養(yǎng)血通絡(luò)方對(duì)類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎超聲關(guān)節(jié)評(píng)分、HIF-1α與Tfh 細(xì)胞作用研究

胡映雪 鄭紅霞 王 圳 鄭敏威 邵燕雷 陶筱娟

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）是一種自身免疫性疾病，全球發(fā)病率約為1%[1]，我國(guó)約為0.28%～0.4%[2]，預(yù)后較差。其發(fā)病機(jī)制尚不明確，其中缺氧機(jī)制備受關(guān)注。新進(jìn)研究認(rèn)為，缺氧誘導(dǎo)因子1α（hypoxia inducible factor，HIF-1α）促進(jìn)本病進(jìn)展[3]，濾泡輔助性T 細(xì)胞（follicular helper T lymphocytes，Tfh）參與的機(jī)體免疫調(diào)控失衡也是本病重要致病因素[4]，同時(shí)兩者存在相關(guān)性，具體作用機(jī)制有待進(jìn)一步明確[5]。此外，缺氧可致氣血運(yùn)行不暢，通過養(yǎng)血通絡(luò)法調(diào)和人體氣血，能夠改善關(guān)節(jié)血運(yùn)及缺氧狀態(tài)，抑制滑膜血管新生，減輕關(guān)節(jié)炎癥。養(yǎng)血通絡(luò)方是浙江省名中醫(yī)陶筱娟教授臨床治療RA 的經(jīng)驗(yàn)方，本研究探討該方對(duì)RA 患者超聲關(guān)節(jié)評(píng)分、HIF-1α 與Tfh 細(xì)胞的影響，并對(duì)HIF-1α、Tfh 細(xì)胞、疾病活動(dòng)度之間的相關(guān)性做進(jìn)一步分析，報(bào)道如下。

1 臨床資料

1.1 一般資料 選取2021 年5 月至2022 年5 月浙江省中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院風(fēng)濕科門診或病房收治的RA患者60 例，按照隨機(jī)數(shù)字表法分為對(duì)照組及治療組，各30 例。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)審核通過，審批號(hào)：【2020】研審第（32-1）號(hào)。

1.2 納入及排除標(biāo)準(zhǔn) 納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）符合2010 年美國(guó)風(fēng)濕病學(xué)會(huì)及歐洲抗風(fēng)濕聯(lián)盟RA 診斷標(biāo)準(zhǔn)[6]；（2）中醫(yī)辨證為氣虛血瘀證[7]；（3）年齡18～60 歲；（4）病程0.5～2 年；（5）病情活動(dòng)度DAS28 評(píng)分為中低度活動(dòng)期[8]；（6）近2 周未服用激素及抗風(fēng)濕改善病情藥物；（7）簽署知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）關(guān)節(jié)功能4級(jí)處于疾病晚期；（2）合并其他風(fēng)濕免疫或心、腦、肝、腎等重大疾病；（3）備孕或妊娠期；（4）精神疾病無法配合治療；（5）放棄治療、失訪。

2 方 法

2.1 治療方法 兩組基礎(chǔ)用藥相同，均使用甲氨蝶呤片（湖南正清制藥集團(tuán)股份有限公司，批號(hào)2207701，規(guī)格：2.5 mg/片）10 mg，每周1 次，頓服；來氟米特片（蘇州長(zhǎng)征-欣凱制藥有限公司，批號(hào)221001，規(guī)格：10 mg/片）10 mg，每日1 次，頓服；葉酸片（常州制藥公司，批號(hào)23022112，規(guī)格：5 mg/片）5 mg，每周1 次，頓服（與甲氨蝶呤片間隔24 h）。治療組在基礎(chǔ)用藥上加用養(yǎng)血通絡(luò)方（熟地、當(dāng)歸各15 g，生黃芪、藤梨根、雞血藤各30 g，赤芍、茯苓各15 g，薏苡仁30 g，地龍、僵蠶各10 g，甘草5 g），水煎服200 mL，每日2 次。觀察療程3 個(gè)月（12 周）。

2.2 觀察指標(biāo)

2.2.1 高頻超聲關(guān)節(jié)評(píng)分 參照2017 歐洲抗風(fēng)濕聯(lián)盟RA 超聲評(píng)分法[9]對(duì)患者28 個(gè)關(guān)節(jié)進(jìn)行超聲評(píng)分（應(yīng)用高頻超聲，探頭頻率8 MHz，機(jī)器型號(hào)飛利浦U22）。滑膜厚度采用灰階超聲（greyscale ultrasound，GSUS），依據(jù)半定量法評(píng)分：0 分為無滑膜增厚，1 分為輕度滑膜增厚，2 分為中度滑膜增厚，3 分為重度滑膜增厚。滑膜血供采用能量多普勒血流（power doppler ultrasound，PDUS），依據(jù)半定量法評(píng)分：0 分為無血流信號(hào)，1 分為≤3 個(gè)血流信號(hào)，2 分為血流信號(hào)較1 級(jí)多，但血流面積＜增生滑膜面積的50%，3 分為血流信號(hào)面積＞增生滑膜面積的50%。所有異常關(guān)節(jié)評(píng)分相加得出超聲評(píng)價(jià)總分，由高年資超聲醫(yī)生完成。

2.2.2 疾病活動(dòng)度DAS28 評(píng)分 參照2015 年美國(guó)風(fēng)濕學(xué)會(huì)提出的RA 疾病活動(dòng)度評(píng)分系統(tǒng)[8]對(duì)RA 患者進(jìn)行評(píng)分。DAS28 評(píng)分＜2.6 分為病情穩(wěn)定；2.6分≤DAS28 評(píng)分＜3.2 分為低活動(dòng)度；3.2 分≤DAS28評(píng)分＜5.1 分為中活動(dòng)度。

2.2.3 外周血HIF-1α 檢測(cè) 采用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（ELISA）法，按照試劑盒說明操作，使用MULTISKAN FC 型酶標(biāo)儀（Thermo）測(cè)定吸光度檢測(cè)血清HIF-1α 水平。

2.2.4 外周血Tfh 細(xì)胞檢測(cè) 采用流式檢測(cè)技術(shù)，按照試劑盒說明操作，使用流式細(xì)胞儀（BD，型號(hào)Celesta）測(cè)定表型為CD4+、CXCR5+的Tfh 細(xì)胞表達(dá)量。

2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 23.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，正態(tài)分布的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較用獨(dú)立樣本t 檢驗(yàn)，組內(nèi)比較用配對(duì)t 檢驗(yàn)；非正態(tài)分布的計(jì)量資料以中位數(shù)（范圍）表示，采用秩和檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料以例表示，采用檢驗(yàn)χ2檢驗(yàn)。使用Pearson 進(jìn)行變量間的相關(guān)性分析。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié) 果

3.1 兩組RA 患者一般資料比較 治療組男6 例，女24 例，年齡35～60（48.13±7.23）歲，病程0.5～2（1.25±0.54）年；對(duì)照組男5 例，女25 例，年齡34～58（47.33±6.76）歲，病程0.5～2（1.34±0.58）年。兩組性別、年齡、病程比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

3.2 兩組RA 患者治療前后超聲和DAS28 評(píng)分比較 兩組患者治療前超聲和DAS28 評(píng)分比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；兩組患者治療后超聲和DAS28 評(píng)分均下降（P＜0.05）；治療組較對(duì)照組治療后超聲和DAS28 評(píng)分下降更明顯（P＜0.05），見表1。

表1 兩組RA 患者治療前后超聲關(guān)節(jié)和DAS28 評(píng)分比較（分，±s）

表1 兩組RA 患者治療前后超聲關(guān)節(jié)和DAS28 評(píng)分比較（分，±s）

注：對(duì)照組給予甲氨蝶呤、來氟米特、葉酸治療；治療組在對(duì)照組基礎(chǔ)上加用養(yǎng)血通絡(luò)方治療；RA 為類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎；DAS28 為28 處關(guān)節(jié)疾病活動(dòng)度評(píng)分；GSUS 為灰階超聲；PDUS 為血流能量多普勒；與同組治療前比較，aP＜0.05；與對(duì)照組治療后比較，bP＜0.05

組別治療組治療前治療后對(duì)照組治療前治療后例數(shù)30 GSUS 評(píng)分PDUS 評(píng)分DAS28 評(píng)分3.03±1.61 2.03±1.25ab 2.07±1.26 1.13±0.78ab 4.37±0.72 3.08±0.81ab 30 2.93±1.46 2.73±1.36a 2.20±1.19 1.67±1.12a 4.41±0.69 3.92±0.70a

3.3 兩組RA 患者治療前后外周血HIF-1α、Tfh 細(xì)胞水平比較 兩組患者治療前外周血HIF-1α、Tfh細(xì)胞水平比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；兩組患者治療后HIF-1α、Tfh 細(xì)胞水平均下降（P＜0.05）；治療組較對(duì)照組治療后HIF-1α、Tfh 細(xì)胞水平下降更明顯（P＜0.05），見表2。

3.4 兩組RA 患者治療后HIF-1α、Tfh 細(xì)胞、DAS28評(píng)分相關(guān)性分析 兩組RA 患者外周血HIF-1α、Tfh細(xì)胞與疾病活動(dòng)度DAS28 評(píng)分呈正相關(guān)（治療組：r=0.575、0.364，對(duì)照組：r=0.524、0.376；P 均＜0.05）。兩組患者外周血HIF-1α 與Tfh 細(xì)胞呈正相關(guān)（對(duì)照組：r=0.482，對(duì)照組：r=0.409，P 均＜0.05）。

表2 兩組RA 患者治療前后外周血HIF-1α、Tfh 細(xì)胞水平比較（±s）

表2 兩組RA 患者治療前后外周血HIF-1α、Tfh 細(xì)胞水平比較（±s）

注：對(duì)照組予甲氨蝶呤、來氟米特、葉酸治療；治療組在對(duì)照組基礎(chǔ)上加用養(yǎng)血通絡(luò)方；RA 為類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎；HIF-1α 為缺氧誘導(dǎo)因子1α；CD4+為白細(xì)胞分化抗原4+；CXCR5+為CXC 型趨化因子受體5+；Tfh 為濾泡輔助性T 細(xì)胞；與同組治療前比較，aP＜0.05；與對(duì)照組治療后比較，bP＜0.05

組別治療組治療前治療后對(duì)照組治療前治療后例數(shù)30 HIF-1α CD4+CXCR5+Tfh（%）2.35±0.60 1.13±0.45ab 7.62±2.13 5.67±1.95ab 30 2.23±0.68 1.50±0.65a 7.74±1.96 6.96±1.87a

4 討 論

RA 可導(dǎo)致周身廣泛關(guān)節(jié)破壞、融合，致殘率高[10]，目前尚無根治之法。西藥治療包括改善病情抗風(fēng)濕藥、生物制劑及小分子靶向合成藥物等，但并不能完全控制RA 進(jìn)展。本研究結(jié)果顯示，兩組患者治療后疾病活動(dòng)度DAS28 評(píng)分、關(guān)節(jié)超聲評(píng)分、外周血HIF-1α 及Tfh 細(xì)胞水平均下降，但治療組療效較對(duì)照組更加明顯，這提示養(yǎng)血通絡(luò)方在降低本病疾病活動(dòng)、改善關(guān)節(jié)滑膜血供方面具有優(yōu)勢(shì)。同時(shí)，HIF-1α 與Tfh 細(xì)胞之間存在一定相關(guān)性，且與疾病活動(dòng)度DAS28 評(píng)分存在關(guān)聯(lián)性。

RA 病理表現(xiàn)為滑膜增生和炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，兩者均可增加局部關(guān)節(jié)耗氧量，導(dǎo)致受累關(guān)節(jié)缺氧，故認(rèn)為缺氧是RA 重要的內(nèi)微環(huán)境特征。而HIF-1α 是調(diào)控細(xì)胞缺氧反應(yīng)的核心轉(zhuǎn)錄因子[11]，其在滑膜組織中高表達(dá)可促進(jìn)滑膜細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)疾病發(fā)生[12]。Tfh細(xì)胞是近來發(fā)現(xiàn)的一種在生發(fā)中心形成，不同于Th1、Th2、Th17 細(xì)胞的一種新的CD4+T 細(xì)胞亞群，可促進(jìn)B 細(xì)胞活化，形成特異性自身抗體介導(dǎo)的自身免疫性疾病[13]。Tfh 細(xì)胞分泌炎癥因子白細(xì)胞介素（interleukin，IL）-21、IL-6 等，進(jìn)一步加重關(guān)節(jié)缺氧，而過量分泌的IL-21 也被證實(shí)可通過信號(hào)通路促進(jìn)RA 發(fā)生發(fā)展[14]。此外，其表型CXCR5+的表達(dá)失調(diào)，也參與了本病的發(fā)病機(jī)制。研究表明，Tfh 細(xì)胞表達(dá)水平與RA 疾病活動(dòng)度呈正相關(guān)，可能是RA 侵襲性發(fā)展的獨(dú)立危險(xiǎn)因素[15]。同時(shí)，缺氧是生發(fā)中心的特征之一，當(dāng)機(jī)體處于低氧環(huán)境時(shí)，HIF-1α 的代謝信號(hào)可促進(jìn)Tfh 細(xì)胞分化，進(jìn)一步加重疾病損傷程度[16]，這提示兩者之間存在一定相關(guān)性，但具體作用機(jī)制仍待進(jìn)一步深入研究。因此，改善機(jī)體缺氧狀態(tài)，能夠下調(diào)患者HIF-1α、Tfh 細(xì)胞表達(dá)，控制關(guān)節(jié)炎癥，降低疾病活動(dòng)度。超聲檢查具有便捷廉價(jià)、安全無輻射、易操作等特點(diǎn)，同時(shí)可實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)觀察關(guān)節(jié)滑膜病理形態(tài)，因此對(duì)關(guān)節(jié)超聲滑膜厚度及滑膜血供進(jìn)行治療前后評(píng)分能夠更加全面、準(zhǔn)確地反映疾病發(fā)展過程。

陶筱娟教授認(rèn)為，本病歸屬中醫(yī)“痹證”等范疇，病因病機(jī)包括內(nèi)因、外因兩方面，與“瘀血”密切相關(guān)。正氣虛于體內(nèi)，風(fēng)寒濕邪乘虛內(nèi)襲，氣機(jī)失調(diào)，氣血凝滯，留而為瘀，久而成痹，故氣虛血瘀為其主要證型。同時(shí)，關(guān)節(jié)缺氧可致血脈不暢、肢節(jié)不利，日久成瘀，反之氣血運(yùn)行不暢、瘀血阻絡(luò)又可加重缺氧，兩者互為因果。故治療本病關(guān)鍵在于調(diào)暢人體氣血，改善關(guān)節(jié)血運(yùn)及缺氧狀態(tài)。陶筱娟教授總結(jié)多年臨床經(jīng)驗(yàn)，提出治痹法當(dāng)養(yǎng)血通絡(luò)，創(chuàng)立養(yǎng)血通絡(luò)方，旨在調(diào)和氣血，通脈止痛，意在改善缺氧所致的局部氣血運(yùn)行不暢，達(dá)到抑制關(guān)節(jié)滑膜血管新生、改善并控制病情的治療效果。方中黃芪、當(dāng)歸為益氣活血經(jīng)典藥對(duì)，黃芪補(bǔ)益元?dú)猓瑲馔鷦t血行，瘀血去而經(jīng)絡(luò)通，當(dāng)歸養(yǎng)血活血，血為氣之母，兩藥配伍氣血同治，主治氣虛血瘀，共為君藥。雞血藤活血養(yǎng)血、舒筋活絡(luò)，赤芍活血散瘀止痛，熟地養(yǎng)血滋陰，意在增強(qiáng)養(yǎng)血通絡(luò)之效，共為臣藥。地龍、僵蠶屬血肉之品，通經(jīng)活絡(luò)之力可行周身，薏苡仁滲濕除痹、舒筋和脈，藤梨根祛風(fēng)除濕止痹，茯苓利水化濕，共為佐助藥。炙甘草調(diào)和諸藥，為使藥。諸藥合理搭配，功在養(yǎng)血活血，通絡(luò)止痛，臨證時(shí)運(yùn)用此方常能減輕患者關(guān)節(jié)腫痛，改善并控制病情，這與本方在降低疾病活動(dòng)度DAS28 評(píng)分、關(guān)節(jié)超聲評(píng)分及外周血HIF-1α、Tfh 細(xì)胞水平、改善關(guān)節(jié)滑膜血供方面具有優(yōu)勢(shì)密切相關(guān)，可為中醫(yī)藥治療本病提供參考。