健脾化瘀解毒法對結腸癌裸鼠模型癌及癌旁組織中AKT、mTOR、p-4EBP1 表達的影響研究

寧康文，簡小蘭， 曾普華，鄺婉婷，楊家翔，周婉雙，劉 偉，蘭東強

（1.湖南中醫藥大學研究生院，長沙 410208；2.湖南省中醫藥研究院附屬醫院，長沙 410006）

結直腸癌（colorectal cancer，CRC）作為一種全球性疾病，在我國是發病率很廣、死亡率極高的惡性腫瘤[1]。隨著新時期的到來，中國結直腸癌的發病率和死亡率也逐年上升，在全國癌癥發病率和死亡率中分別排名第三及第四位[2]。而在大腸癌患者中，術后復發和轉移是其死亡的首要因素，據保守估計，對于早中期結直腸癌進行了根治性切除，5%的I 期患者會復發，II 期患者的復發率為10%～20%，III 期患者的復發率為30%～45%[3]。現下中醫藥抗腫瘤技術快速發展，中醫藥治療惡性腫瘤及抗復發轉移效果明顯。

“瘀”“毒”“虛”是名中醫蔣益蘭教授結合臨床經驗總結的腸癌基本病機，蔣教授認為腸癌術后復發轉移主要責之于瘀毒未盡且正氣虧虛、脾土不足，并以健脾化瘀解毒法作為臨床辨治腸癌的主要治法[4]，其臨床療效及抗癌機制已在許多臨床及動物實驗中被驗證。臨床研究發現健脾化瘀解毒法在防治結直腸癌復發與轉移方面發揮了良好作用，它能拮抗腸癌術后復發及轉移，延長生存期，能穩定瘤體，提高患者生活質量[5-6]，實驗研究發現其還可以降低VEGF 表達，抑制腫瘤血管生成[7]。AKT/mTOR 是調節腫瘤生長、增殖的重要信號途徑，其異常激活與腫瘤的發生、發展密切相關[8]。研究團隊前期研究發現健脾化瘀解毒法能通過對mTOR 信號途徑的抑制而起到抗腫瘤的作用[9]，但其抗腫瘤機制研究仍有待進一步深入探索，以及進一步研究抗結直腸癌復發轉移不同治法中藥如何發揮作用。

本文在前期研究基礎上，構建了結腸癌裸鼠模型，拆分健脾化瘀解毒各治法干預，觀察各組對結腸癌裸鼠模型AKT、 mTOR、p-4EBP1 表達的影響，以進一步探索健脾化瘀解毒治法抗腸癌的可能作用機制，為其進一步推廣提供論證。

1 材料

1.1 細胞系、實驗動物 購于中國科學院細胞庫的人類結腸癌細胞系HCT116 細胞（TCHU99）。SPF 級裸鼠60 只，BALB/C-nu/nu，雌雄各半，體質量（20±2）g，購于湖南長沙斯萊克景達實驗動物有限公司（合格證號：43004700026556）。本研究在SPF 環境下進行，并經過湖南省中醫藥研究院實驗動物倫理委員會同意。

1.2 主要試劑與儀器 培養基DMEM 購于Hyclone 公司。10%胎牛血清購于Biological Industries 公司（批號：1616316）。細胞培養箱購自Thermo 公司（型號：HERAcell2401）。AKT（Y89， 批 號 為ab32505），mTOR（Y391，批號為ab32028），p-4EBP1（phospho T37，批號為ab75767，均從美國Abcam 公司購得。5-氟尿嘧啶（5-Fu）（規格10 mL：0.25 g，批號：6927924804023）購買于旭東海普，雷帕霉素購買于Calbiochem 公司。

1.3 中藥制備 健脾益氣組：人參10 g，薏苡仁30 g；化瘀解毒組：半枝蓮30 g，重樓10 g，莪術10 g，郁金15 g；健脾化瘀解毒組：人參15 g，薏苡仁30 g，半枝蓮30 g，重樓10 g，莪術10 g，郁金15 g。上述中藥飲片均于湖南省中醫藥研究院附屬醫院門診中藥房購得，均屬于一級藥材，符合《中華人民共和國藥典》（2020 年版）規定。配制中藥煎劑，按照以上劑量配比，按處方用量，用10 倍的清水浸泡30 min，煎煮60 min，分離藥渣，儲存藥液。再加8 倍的清水浸泡30 min，煎煮60 min，分離藥渣，儲存藥液。將2次藥液混合均勻，濃縮至1.5 g/mL，過濾、除菌后，封于4 ℃冰箱冷藏。

2 方法

2.1 制備瘤源 以胎牛血清、DMEM 培養基為原料，體外培養HCT116 結腸癌細胞。HCT116 結腸癌細胞長至培養皿底80%～90%時，加入適量胰蛋白酶，2 ～3天換液1 次，3 ～4 d 傳代1 次。取處于對數生長期且離心后的HCT116 細胞懸液，按照2×107/mL 的濃度，每只BALB/C-nu/nu 裸鼠右腋下注射0.1 mL（接種細胞數即2×106個），共注射10 只，觀察裸鼠腋下種植瘤生長，將長出直徑1cm 左右的實體瘤，斷頸處死小鼠后解剖提取其中的腫瘤組織，取腫瘤中心處生長良好的組織，作為原位移植瘤的瘤源，按照1 mm3大小剪碎組織備用。

2.2 建立裸鼠結腸癌模型 SPF 裸鼠在無菌環境（實室提前紫外線消毒滅菌2 h）下用10%的水合氯醛（40 mg/kg）腹腔注射麻醉裸鼠。2 ～3 min 后在裸鼠腹部左下側2.5 cm 處切開腹腔， 尋找并暴露盲腸，用l mL 小針頭輕輕將盲結腸交界處漿膜刮破，稍有滲出血液，將1 mm3大小腫瘤碎塊種植于盲結腸交界處漿膜層，使用OB 膠黏貼。植入完成后，用3%碘酊消毒裸鼠腹腔，將盲腸送入腹腔，縫合。2 周后，裸鼠腹部均可用手觸及明顯腫塊，提示造模成功。

2.3 裸鼠分組與給藥 將造模成功的30 只裸鼠，隨機分為模型組、健脾益氣組、化瘀解毒組、健脾化瘀解毒組、雷帕霉素組和5-Fu 組，每組5 只。另取5 只未予任何處理的小鼠為空白對照組。模型組與空白組予每只0.2 mL 生理鹽水灌胃，1 天1 次，每周給藥5 天，持續4 周。中藥各組予15 g/kg （約每只0.2 mL）中藥液灌胃給藥，給藥結束后均予0.2 mL/只生理鹽水灌胃，頻次同模型組。雷帕霉素組行1 mg/kg（約0.02 mg）腹腔注射，5-Fu 組按人腹腔給藥550 mg/m2折算為每周3.7 mg（約0.15 mL），均為每周2 次，均予生理鹽水灌胃，次數與劑量同模型組。

2.4 取材 在最后一次給藥注射后，斷頸處死小鼠，無菌環境下解剖開腹，將瘤體完全剝除，并取適量的瘤旁組織。空白組取相應部位結腸組織。

2.5 免疫組化法檢測腫瘤組織AKT、mTOR、p-4EBP1的表達 應用SP 二步法進行免疫組織化學染色，用已知的結腸癌腫瘤組織陽性片作為陽性對照，以PBS 取代一抗作為陰性對照，使用DAB 顯色，封片。每組隨機抽取5例標本，每例標本隨機選取6個視野（×400），在病理分析系統中選擇圖像最清晰的區域，進行尺度調整和光密度校正。在每個圖像中，隨機選擇一個被測量的對象區域，利用體視學的基本原理，實現單點彩色分割，得到各組平均光密度（MOD），進行統計學分析。

2.6 統計學方法 采用SPSS 27.0 進行數據分析，計量資料采用均數±標準差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用 LSD 檢驗，以P＜0.05 表示差異有統計學意義。

3 結果

3.1 腫瘤組織中AKT、mTOR、p-4EBP1 的表達 AKT陽性物質表現為褐色及黃色的微粒（圖1 ～圖2），其主要存在于細胞漿中，少數位于細胞膜上，而陰性對照組呈淡黃色。mTOR 陽性物質呈深褐色或深黃色顆粒（圖3 ～圖4），其分布在細胞胞質及細胞核中，少數位于細胞膜中，陰性則表現為淺黃色。p-4EBP1的陽性物質表現為褐色或深黃色的微粒（圖5 ～圖6），其分布在細胞漿及細胞膜上，陰性表現為無色或淡黃色。

圖1 ～圖2 AKT（免疫組織化學染色，×400）

圖3 ～圖4 mTOR（免疫組織化學染色，×400）

圖5 ～圖6 p-4EBP1（免疫組織化學染色，×400）

3.2 模型組AKT、mTOR、p-4EBP1 蛋白的表達與空白組比較 與空白組相比，模型組癌組織與癌旁組織中AKT、mTOR、p-4EBP1 的表達均升高（P＜0.05），且AKT、mTOR、p-4EBP1 的表達水平均為癌組織＞癌旁組織＞正常腸黏膜組織。見表1。

表1 模型組與空白組各蛋白表達（± s，n = 5）

表1 模型組與空白組各蛋白表達（± s，n = 5）

注：與空白組比較，# P ＜0.05

組別 組織類型 AKT mTOR p-4EBP1空白組 —— 0.22±0.13 0.31±0.10 0.26±0.13模型組 癌組織 0.46±0.15# 0.59±0.11# 0.62±0.16#癌旁組織 0.39±0.06# 0.48±0.08# 0.57±0.19#

3.3 各組裸鼠AKT蛋白的表達與模型組的比較 與模型組比較，健脾益氣組、化瘀解毒組、健脾化瘀解毒組、雷帕霉素組、5-Fu 組癌組織與癌旁組織中，AKT蛋白的表達均呈下降水平（P＜0.05），其中以健脾益氣組與健脾化瘀解毒組降低最為明顯（P＜0.05）。對于AKT 蛋白降低水平，健脾益氣組＜健脾化瘀解毒組，健脾益氣組與健脾化瘀解毒組比較差異無統計學意義（P＞0.05）。與雷帕霉素組及5-Fu 組比較，健脾化瘀解毒組對AKT 蛋白表達水平下降，差異均有統計學意義（P＜0.05）。見表2。

表2 各組癌及癌旁組織AKT 表達的比較（± s，n = 5）

表2 各組癌及癌旁組織AKT 表達的比較（± s，n = 5）

注：與模型組比較，# P ＜0.05，## P ＜ 0.01；與健脾益氣組比較，△P ＜0.05，△△P ＜0.01；與化瘀解毒組比較，▲P ＜0.05，▲▲P＜0.01；與雷帕霉素組比較，□P ＜0.05；與5-Fu 組比較，■P ＜0.05

組別 癌組織 癌旁組織模型組 0.46±0.14 0.39±0.05健脾益氣組 0.28±0.05##□ 0.24±0.13#▲▲化瘀解毒組 0.31±0.13#□ 0.34±0.08#□健脾化瘀解毒組 0.16±0.10##△△▲□■ 0.22±0.07##▲▲□■雷帕霉素組 0.30±0.15##△ 0.25±0.17#5-Fu 組 0.27±0.16# 0.29±0.15#△

3.4 各組裸鼠mTOR 蛋白的表達與模型組的比較 與模型組比較，健脾益氣組、化瘀解毒組、健脾化瘀解毒組、雷帕霉素組、5-Fu 組癌組織與癌旁組織中，mTOR蛋白表達均下降，差異有統計學意義（P＜0.05），5 組中以健脾化瘀解毒組和雷帕霉素組mTOR 的下降最低，以健脾化瘀解毒組下降最明顯（P＜0.05）。化瘀解毒組mTOR 表達水平較健脾益氣組、5-Fu 組癌組織與癌旁組織低（P＜0.05）。健脾益氣組癌組織及癌旁組織中mTOR 表達與化瘀解毒組相比差異無統計學意義（P＞0.05）。

與健脾益氣組、化瘀解毒組、5-Fu 組癌組織與癌旁組織比較，健脾化瘀解毒組對mTOR 表達的下降差異有顯著性差異（P＜0.05）。雷帕霉素組與健脾化瘀解毒組癌組織與癌旁組織比較，對mTOR 表達的下降無顯著性差異（P＞0.05）。雷帕霉素組與健脾益氣組、化瘀解毒組癌組織及癌旁組織比較，對mTOR 表達的下降結果有顯著性差異（P＜0.05）。見表3。

表3 各組癌及癌旁組織mTOR 表達的比較（± s，n = 5）

表3 各組癌及癌旁組織mTOR 表達的比較（± s，n = 5）

注：與模型組比較，# P ＜0.05，## P ＜ 0.01；與健脾益氣組比較，△P ＜0.05；與化瘀解毒組比較，▲P ＜0.05，▲▲P ＜0.01；與5-Fu組比較，■P ＜0.05

組別 癌組織 癌旁組織模型組 0.59±0.15 0.51±0.06健脾益氣組 0.42±0.07# 0.48±0.12#▲化瘀解毒組 0.39±0.13# 0.29±0.04##健脾化瘀解毒組 0.25±0.09##△▲■ 0.22±0.03#△▲▲■雷帕霉素組 0.27±0.07#△▲ 0.24±0.08#△▲5-Fu 組 0.45±0.16#▲ 0.36±0.09#▲

3.5 各組裸鼠p-4EBP1 蛋白的表達與模型組的比較 與模型組比較，健脾益氣組、化瘀解毒組、健脾化瘀解毒組、雷帕霉素組、5-Fu 組癌組織與癌旁組織中p-4EBP1 的表達均有降低，差異有統計學意義（P＜0.05）。以健脾化瘀解毒組和雷帕霉素組p-4EBP1 的表達水平最低，而健脾化瘀解毒組下降幅度最為明顯（P＜0.05）。在健脾益氣組及化瘀解毒組中，p-4EBP1表達水平較5-Fu 組癌組織中低（P＜0.05）。健脾益氣組與化瘀解毒組癌組織與癌旁組織中p-4EBP1 表達相比差異無顯著性意義（P＞0.05）。健脾益氣組、化瘀解毒組、雷帕霉素組、5-Fu 組與健脾化瘀解毒組癌組織及癌旁組織比較，p-4EBP1 的下調差異均有顯著性差異（P＜0.05）。見表4。

表4 各組癌及癌旁組織p-4EBP1 表達的比較（± s，n = 5）

表4 各組癌及癌旁組織p-4EBP1 表達的比較（± s，n = 5）

注：與模型組比較，# P ＜0.05，## P ＜ 0.01；與健脾益氣組比較，△P ＜0.05；與化瘀解毒組比較，▲P ＜0.05，▲▲P ＜0.01；與雷帕霉素組比較，□P ＜0.05；與5-Fu 組比較，■P ＜0.05

組別 癌組織 癌旁組織模型組 0.62±0.14 0.57±0.12健脾益氣組 0.26±0.04## 0.41±0.11#□化瘀解毒組 0.27±0.05##□ 0.45±0.13#健脾化瘀解毒組 0.18±0.04#△▲▲□■ 0.23±0.10##△▲□■雷帕霉素組 0.21±0.03# 0.36±0.07#5-Fu 組 0.42±0.13#△▲ 0.38±0.05#△

4 討論

Akt/mTOR 是一種廣泛存在于細胞中的信號途徑，參與多種惡性腫瘤[10-11]發生、侵襲和轉移。Akt 可與PIP2 和PIP3 反應，激活 Akt 從細胞質進入細胞膜，進而激活其下游的靶標，促進細胞生長，抑制細胞凋亡[12]。AKT 在組織內分布廣泛，它對腫瘤細胞的異常活化有促進作用。現有研究證明，AKT 在大腸癌[13]的發展過程中，激活了細胞的存活信號，并通過磷酸化的方式激活AKT，抑制了其下游的多種活性物質，從而抑制癌細胞的凋亡，促進癌細胞的生長、增殖和分化。mTOR 是PI3K/Akt 途徑的下游分子，在正常情況下，通過Akt 介導后，mTOR 被激活，進而磷酸化4EBP1來調控細胞的生長與增殖[14]。p-4EBP1 是mTOR 的下游分子，曹李等發現p-mTOR 與p-4EBP1 在大腸癌中的表達存在顯著的正相關關性（P＜0.0.5），而p-mTOR、p-4EBP1 在大腸癌中的高表達水平可能是導致結直腸腺癌發病的主要機制之一[15]。

本實驗結果表明，健脾化瘀解毒組對大腸癌HCT116 裸鼠模型癌組織與癌旁組織中的AKT、mTOR、p-4EBP1 的表達均有一定的抑制作用。健脾益氣組和化瘀解毒組對癌組織與癌旁組織中AKT、mTOR、p-4EBP1 的表達均有一定的下調作用，但其下降幅度低于健脾化瘀解毒組。

結直腸癌中醫學里稱為“腸覃、臟毒、腸癖”等，根據多年行醫經驗，蔣老師認為大腸癌病因主要分為內因及外因[16]，內因責之于人體正氣虧虛，又以脾氣虛為主，外因包括外感六淫之邪、飲食失節等。當人體長期處于正氣虧虛的狀態，以致于不能有效抵御外邪，從而導致有形之邪如食滯、氣阻、血瘀、痰凝、濕聚等瘀滯體內， 久而不散， 日久搏結，積聚以化毒，發展成為癌塊。概括以脾氣虧虛、癌毒內結，即病機以瘀、毒、虛為本，臨床治療當以健脾益氣，化瘀解毒為治法。基于此治法我們擬方健脾消癌方，核心藥物由人參 10 g，薏苡仁 30 g，半枝蓮 30 g，重樓 10 g，莪術 10 g，郁金 15 g 組成，方中人參、薏苡仁健脾益氣，重樓、半枝蓮清熱解毒，莪術、郁金活血化瘀消癥，全方合用，既能健脾益氣扶正，又可化瘀解毒攻邪，攻補兼施。

結果表明健脾化瘀解毒組可能通過抑制Akt/mTOR通路的激活，下調AKT、mTOR、p-4EBP1 蛋白的表達，從而達到抗癌、抑癌、阻癌的目的，且健脾化瘀解毒法優于單純的健脾益氣法及化瘀解毒法。脾胃為氣血生化之源、后天之本。化瘀解毒藥物多寒涼、辛散，久用則有易傷脾胃、耗散氣血、損傷正氣之弊端。健脾化瘀解毒治法合健脾益氣、化瘀解毒，一方面可以固護脾胃，保養后天之氣血，彌補化瘀解毒藥物易傷人體正氣的缺陷，從而抑瘤而無后顧之憂；另一方面又可正面奮起抗邪，攻毒抑瘤、消癰散結，發揮抗癌作用；故整體配伍、協同增效、療效最佳。

綜上，健脾化瘀解毒法的抗腫瘤機制可能系下調Akt/mTOR 通路的關鍵蛋白AKT、mTOR、p-4EBP1 的表達，健脾益氣法與化瘀解毒法協同增效，以獲得最佳療效。但中醫藥具有多靶點作用，常常通過多種途徑發揮抗腸癌效應，其作用機理還需深入探討。