鱉甲煎丸調控miR-140 對肝癌干細胞致瘤性及干性的影響

譚欽文，徐 健，朱榮火，杜沅沁，吳穎升，彭嘉敏，梁向娟，農耀斌，黃晶晶

（1.廣西中醫藥大學研究生院，南寧 530200；2.廣西中醫藥大學第一附屬醫院，南寧 530023；3.廣西高發傳染病中西醫結合轉化醫學重點實驗室，南寧 530023）

肝癌是全球面臨的重大健康挑戰。據統計，截至2020 年，在全球癌癥死亡率占比中，肝癌死亡率為8.3%，是癌癥相關死亡的第四大原因[1]。早期肝癌主要治療手段為手術切除、TACE、消融以及肝移植等，中晚期則是以放化療為主，結合手術及對癥支持治療[2]。隨著手術方式及化療藥物的不斷革新，肝癌患者的生存率及生活質量得到一定的改善，但治療后復發、轉移以及藥物的耐藥性仍是需要迫切解決的問題。

microRNA（miRNA）是一種小型非編碼RNA，其表達與細胞分化、增殖和凋亡等功能息息相關。研究發現[3]，microRNA 140（miR-140）屬于抑癌基因，在肝癌組織中被發現是一種下調的miRNA。腫瘤干細胞具有自我更新以及產生出具有有限分裂和分化能力的腫瘤細胞[4]。肝癌是由多種細胞組成，其中也包括肝癌干細胞。鱉甲煎丸出自東漢醫家張仲景所著《金匱要略》，即有活血化瘀、解毒散結、益氣養血之功，也具備寒熱并用、攻補兼施的特點。前期研究發現[5]，鱉甲煎丸所具有的 “祛瘀”及“扶正”等功效，能通利脈道，改善肝臟微環境，為干細胞歸巢以及歸巢后提供良好環境?；诖?，項目組提出鱉甲煎丸可能通過上調miR-140 的表達，抑制肝癌干細胞的增殖，從而發揮抗腫瘤的作用。進一步探索中醫藥對肝癌的復發率、轉移率以及耐藥性的積極影響。

1 實驗材料

1.1 細胞株 人肝癌細胞珠（Huh7）購自iCell（中國上海）。

1.2 實驗用藥 項目組采用鱉甲煎丸中成藥（武漢中聯藥業集團股份有限公司，產品批號：202760），鱉甲煎丸：鱉甲、烏扇、黃芩、柴胡、鼠婦、干姜、大黃、芍藥、桂枝、葶藶子、石葦、厚樸 、牡丹皮、瞿麥、紫葳、半夏、人參、土鱉蟲、阿膠、蜂窠、赤硝、蜣螂、桃仁 。

1.3 實驗動物 原有雄性BALB/c 裸鼠20 只，在種植皮下瘤體時死亡8只，現存活12只，體質量（18±2）g，由Charles River Labs（北京，中國）提供。實驗均按照《機構動物護理與使用委員會（IACUC）指南》進行，并經廣西中醫藥大學倫理委員會審核批準（審查證書編號：DW20170528-39）。

1.4 主要試劑及儀器

1.4.1 主要試劑 流式FITC anti-human CD24 抗體（貨號：311103，Biolegend），流式APC anti-human CD133抗體（貨號：372805，Biolegend），BCA 蛋白質濃度測定試劑盒（貨號：AS1086，ASPEN），磷酸化蛋白酶抑制劑（貨號：AS1008，ASPEN），RIPA 總蛋白裂解液（貨號：AS1004，ASPEN），CD133 抗體（貨號：66666-1-Ig，三鷹），CD24 抗體（貨號：18330-1-AP，三鷹），EpCAM 抗體（貨號：21050-1-AP，三鷹），AFP 抗體（貨號：14550-1-AP，三鷹），蛋白Marker（貨號：26616，Thermo），EntiLink? 1st Strand cDNA（貨號：EQ003，ELK Biotechnology），EnTurbo? SYBR Green PCR SuperMix（貨號：EQ001，ELK Biotechnology）。

1.4.2 主要儀器 包埋機（型號：JB-L5，武漢俊杰電子有限公司），脫水機（型號：JK-12J /JT-12P，武漢俊杰電子有限公司），病理切片機（型號：RM2016，上海徠卡儀器有限公司），臺式離心機（型號：TGL-16c，上海安亭科學儀器廠），熒光定量PCR 儀（型號：QuantStudio 6 Flex System，Life Technologies），酶標儀（型號：DR-200Bs，Diatek 公司）。

2 實驗方法

2.1 肝癌干細胞培養及分選

2.1.1 肝癌干細胞的培養 將Huh7 細胞在37℃下添加10%胎牛血清（FBS）的高糖DMEM 培養基和F12培養基中培養并分裝。

2.1.2 肝癌干細胞的分選 收集5×106個細胞，轉移到FACS BD 管中，每管2 mL。然后在每根試管中加入80 μL FACS 分選緩沖液進行細胞懸浮，加入20 μL Fc R 塊緩沖液孵育10 min。細胞在4℃下與熒光抗體孵育30 min，然后在2 mL FACS 分選緩沖液中洗滌。加入2 mL FACS 分選緩沖液后，在流式細胞儀（BD，CA，USA）中進行細胞分選。

2.2 實驗動物分組及給藥 給藥前處理：將鱉甲煎丸中成藥研磨成粉，稱取44 g 鱉甲煎丸溶于400 mL 生理鹽水中，配置成0.11 g/mL，4℃保存備用。BALB/c 裸鼠12 只分為4 組，A 組和B 組分別先予肝癌干細胞皮下成瘤，第3周時予鱉甲煎丸或生理鹽水灌胃，即A組：肝癌干細胞皮下成瘤+生理鹽水灌胃，B 組：肝癌干細胞皮下成瘤+鱉甲煎丸灌胃（2.2 mg/kg/d，為成人劑量2 倍，每日1 次，共2 周）。C 組和D 組分別先予miR-140 過表達或干擾慢病毒干細胞，然后皮下成瘤，第3 周時予鱉甲煎丸或生理鹽水灌胃，即C 組：miR-140 過表達慢病毒肝癌干細胞皮下成瘤+生理鹽水灌胃，D 組：miR-140 干擾慢病毒肝癌干細胞皮下成瘤+鱉甲煎丸灌胃（2.2 mg/kg/d，為成人劑量2 倍，每日1 次，共2 周）。灌藥時間及給藥劑量參考文獻[6-7]執行。

2.3 裸鼠皮下成瘤 BALB/c小鼠皮膚用酒精消毒后，右側腋下皮下注射100 μL 的肝癌干細胞懸液，每天觀察小鼠的生存狀態，如精神，食欲等。到第5 周后，處死小鼠，取出瘤體組織，并測量其體積大小。腫瘤體積計算方法，腫瘤體積計算公式為：長徑×短徑的平方/2。

2.4 觀察瘤體組織病理學變化 將用組織4%多聚甲醛固定24 h，按程序經酒精、二甲苯和石蠟之后，進行脫水浸蠟。石蠟包埋組織連續切成厚度為2 ～3 μm的切片。用蘇木精和伊紅對切片進行染色。在光學顯微鏡下觀察組織形態學。

2.5 檢測肝癌組織中miR-140 及CD133、CD24、EpCAM、AFP 的mRNA 水平 按照試劑盒說明書的方法。RT-PCR 檢測，引物設計，EpCAM：正義5-GTG TGTGAACACTGCTGGGGT-3，反義5-CTGAAGTGCA GTCCGCAAACT-3，擴增產物大小為151bp。AFP：正義5-AGGCTGTACTCATCATTAAACT -3，反義5-ATAT TGTCCTGGCA TTTCG-3，擴增產物大小為294 bp。GAPDH：正義5-CATCATCCCTGCCTCTACTGG-3，反義5-GTGGGTGTCGCTGTTGAAGTC-3，擴增產物大小為259bp。CD133：正義5-GCACTCTATACCAAAGC GTCAAG-3，反義5-GCACGATGCCACTTTCTCAC-3，擴增產物大小為227bp。CD24：正義5-ACCCACGCAGAT TTATTCCAG-3，反義5-CACGAAGAGACTGGCTGTT GAC-3，擴增產物大小為153 bp。miR-140：正義5-GG GTAGAACCACGGCTCAAC-3，反義5-CTCAACTGGT GTCGTGGAGTC-3。U6：正義5-CTCGCTTCGGCAGC ACAT-3， 反 義5-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3。使用Trizol TRIpure 總RNA 提取試劑從組織中提取總RNA。EntiLink?應用于第一鏈cDNA 合成試劑盒進 行cDNA 逆 轉 錄。用EnTurbo?SYBR Green PCR SuperMix 試劑盒對合成的基因進行擴增。檢測CD24、CD133 和EpCAM、GAPDH、miR-140 的基因表達。GAPDH、U6 則作為內部對照。用2-ΔΔCT法測定基因的相對表達量。

2.6 檢測肝癌組織中miR-140 及CD133、CD24、EpCAM、AFP 的蛋白水平 使用RIPA 總蛋白裂解緩沖液從肝組織中提取蛋白質裂解物。用BCA 蛋白濃度測定試劑盒測定。蛋白樣品用10%SDS-PAGE 分離，轉移到PVDF 膜上。然后，將轉膜完成后的膜加入封閉液，在室溫下封閉1 h。除去封閉液，加入一抗稀釋液，將稀釋好的一抗4℃過夜。隨后回收已稀釋的一抗，并用TBST 洗，反復3 次，每次5 min。

2.7 統計學方法 使用SPSS 25.0 軟件。數據表示形式：正態計量資料以均數加減標準差（±s）表示，非正態計資料“以中位數和四分位數（P25，P75）”表示計量資料，先行正態分布檢驗，如各組數據全部服從正態分布，用單因素方差分析，否則用Kruskal-Wallis 非參數檢驗。多組間均值比較采用單因素方差分析，先行Levene Statistic方差齊性檢驗。方差齊性采用F 檢驗進行總均值比較，LSD 檢驗進行兩兩比較，方差不齊改用克魯斯卡爾-沃利斯單因素分析ANOVA檢驗進行兩兩比較。

3 結果

3.1 流式分選肝癌干細胞 Huh7 細胞培養8 天后形成大球體（見圖1）。經流式細胞分選術分選出球形細胞和Huh7 細胞表面標志物CD133 和CD24，并測得其在球形細胞中表達率為40.3%（見圖2A）以及Huh7細胞中小于5%（見圖2B，圖2C）。

圖1 肝癌干細胞成球（×100）

圖2 流式細胞術檢測

3.2 鱉甲煎丸及miR-140 不同表達對裸鼠瘤體體積的影響 根據測量及計算結果，A 組的平均瘤體體積大于B 組，差異有統計學意義（P＜0.05）。C 組平均瘤體體積小于A 組（P＜0.05），D 組平均瘤體體積大于B 組，差異有統計學意義（P＜0.05）。各組間數值對比見表1。實驗中的裸鼠腫瘤圖片見圖3。

表1 裸鼠瘤體平均體積記錄（± s）

表1 裸鼠瘤體平均體積記錄（± s）

注：A 為干細胞成瘤+生理鹽水灌胃組，B 為干細胞成瘤+鱉甲煎丸灌胃，C 為miR-140 過表達慢病毒干細胞+生理鹽水灌胃組，D 為miR-140 干擾慢病毒干細胞+鱉甲煎丸灌胃組。與A 組比較，# P ＜0.05；與B 組比較，△P ＜0.05

組別 體積/cm3 A 0.99±0.20 B 0.47±0.49#0.40±0.11#D 0.89±0.18△C

圖3 實驗室中裸鼠瘤體圖片（×1）

3.3 蘇木精-伊紅（HE）染色結果 將取皮下的瘤組織作常規石蠟切片，進行肝組織病理學觀察。項目組發現為各組均可見彌漫成片的腫瘤細胞，間質較少，腫瘤細胞多呈圓形，核大，染色質粗，深染，核漿比高，可見核分裂。表明肝癌干細胞皮下成瘤形成，腫瘤細胞呈惡性。見圖4。

圖4 蘇木精-伊紅（HE）染色（×200）

3.4 鱉甲煎丸對瘤體中CD133、CD24、EpCAM、AFP 的mRNA 表達及miR-140 表達的影響 對瘤體組織進行PCR 檢測，在CD133、CD24、EpCAM、AFP的mRNA 表達上，A 組顯著高于B 組（P＜0.01），A 組 顯 著 高 于C 組（P＜0.01）。B 組 的CD24、EpCAM、AFP的mRNA的表達均低于D組（P＜0.05）。在miR-140 的mRNA 表達上，B 組miR-140 的基因表達顯著高于A 組。見表2。

表2 CD133、CD24、EpCAM、AFP、EpCAM、miR-140 的基因表達（± s）

表2 CD133、CD24、EpCAM、AFP、EpCAM、miR-140 的基因表達（± s）

注：組別詳情同表1，與A 組比較，# P ＜0.05，## P ＜0.01；與B 組比較，△P ＜0.05，△△P ＜0.01

組別 CD133 CD24 EpCAM AFP miR-140 A 1.07±0.07 1.02±0.07 1.21±0.22 1.02±0.07 1.10±0.35 B 0.50±0.06## 0.50±0.05## 0.61±0.06## 0.50±0.05## 6.05±0.80##0.16±0.55## 0.21±0.04## 0.33±0.03## 0.21±0.04## 14.48±1.15##D 0.65±0.95 0.66±0.05△ 0.84±0.06△ 0.66±0.05△ 2.82±0.40△C

3.5 鱉甲煎丸對瘤體中CD133、CD24、EpCAM、AFP的蛋白表達相對含量的影響 對瘤體組織進行Western Bolt 檢測，在CD133、CD24、EpCAM、AFP 的蛋白表達上，A組高于B組（P＜0.05），A組高于C組（P＜0.05）。而B 組CD24、EpCAM、AFP 的蛋白表達均低于D 組（P＜0.05）。見表3 及圖5。

表3 CD133、CD24、EpCAM、AFP 的蛋白表達相對含量（± s）

表3 CD133、CD24、EpCAM、AFP 的蛋白表達相對含量（± s）

注：組別詳情同表2，與A 組比較，# P ＜0.05，## P ＜0.01；與B 組比較，△P ＜0.05，△△P ＜0.01

組別 CD133 CD24 EpCAM AFP A 0.377±0.11 0.756±0.09 0.850±0.03 0.606±0.03 B 0.105±0.05# 0.233±0.02## 0.345±0.04## 0.133±0.02##C 0.066±0.02# 0.083±0.01## 0.147±0.05## 0.050±0.02##D 0.197±0.06 0.494±0.05△△0.513±0.05△ 0.285±0.03△△

圖5 CD133、CD24、EpCAM、AFP 的蛋白表達相對含量

4 討論

肝癌病機為寒熱錯雜，虛實夾雜，早期以邪實為主，后期以正虛為主，兼有邪實。多項研究[8-9]表明，中醫藥對肝癌細胞增殖、自噬、凋亡等均具有積極的作用，從而對肝癌復發和轉移產生影響。鱉甲煎丸出自《金匱要略》，全方共由23 味中藥組成，具有寒熱并用，攻補兼施，益氣養血、活血化瘀、解毒散結的功效。在古代常用于治療癥瘕、瘧母等疾病。研究[10-11]表明，鱉甲煎丸具有改善肝癌局部微環境，降低血管通透性，調節血管生成以及逆轉肝癌細胞上皮間質轉化等多項作用，從而抑制腫瘤的發生發展。腫瘤干細胞假說提出，腫瘤的形成與生長是由腫瘤中少量的腫瘤干細胞推動的，這些干細胞具有自我更新、全能或多能分化、致瘤能力等特性。這些未分化的細胞使腫瘤組織具有較強的再生能力及耐藥性。肝臟是一個具有強大再生能力的器官，這種能力與肝臟干細胞密切相關。當肝臟受到損害時，肝干細胞不對稱分裂失控而過度增生或產生基因突變，形成肝癌干細胞[12]。目前，尚未發現有藥物能精準消除LCSCs，大部分治療只對分化的癌細胞起作用，而中醫藥具有多靶點、多途徑、多系統的特點，在預防肝癌復發方面有著積極的作用。因此，項目組積極探索中醫藥對腫瘤干細胞的作用，尋求靶向LCSCs 的治療方案。

miRNA 被發現在多種癌癥中處于表達下調的狀態，其異常表達與許多癌癥的發生和進展有關，其中也包括肝癌。研究發現，miR140-5P 是肝癌中的一個抑癌基因，也是肝癌預后的重要生物標志物[13]。瘤體體積是實驗中直觀反映腫瘤生長情況的一個指標。因此，在本實驗中，通過比較裸鼠皮下瘤體大小，項目組發現鱉甲煎丸灌胃組裸鼠瘤體平均體積明顯小于生理鹽水灌胃組。miR-140 過表達慢病毒肝癌干細胞皮下成瘤+生理鹽水灌胃組裸鼠的平均瘤體體積小于肝癌干細胞皮下成瘤+生理鹽水灌胃組。而miR-140 干擾慢病毒肝癌干細胞皮下成瘤+鱉甲煎丸灌胃組小鼠的平均瘤體體積小于肝癌干細胞皮下成瘤+鱉甲煎丸灌胃組。說明鱉甲煎丸灌胃以及上調miR-140 的表達均能抑制裸鼠皮下瘤體生長，而當miR-140 的表達被抑制時，即使予鱉甲煎丸灌胃，但其瘤體體積依然大于單純予鱉甲煎丸灌胃。因此，進一步推斷鱉甲煎丸對裸鼠皮下瘤體的生長具有抑制作用，其作用可能與miR-140 的表達上調有關。

目前，肝癌干細胞尚未找到特異性表面標志物，但最常用的表面標志物有CD133、CD44、CD24 以及EpCAM 等。這些表面標志物表達的高低通常與肝癌干細胞干性的強弱相關。CD133 作為LCSC 標記物的作用已在多種癌癥組織中得到證實。從Huh7、SMMC-7721、HepG2、Huh78 等肝癌細胞株中分離得到的CD133+細胞比CD133-細胞具有更強的集落形成能力、增殖活性以及致瘤性[14]。CD24 在肝癌干細胞中具有較強的表達，且其表達高低與肝癌干細胞樣細胞的自我更新強弱呈正相關[15]。EpCAM 是LCSCs 最具代表性的標志物，EpCAM 高表達的細胞表現出干細胞樣特征，包括自我更新和分化、高侵襲性以及致瘤性[16]。AFP 是胎兒肝臟中合成的一種胚胎蛋白質，隨著胎兒的年齡增大，肝臟也逐漸發育成熟，AFP 逐漸接近成人水平。當肝細胞癌變、增生或受損時，AFP 分泌增加，部分肝細胞恢復產生AFP的功能，使血清AFP水平升高，AFP 可作為診斷肝癌的重要指標[17]。因此，在本研究中，根據肝癌干細胞常用的表面標志物分選出表型表達較強的細胞，種植于裸鼠皮下2 周后，便可見瘤體生長，進一步驗證CD133、CD44、CD24 以及EpCAM 這些表面標志物在肝癌干細胞鑒定中的重要作用。為了進一步測定鱉甲煎丸對肝癌組織中的LCSCs干性的影響，對各組瘤體組織中CD133、CD24、EpCAM、AFP 的基因表達和蛋白表達進行測定，同時，對 miR-140 的基因表達進行了測定，并進行多組間比較。在對肝癌組織CD133、CD24、EpCAM、AFP 的mRNA 及蛋白表達的測定中，項目組發現鱉甲煎丸灌胃組明顯小于生理鹽水灌胃組，說明鱉甲煎丸對LCSCs干性有一定的抑制作用。因此，進一步推斷鱉甲煎丸能抑制LCSCs 的增殖與侵襲能力。在隨后對miR-140 的基因表達測定中，項目組發現鱉甲煎丸灌胃組miR-140 的表達明顯大于生理鹽水灌胃組，進一步驗證了鱉甲煎丸抑制肝癌干細胞干性的表達可能與促進miR-140 的表達有關。

綜上所述，本研究初步探索了鱉甲煎丸對LCSCs致瘤性具有抑制作用。同時，鱉甲煎丸降低LCSCs 表面標志物及AFP 的表達，抑制了LCSCs 的增殖、侵襲活動，從而間接推斷鱉甲煎丸對肝癌的生長、復發、轉移可能具有干預效果，其作用機制可能與上調miR-140 的表達有關。