胡柚皮黃酮對(duì)棕櫚酸誘導(dǎo)的脂肪變性肝細(xì)胞中線粒體膜電位以及自噬相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

王 瀟 何蓓暉 姚侃男 陳芝蕓

非酒精性脂肪性肝炎（NASH）是全球最受關(guān)注的公共健康問題之一，近年來在我國發(fā)病率逐年上升，且有年輕化趨勢[1-2]。有部分患者會(huì)逐漸進(jìn)展至肝硬化和肝癌，嚴(yán)重影響人類的健康水平和生活質(zhì)量，并帶來沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[3-4]。目前除了飲食調(diào)節(jié)、運(yùn)動(dòng)鍛煉和對(duì)癥治療外，尚未發(fā)現(xiàn)有效的治療方法。胡柚皮黃酮（pure total flavonoids from citrus，PTFC）是我們從常山胡柚皮中分離純化的黃酮類化合物，由柚皮苷、新橙皮苷和柚皮蕓香苷等3 種黃酮類化合物為主要成分。前期實(shí)驗(yàn)在NASH 動(dòng)物模型中發(fā)現(xiàn)，PTFC能抑制氧化應(yīng)激和脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，減輕肝臟中炎癥反應(yīng)，具有保護(hù)肝細(xì)胞的作用[5-6]。有研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞中沉默信息調(diào)節(jié)因子1（SIRT1）水平影響細(xì)胞自噬活性[7]。進(jìn)一步研究表明，SIRT1 可通過去乙酰化對(duì)自噬相關(guān)蛋白功能發(fā)揮調(diào)控作用，促進(jìn)線粒體自噬形成，在自噬的調(diào)節(jié)中起著關(guān)鍵性作用[8-9]。前期研究發(fā)現(xiàn)，PTFC 通過調(diào)控SIRT1 改善NASH 小鼠[6]。因此，本研究采用棕櫚酸（PA）誘導(dǎo)肝細(xì)胞建立細(xì)胞脂肪變性模型，從線粒體自噬途徑探討PTFC 抗肝細(xì)胞損傷的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器 人肝癌細(xì)胞株HepG2 細(xì)胞購自上海生命科學(xué)院細(xì)胞庫；PTFC 由本單位中藥制劑室分離純化；胎牛血清、高糖DMEM 培養(yǎng)基購自Gibco公司（批號(hào)211100703、8121080）；0.25%胰酶購自Gibco 公司（批號(hào)2120734）；PA 購自GLPBIO 公司（批號(hào)07512）；油紅O 染料購自Sigma 公司（批號(hào)07512）；BCA 蛋白質(zhì)定量試劑盒購自biosharp 公司（批號(hào)00755S）、線粒體膜電位檢測試劑盒北京索萊寶科技公司（批號(hào)M8650）、活性氧檢測試劑盒購自碧云天公司（批號(hào)S0033S）、總蛋白提取試劑盒購自北京普利萊基因技術(shù)有限公司（批號(hào)P1250）；P62、自噬效應(yīng)蛋白（Beclin-1）抗體購自Immunoway 公司（批號(hào)00101435、00096519）；微管相關(guān)蛋白質(zhì)1 輕鏈3（LC3）抗體購自proteintech 公司（批號(hào)00076446）；倒置顯微鏡、熒光顯微鏡（Olympus 公司）；CO2培養(yǎng)箱（Thermo 公司）；酶標(biāo)儀（美國BioTek 公司）；凝膠成像儀（Bio-Rad 公司）。

1.2 方 法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的高糖DMEM 培養(yǎng)基中，在37 ℃、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞80%～90%融合時(shí)，0.25%胰酶消化細(xì)胞，1∶3 傳代，進(jìn)行相關(guān)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 MTT 法檢測細(xì)胞增殖 將對(duì)數(shù)生長期的HepG2 細(xì)胞以1×105/mL 的密度，100 μL/孔接種于96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板，培養(yǎng)24 h。去上清，加入含不同濃度（0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mmol/L）PA 的培養(yǎng)液200 μL，空白對(duì)照組只加200 μL 培養(yǎng)液，培養(yǎng)24 h、48 h，培養(yǎng)結(jié)束前4 h 加入20 μL/孔5 mg/mL 的MTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，去上清液，加入200 μL/孔DMSO，震蕩10 min，選擇490 nm 波長，酶標(biāo)儀檢測吸光值（OD），每組做6 個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.2.3 油紅O 染色檢測細(xì)胞脂質(zhì)沉積 將對(duì)數(shù)生長期的HepG2 細(xì)胞接種于6 孔細(xì)胞培養(yǎng)板，37℃、5%CO2培養(yǎng)24 h。去上清，加入含不同濃度（0、0.2、0.3、0.4、0.5 mmol/L）PA 的培養(yǎng)基，空白對(duì)照組只加培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。油紅O 染色，顯微鏡下觀察細(xì)胞內(nèi)脂滴形成情況。根據(jù)細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)和油紅O 染色結(jié)果，確定PA 誘導(dǎo)HepG2 細(xì)胞脂肪變性的濃度。采用該濃度處理細(xì)胞，同時(shí)加入不同濃度的PTFC（0、20、40、80、160 mg/L）處理24 h，油紅O 染色，檢測細(xì)胞脂質(zhì)沉積變化。

1.2.4 熒光探針檢測細(xì)胞內(nèi)活性氧含量 將對(duì)數(shù)生長期的HepG2 細(xì)胞接種于6 孔培養(yǎng)板，37 ℃、5%CO2培養(yǎng)24 h。0.3 mmol/L 的PA 誘導(dǎo)HepG2 細(xì)胞，同時(shí)加入不同濃度的PTFC（0、40、80、160 mg/L）培養(yǎng)24 h。棄上清，加入1 mL PBS，搖床5 min，洗2 次。加入1 mL的DCFH-DA（10 μmol/L），37 ℃孵育30 min。棄上清，1 mL PBS 洗1 次。熒光顯微鏡下采集圖像。

1.2.5 熒光探針檢測線粒體膜電位 取對(duì)數(shù)生長期的HepG2 細(xì)胞接種于6 孔培養(yǎng)板，37 ℃、5%CO2培養(yǎng)24 h。0.3 mmol/L 的PA 誘導(dǎo)HepG2 細(xì)胞，同時(shí)加入不同濃度的PTFC（0、40、80、160 mg/L）培養(yǎng)24 h。棄上清，加入1 mL 現(xiàn)配的10 μg/mL 的JC-1 工作液，37 ℃孵育30 min。棄上清，培養(yǎng)液洗滌2 次。熒光顯微鏡采集圖像。

1.2.6 免疫印跡法檢測PTFC 對(duì)HepG2 細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 取對(duì)數(shù)生長期的HepG2 細(xì)胞接種于細(xì)胞培養(yǎng)瓶，37 ℃、5%CO2培養(yǎng)24 h。0.3 mmol/L的PA 誘導(dǎo)HepG2 細(xì)胞，同時(shí)加入不同濃度的PTFC（0、20、40、80、160 mg/L）處理24 h。PBS 洗滌細(xì)胞，RIPA 液裂解提取總蛋白，BCA 法測定蛋白濃度。SDS-PAGE 電泳，LC3 和Beclin-1、p62 分別采用15%和10%的SDS-PAGE 膠，制備轉(zhuǎn)膜后，1%BSA封閉。一抗1∶1000 稀釋，4 ℃孵育過夜，TBST 洗膜3次，HRP 標(biāo)記的二抗室溫孵育1 h，TBST 洗膜3 次，ECL 顯影。凝膠成像系統(tǒng)采集圖片并分析。

1.2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 22.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。符合正態(tài)分布計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，兩組資料之間比較采用獨(dú)立樣本t 檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 PA 對(duì)HepG2 細(xì)胞增殖的影響 不同濃度PA分別處理HepG2 細(xì)胞24、48 h 后，MTT 法檢測細(xì)胞增殖情況，結(jié)果顯示，低濃度PA 對(duì)細(xì)胞增殖無明顯影響，而當(dāng)PA 濃度高于0.3 mmol/L 后對(duì)細(xì)胞增殖的抑制作用逐漸增強(qiáng)，見圖1。

圖1 不同濃度PA 對(duì)HepG2 細(xì)胞增殖的作用

2.2 PA 誘導(dǎo)HepG2 細(xì)胞脂肪變性 油紅O 染色結(jié)果顯示，正常對(duì)照組細(xì)胞內(nèi)少量紅染，PA 處理組均可觀察到紅染，且PA 濃度越高紅染明顯增多，表明細(xì)胞內(nèi)脂滴增多。結(jié)合MTT 結(jié)果，發(fā)現(xiàn)在PA 濃度為0.3 mmol/L 時(shí)，細(xì)胞增殖不會(huì)受到明顯抑制，同時(shí)細(xì)胞出現(xiàn)明顯的脂質(zhì)沉積，故實(shí)驗(yàn)選定該濃度作為誘導(dǎo)細(xì)胞脂肪變性劑量，見圖2。

2.3 PTFC 對(duì)肝細(xì)胞脂肪變性的影響 用不同濃度PTFC 分別作用于經(jīng)0.3 mmol/L 誘導(dǎo)的HepG2 細(xì)胞24 h 后，油紅O 染色發(fā)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)含量減少，且呈劑量依賴性（P＜0.01），見圖3 和表1。

2.4 PTFC 對(duì)HepG2 細(xì)胞內(nèi)活性含量的影響 實(shí)驗(yàn)顯示，經(jīng)PA 處理后，細(xì)胞中綠色熒光顯著增強(qiáng)（P＜0.01）；而用不同濃度PTFC 干預(yù)后綠色熒光強(qiáng)度降低，且隨PTFC 濃度增高熒光強(qiáng)度降低越明顯（P＜0.01），見圖4 和表2。

2.5 PTFC 對(duì)HepG2 細(xì)胞線粒體膜電位的影響 實(shí)驗(yàn)顯示，經(jīng)PA 處理后，細(xì)胞中紅色熒光強(qiáng)度減弱，綠色熒光顯著增強(qiáng)，導(dǎo)致線粒體膜電位下降。而不同濃度PTFC 干預(yù)后綠色熒光強(qiáng)度降低，而紅色熒光強(qiáng)度逐漸增強(qiáng)，表明PTFC 會(huì)使細(xì)胞線粒體膜電位恢復(fù)。見圖5。

2.6 PTFC 對(duì)HepG2 細(xì)胞自噬的影響 Western blot 結(jié)果顯示，經(jīng)PA 處理后，Beclin-1 和LC3 蛋白表達(dá)明顯下調(diào)，P62 蛋白表達(dá)上調(diào)；而PTFC 干預(yù)后，Beclin-1 和LC3 蛋白表達(dá)明顯上調(diào)，而P62 蛋白表達(dá)下調(diào)，且隨PTFC 濃度增加作用相應(yīng)增強(qiáng)。見圖6。

3 討 論

非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）是脂質(zhì)代謝紊亂性疾病在肝臟中的一種臨床表現(xiàn)，其主要病理特征為肝細(xì)胞脂肪變性和氧化應(yīng)激損傷后所致的炎癥反應(yīng)，而NASH 是肝組織從單純性脂肪變性發(fā)展至肝硬化，甚至肝細(xì)胞癌的中間限速階段[1]。目前，針對(duì)NASH 尚無明確有效的治療方法。

近年來許多研究發(fā)現(xiàn)，線粒體功能紊亂在NASH的發(fā)生發(fā)展過程中有著重要的作用[10]。在肝臟中，線粒體不但參與脂質(zhì)代謝，也是氧化應(yīng)激發(fā)生的主要場所。線粒體功能障礙會(huì)引起肝細(xì)胞脂肪氧化代謝出現(xiàn)異常，導(dǎo)致細(xì)胞中活性氧簇產(chǎn)生增多，從而使肝臟脂肪變性和炎癥反應(yīng)，造成肝細(xì)胞功能損傷和病理改變。

圖2 油紅O 染色檢測HepG2 細(xì)胞中脂質(zhì)沉積（×200）

圖3 HepG2 細(xì)胞脂肪變性情況（×200）

表1 HepG2 細(xì)胞脂肪變性檢測（±s）

表1 HepG2 細(xì)胞脂肪變性檢測（±s）

注：PA 為棕櫚酸；PTFC 為胡柚皮黃酮；與對(duì)照組比較，aP＜0.01；與PA組比較，bP＜0.01

組別對(duì)照組PA（0.3 mmol/L）組PA+PTFC（20 mg/L）組PA+PTFC（40 mg/L）組PA+PTFC（80 mg/L）組PA+PTFC（160 mg/L）組孔數(shù)333333脂滴相對(duì)含量1.00±0.13 39.13±3.15a 30.17±4.41b 16.35±4.00b 6.26±1.69b 2.76±2.05b

表2 HepG2 細(xì)胞內(nèi)活性氧含量檢測（±s）

表2 HepG2 細(xì)胞內(nèi)活性氧含量檢測（±s）

注：PA 為棕櫚酸；PTFC 為胡柚皮黃酮；ROS 為活性氧；與對(duì)照組比較，aP＜0.01；與PA 組比較，bP＜0.01

組別對(duì)照組PA（0.3 mmol/L）組PA+PTFC（20 mg/L）組PA+PTFC（40 mg/L）組PA+PTFC（80 mg/L）組PA+PTFC（160 mg/L）組孔數(shù)333333活性氧相對(duì)熒光強(qiáng)度1.00±0.25 18.56±1.48a 16.21±2.52 9.13±1.12b 7.00±0.45b 5.03±1.00b

圖4 HepG2 細(xì)胞內(nèi)活性氧水平檢測

自噬是維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)的重要生理功能，也是細(xì)胞用來清除存在功能障礙線粒體的主要途徑[11]。自噬通過清除受損的線粒體并降解細(xì)胞內(nèi)累積的脂質(zhì)，在NASH 脂質(zhì)代謝紊亂進(jìn)程中發(fā)揮重要作用。研究表明，NAFLD 患者肝細(xì)胞內(nèi)線粒體自噬活性下降，肝臟損傷程度與其自噬受損程度密切相關(guān)[12-14]。進(jìn)一步研究顯示，在高脂飲食誘導(dǎo)的小鼠NAFLD 模型和PA 處理的細(xì)胞模型中，均觀察到肝細(xì)胞線粒體自噬功能障礙；使用自噬激活劑后，肝細(xì)胞脂質(zhì)沉積、氧化應(yīng)激反應(yīng)和炎癥反應(yīng)明顯減輕[15-17]。

圖5 HepG2 細(xì)胞線粒體膜電位檢測

圖6 HepG2 細(xì)胞中P62、Beclin-1 和LC3 蛋白表達(dá)

本研究采用PA 誘導(dǎo)HepG2 細(xì)胞建立了肝細(xì)胞脂肪變性細(xì)胞模型。我們發(fā)現(xiàn)PTFC 能有效減少肝細(xì)胞內(nèi)脂滴沉積，改善肝細(xì)胞脂肪變性；同時(shí)減低了細(xì)胞內(nèi)活性氧含量。進(jìn)一步研究顯示，PTFC 能夠逆轉(zhuǎn)線粒體膜電位變化，表明PTFC 改善了線粒體功能障礙。同時(shí)我們還發(fā)現(xiàn)，PA 處理后HepG2 細(xì)胞中與自噬活性相關(guān)的正調(diào)控蛋白Beclin-1 和LC3 表達(dá)水平下降，相應(yīng)的負(fù)調(diào)控因子P62 表達(dá)升高。而PTFC 能夠部分恢復(fù)上述蛋白表達(dá)水平。編碼Beclin-1 蛋白的基因是酵母自噬相關(guān)基因ATG6 的同系物，是參與哺乳動(dòng)物自噬的特異性基因，可調(diào)控與自噬相關(guān)的信號(hào)通路。Beclin-1 和ATG14 或UVRAG 結(jié)合形成自噬復(fù)合物，啟動(dòng)自噬小體的形成，所以被稱為自噬的分子開關(guān)蛋白，具有調(diào)控自噬起始并募集自噬底物至自噬小體的作用[18-19]。LC3 為自噬正調(diào)控蛋白，參與自噬體的形成，細(xì)胞中LC3 的水平與自噬泡數(shù)量呈正相關(guān)[20-21]。p62 又稱SQSTM1，在自噬溶酶體降解過程中具有關(guān)鍵作用，是調(diào)節(jié)自噬的負(fù)相關(guān)因子[19]。自噬小體形成過程中，p62 可連接LC3 和泛素化的底物結(jié)合，一起整合至自噬體中，并在自噬溶酶體中被降解，因此，隨著自噬活性增高，p62 蛋白水平下降[22]。本研究結(jié)果表明，PTFC 可能參與了自噬的調(diào)控。

以上研究結(jié)果提示，PTFC 能明顯改善肝細(xì)胞脂肪變性，調(diào)控線粒體自噬可能是PTFC 改善肝細(xì)胞脂肪變性的主要作用機(jī)制之一。因此，我們推測PTFC可能通過調(diào)控線粒體自噬，保護(hù)線粒體功能，減少活性氧，抗肝細(xì)胞脂肪變性，從而達(dá)到改善NASH 的治療效果。