈劑量依賴（P＜0.05 或P＜0.01）（見表2）。免疫熒光結果顯示，各組小鼠肺組織切片中IRF5 蛋白表達與mRNA 表達趨勢一致，見圖4。

3 討 論

圖2 芪冬活血飲抑制小鼠肺組織中細胞凋亡

表1 各組小鼠肺泡灌洗液炎癥因子表達情況（pg/mL，±s）

表1 各組小鼠肺泡灌洗液炎癥因子表達情況（pg/mL，±s）

注：芪冬活血飲低劑量組每日灌胃1 g/mL 芪冬活血飲0.2 mL；芪冬活血飲高劑量組每日灌胃2 g/mL 芪冬活血飲0.2 mL；空白組和模型組每日灌胃生理鹽水0.2 mL；IL-6 為白細胞介素-6；IL-1β 為白細胞介素-1β；TNF-α 為腫瘤壞死因子α；與空白組比較，aP＜0.01；與模型組比較，bP＜0.05，cP＜0.01

組別空白組模型組芪冬活血飲低劑量組芪冬活血飲高劑量組鼠數6666 IL-6 83.24±8.19 964.87±85.12a 817.56±63.49b 529.45±45.67c IL-1β 10.37±2.98 127.64±10.98a 83.84±7.69c 64.28±7.06c TNF-α 12.19±2.01 148.74±13.98a 117.22±12.30b 72.69±8.44c

中醫認為，ALI 病因可歸于“熱、毒、痰、瘀”，發病于肺，多由邪毒、創傷等引發，以致肺氣虛損、肺失宣降、氣機阻滯。因此中醫往往遵循“清熱解毒、祛痰化瘀”之方劑來治療ALI[8]。芪冬活血飲主要由黃芪20 g，麥冬12 g，虎杖20 g，當歸12 g，大黃9 g 組成，其中黃芪益氣固表、補益脾肺、斂瘡生肌；麥冬補氣養陰、益胃生津；虎杖清熱解毒、活血化瘀；當歸味甘性溫、補血活血；大黃蕩滌胃腸、攻下瀉火、清熱解毒、安和五臟。全方配伍益氣扶正，活血化瘀，標本兼顧[9-10]。多項研究表明，芪冬活血飲對ALI 有良好的治療效果，如芪冬活血飲通過調控巨噬細胞細菌LPS 的受體Toll 樣受體4（TLR4）/核因子κB（NF-κB）炎性信號通路從而影響ALI[11]；芪冬活血飲還可基于窖蛋白-1（Cav-1）/NF-κB 炎性反應信號通路治療ALI 模型大鼠[12]等。在本研究中，芪冬活血飲對ALI 模型小鼠也呈現良好的治療效果，對模型小鼠肺組織恢復有顯著幫助，這與前人研究結果一致。

圖3 流式細胞術檢測芪冬活血飲抑制M1 巨噬細胞極化和募集

大量研究表明，ALI 過程與細胞凋亡相關：桑黃酚A（Hispolon）通過調節TLR4/磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）/蛋白激酶B（Akt）/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）和Kelch 樣ECH 關聯蛋白1（Keap1）/核因子紅細胞2 相關因子2（Nrf2）/血紅素加氧酶1（HO-1）通路，抑制氧化應激介導的內質網應激誘導的細胞凋亡和自噬，減輕脂多糖誘導的小鼠ALI[13]；線粒體定向輔酶Q（MitoQ）通過調控Nrf2/線粒體動力相關蛋白1（Drp1）通路抑制細胞凋亡減輕LPS 介導的ALI[14]；秋水仙堿通過抑制炎癥、細胞凋亡和氧化應激改善重癥急性胰腺炎大鼠ALI[15]。也有一些證據表明，在ALI 發生和發展過程中，M1 巨噬細胞極化和募集起到了關鍵作用：中性粒細胞外泌體miR-30d-5p 誘導M1 巨噬細胞極化并引發巨噬細胞焦亡，加劇膿毒癥相關ALI[16]；偽麻黃堿聯合大黃素通過血管活性腸肽（VIP）/環腺苷酸（cAMP）/蛋白激酶A（PKA）通路調節巨噬細胞M1/M2 極化，改善LPS 誘導的ALI[17]；褪黑素通過激活載脂蛋白E（ApoE）/低密度脂蛋白受體（LDLR）途徑抑制甲型流感ALI 中巨噬細胞M1極化和活性氧（ROS）介導的焦亡[18]。在本研究中，我們同樣也觀察到，隨著ALI 的改善，細胞凋亡水平下降，M1 巨噬細胞占比下降，提示芪冬活血飲可能通過調控細胞凋亡和M1 巨噬細胞募集的途徑來緩解小鼠ALI。

表2 各組小鼠肺組織IRF5 mRNA 表達情況（±s）

表2 各組小鼠肺組織IRF5 mRNA 表達情況（±s）

注：芪冬活血飲低劑量組每日灌胃1 g/mL 芪冬活血飲0.2 mL；芪冬活血飲高劑量組每日灌胃2 g/mL 芪冬活血飲0.2 mL；空白組和模型組每日灌胃生理鹽水0.2 mL；IRF5 為干擾素調節因子5；與空白組比較，aP＜0.01；與模型組比較，bP＜0.05，cP＜0.01

組別空白組模型組芪冬活血飲低劑量組芪冬活血飲高劑量組鼠數6666 IRF5 mRNA 相對表達量0.98±0.09 3.67±0.34a 2.59±0.27b 1.67±0.19c

IRF5 可能與巨噬細胞M1 極化和細胞凋亡相關。有報道顯示，IKAROS 家族鋅指蛋白1（IKZF1）-IRF4/IRF5 軸調控骨髓瘤相關巨噬細胞的極化[19]；槲皮素通過影響NF-κB p65 和IRF5 活性調節M1/M2巨噬細胞極化改善腎損傷和纖維化[20]；IRF5 參與其他信號通路，包括B 細胞中的IgG 轉換、巨噬細胞極化和凋亡，從而影響系統性紅斑狼瘡的進展[21]；IRF5的缺失可保護造血干細胞免受DNA 損傷誘導的凋亡，并抑制γ 輻照誘導的胸腺淋巴瘤發生[22]。僅有極少數研究探討了IRF5 在ALI 中的作用：IRF5 siRNA負載葉酸修飾的陽離子脂質體可用于ALI 治療[23]；IRF5 促進巨噬細胞M1 極化，IRF5 阻斷可以改善包括肺損傷在內的急性炎癥[24]。在本研究中，ALI 模型小鼠肺組織中IRF5 表達顯著升高（P＜0.01），經過芪冬活血飲治療后小鼠肺組織中IRF5 表達顯著降低（P＜0.05 或P＜0.01），提示芪冬活血飲可能通過調控IRF5 影響細胞凋亡和巨噬細胞M1 極化，最終緩解ALI 癥狀。

綜上所述，芪冬活血飲在ALI 治療中具有良好的效果和應用前景。本研究通過LPS 誘導的小鼠ALI 模型，發現芪冬活血飲可能通過IRF5 抑制肺組織M1 巨噬細胞募集和細胞凋亡，從而治療ALI。但是IRF5 相關的芪冬活血飲治療ALI 的具體分子機制及量效關系值得更深入的研究。

圖4 免疫熒光檢測各組小鼠肺組織中IRF5 蛋白表達情況