炙甘草湯通過miR-181a-5p 靶向SPHK2 調控心肌纖維化改善糖尿病心肌病

王天宇 丁君燦 程心怡 胡鵬飛

糖尿病心肌病（diabetic cardiomyopathy，DCM）是糖尿病心血管系統的獨立并發癥，全球每年超400萬人死于糖尿病，其中DCM 死亡人數占比50%～80%[1]，給社會帶來沉重負擔。目前，臨床上尚無有效的特異性治療方法。近年來，中藥在治療DCM 方面具有療效獨特和毒副作用小等優勢，廣泛受到國內外關注[2]。因此，探討中藥改善DCM 的機制具有一定的應用價值。中藥傳統方劑炙甘草湯源自漢代張仲景《傷寒論》，主治病證的病位在心，以補陰為主[3]。炙甘草湯能顯著改善DCM 患者心功能，緩解臨床癥狀，提高患者生活質量，且無明顯不良反應[4]。據文獻報道，炙甘草湯的主要成分為麥冬總皂苷、人參總皂苷和甘草酸，具有改善DCM 患者心功能的作用[5]。本研究建立了DCM 大鼠模型用于探究炙甘草湯對心肌成纖維細胞的作用，并深入分析炙甘草湯在DCM中的藥理調控機制。

1 實驗材料

1.1 實驗動物 7～8 周齡、體質量160～180 g 雄性Sprague Dawley（SD）大鼠30 只；出生3～5 d、體質量5～10 g SD 大鼠乳鼠10 只，購自杭州醫學院實驗動物中心，生產許可證號：SCXK（浙）2019-0002，使用許可證號：SYXK（浙）2019-0011。所有大鼠均飼養于清潔級動物房內（溫度18～25 ℃，相對濕度60%～70%），自動控制光照/黑暗交替（12 h/12 h），雄性SD大鼠在動物中心飼喂大鼠標準飼料1 周以適應環境。本實驗已獲得浙江省實驗動物中心實驗動物福利倫理委員會批準（倫理批號：ZJCLA-IACUC-20030098）。

1.2 藥物與試劑 炙甘草湯由炙甘草12 g，生姜、桂枝各9 g，人參6 g，生地50 g，阿膠（后烊化）6 g，麥冬、麻仁各10 g，大棗10 枚組成，藥材均購于浙江中醫藥大學附屬第二醫院中藥房。鏈脲佐菌素（STZ，批號S8050）、檸檬酸鈉緩沖液（批號C1013）、4%多聚甲醛（批號P1110）、HE 染色試劑盒（批號G1120）、Masson 染色試劑盒（批號G1340）、BCA 試劑盒（批號PC0020）、M-MLV 逆轉錄酶（批號RP1100）、細胞計數試劑盒8（CCK-8）試劑盒（批號CA1210）和雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒（批號D0011）購于北京Solarbio 公司；miRNA 逆轉錄試劑盒（批號B532451）、實時熒光定量聚合酶鏈式反應（qRT-PCR）試劑盒（批號B639278）和引物購于上海生工生物工程有限公司；波形蛋白（Vimentin，批號46173SF）、α-SMA（批號19245T）、Ⅰ型膠原蛋白（CollagenⅠ）（批號81375SF）、Ⅲ型膠原蛋白（CollagenⅢ）（批號98908SF）、鞘氨醇激酶2（SPHK2）（批號32346S）、β-actin（批號3700T）和IgG/HRP（批號7074S）購于美國Cell Signaling Technology 公司；miRNA-NC、miR-181a-5p 模擬物和miR-181a-5p 拮抗劑由上海GenePharma 公司設計。

1.3 主要儀器 實時熒光定量PCR 儀（德國羅氏公司，型號LightCycler 96）；倒置熒光顯微鏡（日本奧林巴斯公司，型號AI09）；石蠟組織切片機（德國Leica 公司，型號RM2125）；化學發光儀（上海勤翔公司，型號610020-9Q）；酶標儀（美國熱電公司，型號MK3）。

2 實驗方法

2.1 分組與DCM 大鼠模型制備 雄性SD 大鼠30只，10 只大鼠作為對照組；20 只通過高糖高脂飲食聯合腹腔注射STZ 構建DCM 大鼠模型，造模后按隨機數字表法分成DCM 組、炙甘草湯組。對照組給予正常飲食，DCM 組和炙甘草湯組給予高糖高脂飲食4 周后，單次腹腔注射STZ（40 mg/kg）誘導建立糖尿病模型并于注射后7 d 測定空腹血糖（FBG），FBG≥16.7 mmol/L 視為Ⅱ型糖尿病模型造模成功。至STZ注射后8 周按分組進行灌胃給藥，炙甘草湯組每日給予2 mL/100 g 炙甘草湯（1 g/mL）灌胃，DCM 組和對照組大鼠每日給予相同體積的生理鹽水灌胃，連續4 周，每天1 次。灌胃給藥結束后對照組大鼠全部存活，DCM 組大鼠存活6 只，炙甘草湯組大鼠存活7只，每組各選取6 只大鼠進行后續實驗。

2.2 HE 染色 大鼠心臟經4%多聚甲醛溶液固定，石蠟包埋制成4 μm 心肌組織切片。經二甲苯脫蠟和梯度乙醇復水后進行HE 染色，再通過梯度乙醇、二甲苯脫水和中性樹脂膠封片。最后在顯微鏡下觀察并拍照。

2.3 Masson 染色 大鼠的心肌組織石蠟切片通過二甲苯脫蠟和梯度乙醇復水后，鐵蘇木素染液染色10 min、Masson 復合染液染色5 min、麗春紅染色5 min、磷鉬酸溶液洗2 min 和苯胺藍染液染色2 min。最后在顯微鏡下觀察并收集圖片。

2.4 心肌成纖維細胞分離、分組及藥物處理 取出生3～5 d 的SD 大鼠乳鼠，75%乙醇滅菌2 次，無菌條件下取心臟組織，剪碎。用0.08%胰蛋白酶（含0.06%膠原酶Ⅰ）在37 ℃水浴中消化15 min。加入等量的含20%胎牛血清的DMEM 培養基終止消化后取上清，在37 ℃的恒溫環境下重復5～10 次。以900 r/min離心10 min 棄除上清，收集細胞，重懸細胞。用細胞篩過濾后取上層清液，將過濾后的細胞再次離心后重懸，將重懸后的細胞置于37 ℃、5%CO2的細胞培養箱中，1.5～2 h 后換液，貼壁的即為心肌成纖維細胞。通過免疫熒光檢測Vimentin 的表達鑒定心肌成纖維細胞。將細胞分為以下幾組：對照組（5.5 mmol/L葡萄糖），高糖組（30 mmol/L 葡萄糖），炙甘草湯組（1 g/mL 炙甘草湯預處理心肌成纖維細胞1 h，高糖誘導），miRNA-NC 組（轉染miRNA-NC），miR-181a-5p 模擬物組（轉染miR-181a-5p 模擬物），miR-181a-5p 拮抗劑組（轉染miR-181a-5p 拮抗劑），炙甘草湯+miRNA-NC 組（轉染miRNA-NC，1 g/mL 炙甘草湯預處理心肌成纖維細胞1 h，高糖誘導），炙甘草湯+miR-181a-5p 拮抗劑組（轉染miR-181a-5p 拮抗劑，1g/mL 炙甘草湯預處理心肌成纖維細胞1 h，高糖誘導）。

2.5 免疫熒光染色 心肌成纖維細胞在室溫下用4%多聚甲醛固定30 min，0.3% Triton X-100 通透15 min，BSA 溶液封閉1 h。將心肌成纖維細胞與一抗Vimentin（1∶200）在4 ℃下孵育過夜。與兔抗鼠熒光二抗（1∶150）孵育1 h，PBS 清洗后DAPI 染核。最后，通過熒光顯微鏡收集圖像。

2.6 蛋白免疫印跡法（Western blot）檢測 裂解液處理大鼠心肌組織和心肌成纖維細胞，使用BCA 試劑盒進行蛋白質定量，蛋白質通過十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠（SDS-PAGE）分離并轉移到PVDF膜上。5%脫脂牛奶封閉，一抗（1∶1000）在4 ℃下孵育過夜。膜與二抗（1∶2000）在37 ℃下孵育60 min，并通過ECL 顯色獲得蛋白條帶。

2.7 qRT-PCR 檢測 提取大鼠心肌組織和心肌成纖維細胞的總RNA，利用miRNA 逆轉錄酶和MMLV 逆轉錄酶（Promega）逆轉錄成cDNA。通過熒光定量PCR 試劑盒進行qRT-PCR。引物如下：miR-181a-5p 正向：5′-CGAACATTCAACGCTGTCG-3′，反向：5′-AGTGCAGGGTCCGAGGTATT-3′；CollagenⅠ正向：5′-GTGCAGTCGGTGCTCCAG-3′，反向：5′-TTCTCCTTTGCCTCCAGGTATG-3′；CollagenⅢ正向：5′-CCTCTCTTATTTTGGCACAGCA-3′，反向：5′-TGACATGGTTCTGGCTTCCA-3′；U6 正向：5′-CGCAAGGATGACACGCAAAT-3′，反向：5′-GTGCA-GGGTCCGAGGTATTC-3′；β-actin 正向：5′-CCCATCTACGAGGGCTATGC-3′，反向：5′-TTTGATGTCACGCACGATTTC-3′。

2.8 CCK-8 檢測細胞活力 心肌成纖維細胞接種到96 孔板（3×103個/孔）中培養24 h。每孔加入CCK-8 溶液在37 ℃下培養2 h。使用酶標儀在450 nm 處檢測心肌成纖維細胞的吸光度（OD 值），實驗進行3次重復。

2.9 雙熒光素酶報告基因實驗檢測 將SPHK2 基因3′UTR 序列的野生型（WT-SPHK2） 和突變型（MT-SPHK2）克隆到基因載體pmirGLO 中，構建野生型和突變型的雙熒光素酶報告質粒載體。用雙熒光素酶報告基因實驗檢測試劑盒檢測心肌成纖維細胞WT-SPHK2 和MT-SPHK2 熒光素酶活性。

2.10 統計學方法 應用SPSS 22.0 軟件進行統計分析，符合正態分布的計量資料采用均數±標準差（±s）表示。兩組間比較，方差齊性者采用兩獨立樣本t 檢驗，方差不齊者采用Kruskal-Wallis H 檢驗。P＜0.05 表示差異有統計學意義。

3 結 果

3.1 DCM 大鼠模型構建 大鼠FBG 檢測結果表明，與對照組比較，DCM 組大鼠FBG 水平顯著升高[（30.40±3.48）mmol/L 比（5.08±0.17）mmol/L，P＜0.01]。HE 染色結果表明，對照組心肌細胞排列整齊、結構清晰，可見少量成纖維細胞；DCM 組大鼠心肌細胞肥大、排列紊亂、成纖維細胞增生伴炎癥細胞浸潤。以上結果表明，DCM 大鼠模型構建成功，見圖1。

圖1 大鼠心肌組織HE 染色（×200）

3.2 炙甘草湯改善DCM 模型大鼠心肌纖維化 大鼠心肌組織HE 染色結果表明，與DCM 組大鼠比較，炙甘草湯組心肌組織的病理改變得到了改善。Masson 染色觀察心肌纖維化發現，對照組大鼠心肌細胞之間有少量膠原纖維，而DCM 組大鼠心肌間質膠原纖維明顯增多且排列紊亂；炙甘草湯組大鼠的心肌纖維化程度改善。Western blot 結果表明，與對照組比較，DCM 組大鼠心肌組織中α-SMA、CollagenⅠ、CollagenⅢ和SPHK2 的表達升高；與DCM 組比較，炙甘草湯組α-SMA、CollagenⅠ、CollagenⅢ和SPHK2 的表達降低（見圖2）。同時發現，與對照組比較，DCM 組大鼠心肌組織miR-181a-5p 表達水平顯著降低（P＜0.01）；與DCM 組比較，炙甘草湯組miR-181a-5p 的表達水平顯著升高（P＜0.05），見表1。

3.3 炙甘草湯改善高糖誘導的心肌成纖維細胞纖維化 CCK-8 檢測發現，與對照組比較，高糖組心肌成纖維細胞的細胞活力顯著升高（P＜0.01）；與高糖組比較，炙甘草湯組心肌成纖維細胞的細胞活力顯著降低（P＜0.01）（見表2）。qRT-PCR 檢測表明，與對照組比較，高糖組的心肌成纖維細胞中CollagenⅠ、CollagenⅢ水平顯著升高（P＜0.01），miR-181a-5p 水平顯著下降（P＜0.01）；與高糖組比較，炙甘草湯組心肌成纖維細胞中CollagenⅠ、CollagenⅢ表達顯著降低（P＜0.01），miR-181a-5p 表達顯著升高（P＜0.01）（見表3～4）。Western blot 檢測發現，與對照組比較，高糖組心肌成纖維細胞中α-SMA、SPHK2 的表達升高；與高糖組比較，炙甘草湯組α-SMA、SPHK2 的表達降低，見圖3。

3.4 miR-181a-5p 直接調控SPHK2 qRT-PCR 檢測表明，與miRNA-NC 比較，心肌成纖維細胞轉染miR-181a-5p 模擬物后miR-181a-5p 表達顯著上調（P＜0.01），而轉染miR-181a-5p 拮抗劑后miR-181a-5p 表達顯著下調（P＜0.01）（見表5）。通過TargetScan 數據庫分析發現，miR-181a-5p 與SPHK2 的3'UTR 存在結合序列（見圖4）。雙熒光素酶報告基因實驗發現，miR-181a-5p 模擬物顯著降低了WTSPHK2 熒光素酶活性（P＜0.01），而對MT-SPHK2 熒光素酶活性無影響（見表6）。Western blot 檢測表明，與miRNA-NC 比較，心肌成纖維細胞轉染miR-181a-5p 模擬物后SPHK2 蛋白表達降低，而轉染miR-181a-5p 拮抗劑后SPHK2 蛋白表達升高，見圖5。

3.5 炙甘草湯通過miR-181a-5p 調控高糖誘導的心肌成纖維細胞纖維化 qRT-PCR 檢測發現，與高糖組比較，炙甘草湯組CollagenⅠ、CollagenⅢ表達水平顯著降低（P＜0.01），miR-181a-5p 表達水平顯著升高（P＜0.01）；與炙甘草湯+miRNA-NC 組比較，炙甘草湯+miR-181a-5p 拮抗劑組CollagenⅠ、CollagenⅢ表達水平顯著升高（P＜0.01），miR-181a-5p 表達水平顯著降低（P＜0.01）（見表7～8）；CCK-8 檢測表明，與高糖組比較，炙甘草湯組心肌成纖維細胞的細胞活力顯著降低（P＜0.01）；與炙甘草湯+miRNA-NC 組比較，炙甘草湯+miR-181a-5p 拮抗劑組心肌成纖維細胞的細胞活力顯著升高（P＜0.01）（見表9）。Western blot 檢測發現，與高糖組比較，炙甘草湯組α-SMA、SPHK2 表達降低，與炙甘草湯+miRNA-NC 組比較，炙甘草湯+miR-181a-5p 拮抗劑組α-SMA、SPHK2 表達升高，見圖6。

4 討 論

DCM 是糖尿病的一種慢性復雜并發癥，其主要病理變化為心肌間質纖維化，從而降低心室順應性，導致心臟舒張與收縮功能障礙，最終引發心力衰竭[6]。中醫認為心主血脈，消渴病經久不愈會持續耗氣傷陰以致氣陰兩傷，而炙甘草湯具有益氣養陰、通陽復脈之功[7]。已有研究報道，炙甘草湯在纖維化的發生發展過程中發揮重要調節作用，例如炙甘草湯通過調節核因子-κB 信號通路改善異丙腎上腺素誘導的心肌纖維化大鼠心功能[8]；炙甘草湯通過參與氧化應激，抑制成纖維細胞活化減輕博萊霉素誘導的小鼠特發性肺纖維化[9]。本研究結果顯示，炙甘草湯可顯著抑制DCM 大鼠心肌纖維化，表明了炙甘草湯對DCM 心肌損傷的良好治療效果。

圖2 炙甘草湯改善DCM 大鼠心肌纖維化

表1 炙甘草湯對DCM 大鼠心肌組織miR-181a-5p 表達的影響（±s）

表1 炙甘草湯對DCM 大鼠心肌組織miR-181a-5p 表達的影響（±s）

注：對照組與DCM 組均灌胃2 mL/100 g 的生理鹽水；炙甘草湯組灌胃2 mL/100 g 濃度為1 g/mL 的炙甘草湯；DCM 為糖尿病心肌病；與對照組比較，aP＜0.01；與DCM 組比較，bP＜0.05

組別對照組DCM 組炙甘草湯組孔數333 miR-181a-5p 1.00±0.12 0.45±0.20a 0.72±0.18b

表2 炙甘草湯對心肌成纖維細胞活力的影響（%，±s）

表2 炙甘草湯對心肌成纖維細胞活力的影響（%，±s）

注：與對照組比較，aP＜0.01；與高糖組比較，bP＜0.01

組別對照組高糖組炙甘草湯組孔數333細胞活力100.00±11.00 194.03±25.59a 147.63±25.80b

表3 炙甘草湯對心肌成纖維細胞纖維化的影響（±s）

表3 炙甘草湯對心肌成纖維細胞纖維化的影響（±s）

注：與對照組比較，aP＜0.01；與高糖組比較，bP＜0.01

組別對照組高糖組炙甘草湯組孔數333 CollagenⅠ1.00±0.17 3.73±0.81a 1.91±0.58b CollagenⅢ1.00±0.24 3.93±0.97a 2.02±0.45b

表4 qRT-PCR 檢測炙甘草湯對心肌成纖維細胞miR-181a-5p 表達的影響（±s）

表4 qRT-PCR 檢測炙甘草湯對心肌成纖維細胞miR-181a-5p 表達的影響（±s）

注：與對照組比較，aP＜0.01；與高糖組比較，bP＜0.01

組別對照組高糖組炙甘草湯組孔數333 miR-181a-5p 1.00±0.21 0.41±0.18a 0.69±0.17b

圖3 Western blot 檢測心肌成纖維細胞中α-SMA 和SPHK2蛋白表達

表5 過表達和抑制miR-181a-5p 后心肌成纖維細胞中miR-181a-5p 的表達（±s）

表5 過表達和抑制miR-181a-5p 后心肌成纖維細胞中miR-181a-5p 的表達（±s）

注：與miRNA-NC 組比較，aP＜0.01

組別miRNA-NC 組miR-181a-5p 模擬物組miR-181a-5p 拮抗劑組孔數333 miR-181a-5p 1.00±0.28 2.82±0.86a 0.29±0.09a

圖4 TargetScan 數據庫預測SPHK2 與miR-181a-5p 的結合位點

表6 miR-181a-5p 與SPHK2 的靶向結合關系（±s）

表6 miR-181a-5p 與SPHK2 的靶向結合關系（±s）

注：SPHK2 為鞘氨醇激酶2；與miRNA-NC＋WT-SPHK2 組比較，aP＜0.01

組別miRNA-NC＋WT-SPHK2 組miR-181a-5p 模擬物＋WT-SPHK2 組miRNA-NC＋MT-SPHK2 組miR-181a-5p 模擬物＋MT-SPHK2 組孔數3333熒光素酶活性1.02±1.05 0.41±0.02a 1.04±0.13 0.99±0.15

圖5 Western blot 檢測心肌成纖維細胞中SPHK2 蛋白表達

表7 抑制miR-181a-5p 對心肌成纖維細胞纖維化的影響（±s）

表7 抑制miR-181a-5p 對心肌成纖維細胞纖維化的影響（±s）

注：與高糖組比較，aP＜0.01；與炙甘草湯＋miRNA-NC 組比較，bP＜0.01

組別高糖組炙甘草湯組炙甘草湯＋miRNA-NC 組炙甘草湯＋miR-181a-5p 拮抗劑組孔數3333 CollagenⅠ3.84±0.71 1.93±0.54a 1.89±0.26 2.95±0.67b CollagenⅢ3.94±0.74 2.04±0.65a 1.85±0.63 2.99±0.74b

表8 抑制miR-181a-5p 對心肌成纖維細胞中miR-181a-5p 表達的影響（±s）

表8 抑制miR-181a-5p 對心肌成纖維細胞中miR-181a-5p 表達的影響（±s）

注：與高糖組比較，aP＜0.01；與炙甘草湯＋miRNA-NC 組比較，bP＜0.01

組別高糖組炙甘草湯組炙甘草湯＋miRNA-NC 組炙甘草湯＋miR-181a-5p 拮抗劑組孔數3333 miR-181a-5p 1.00±0.18 2.94±0.74a 2.89±0.57 0.77±0.17b

表9 抑制miR-181a-5p 對心肌成纖維細胞活力的影響（%，±s）

表9 抑制miR-181a-5p 對心肌成纖維細胞活力的影響（%，±s）

注：與高糖組比較，aP＜0.01；與炙甘草湯＋miRNA-NC 組比較，bP＜0.01

組別高糖組炙甘草湯組炙甘草湯＋miRNA-NC 組炙甘草湯＋miR-181a-5p 拮抗劑組孔數3333細胞活力100.00±21.81 59.17±8.35a 59.75±8.08 78.57±10.64b

圖6 Western blot 檢測心肌成纖維細胞中α-SMA 和SPHK2蛋白表達

miRNA 通過抑制mRNA 翻譯或與mRNA 的3'UTR 結合負調控其表達，參與許多心血管疾病發展[10]。例如，miR-34a 可以通過靶向Pin-1 信號降低CollagenⅠ的生成并增加心臟成纖維細胞的凋亡，從而減輕DCM 心肌纖維化[11]。miR-181a-5p 是一種多功能miRNA，在許多生理和病理過程中發揮重要調節作用。一項研究發現，miR-181a-5p 通過靶向內啡肽抑制腫瘤壞死因子-α 刺激的炎癥從而改善肺動脈高壓癥狀[12]。LncRNA KCNQ1OT1 通過靶向miR-181a-5p增加PDCD4 的表達，促進DCM 心肌細胞凋亡[13]。我們研究發現，DCM 組大鼠心肌組織miR-181a-5p 表達水平顯著低于對照組，而經過炙甘草湯處理后miR-181a-5p 表達水平上升，提示miR-181a-5p 可能是炙甘草湯的潛在作用靶點。隨后的細胞實驗表明，miR-181a-5p 在高糖誘導的心肌成纖維細胞中表達下調，在此基礎上經炙甘草湯預處理后表達水平上升，再次證實了我們的推測。

通過TargetScan 數據庫分析發現，miR-181a-5p與SPHK2 的3'UTR 存在結合序列并通過雙熒光素酶報告基因實驗得到進一步證實。SPHK2 是一種多功能脂質激酶，定位于多個細胞器，調節多種重要的分子機制[14]。有證據顯示，在腎臟纖維化的小鼠模型中抑制或刪除SPHK2 可以減少炎癥和纖維化反應，從而減輕腎損傷[15-16]。然而SPHK2 在DCM 心肌纖維化中的機制缺乏文獻報道，有待深入研究。本實驗結果顯示，SPHK2 蛋白在高糖誘導的心肌成纖維細胞中表達上升，在此基礎上轉染miR-181a-5p 模擬物后表達下降，轉染miR-181a-5p 拮抗劑后表達上升。在動物實驗中，SPHK2 蛋白在DCM 大鼠心肌組織中顯著上調而經炙甘草湯處理后表達量下降，這與細胞實驗的結果一致。

綜上所述，炙甘草湯具有改善DCM 的作用，其作用機制可能是通過miR-181a-5p 靶向SPHK2 調控心肌纖維化來實現的。