微波灰化-高效液相色譜-電感耦合等離子體質譜(ICP-MS)法測定茶葉中的鉻酸鉛

劉 欠 吳綺莉 潘春秀

(1.中鋼集團馬鞍山礦山研究總院股份有限公司,安徽 馬鞍山 243000;2.安徽工業大學,安徽 馬鞍山 243000)

隨著茶葉保健功能的深入研究可知,茶葉中含有多種功能營養成分,如茶多酚類、茶氨酸、茶多糖等,其中茶多酚因含有較多的酚羥基,據相關研究表明,茶葉中的茶多酚具有抗氧化、抗衰老、抗癌變、降低血脂和膽固醇、抑菌消炎以及防治心血管疾病和保護心肌等多種藥理作用[1],近年來,茶葉深受人民喜愛。但是隨著人們生活水平的不斷提高,人們在關注茶葉營養成分的同時,也開始重視茶葉中的有害物質[2]。

鉛鉻綠又稱“美術綠”,其成分主要由鉻酸鉛和鐵藍或者酞箐藍組成,由于其顏色鮮艷,價格低廉,近年來常被不法商販所利用,添加于茶葉成品中使茶葉的顏色變綠,提高茶葉的色澤度,以次充好[3-5]。鉛鉻綠中含有大量的鉛和鉻,大量的攝入對人體的健康造成嚴重危害,如果被添加于茶葉中,人在飲用的過程中大量的攝入鉛會對造血系統、神經系統和腎臟等造成嚴重損害[6-9]。同時,鉻通過鉻酸根或者重鉻酸根的形態通過帶負電荷的細胞膜,并且促使氧化,從而導致病變發生,具有致癌和誘發基因突變的作用[10]。因此,測定茶葉中非法添加劑鉛鉻綠具有重要意義。

鉛鉻綠是一種混合物,很難通過特定的物質對其進行定量和定性分析。一般通過測定茶葉中的鉛和鉻的含量,以此來推斷茶葉中是否添加了鉛鉻綠[5,9,11-14],這些方法雖然能夠準確測定茶葉中的鉛和鉻,但是不能明確茶葉中鉛和鉻的來源。直到2019年5月BJS201910《茶葉中美術綠(鉛鉻綠)的測定》的發布,為茶葉中鉛鉻綠的測定提供了依據。但是該標準的第一篇第一法高效液相色譜-電感耦合等離子體質譜聯用法(HPLC-ICP-MS)測定茶葉中鉻酸根時,消除樣品干擾的方法采用的是電爐灼燒法,以最大功率灼燒茶葉至無白煙。本文經過研究發現使用電爐灰化茶葉時仍存在一些弊端。一方面,由于電爐型號不同使用的最大功率也不同,導致灼燒溫度不同,從而影響茶葉灰化的效果及樣品的準確度測定[3,15]。另一方面,由于電爐很小,每個電阻絲的溫度不同,樣品放在電爐上會受熱不均勻,影響茶葉灰化的時間和灰化效果,同時不利于批量樣品的同時測定。此外電爐受外界干擾比較多,容易導致樣品的污染。相關研究表明微波灰化[16-20]和馬弗爐煅燒[16,21-22]均能消除樣品本身的干擾。但是馬弗爐在高溫煅燒前需要對樣品進行蒸發水分和除去有機質等碳化過程,過程比較繁瑣且時間比較長,容易對樣品造成污染。另外,馬弗爐煅燒不能隔絕空氣,容易導致Cr(Ⅲ)向Cr(Ⅵ)的轉化[3]。微波灰化是一種新型的灰化技術,無需炭化可以直接快速升溫灰化,冷卻時間較快,節約了樣品分析的時間,灰化效果好。因此,本文采用微波灰化茶葉除去有機物,然后用堿性提取液提取灰分中的鉻酸根,利用HPLC-ICP-MS測定提取液中的鉻酸根,結合茶葉中鉛的測定結果推測出茶葉中鉻酸鉛的含量,為茶葉中是否添加了鉛鉻綠提供了判定依據。

1 實驗部分

1.1 主要儀器

Agilent 7900電感耦合等離子質譜儀,Agilent 1260高效液相色譜儀,CEM PHOENIX微波灰化儀(美國CEM公司),HJS-6型水浴恒溫磁力攪拌器(金壇市儀純儀器有限公司),G3268-80001色譜柱(30 mm×4.6 mm,5 μm,美國Agilent)。

1.2 試劑與材料

硝酸(優級純,德國默克公司),鉻酸鉛、氫氧化鈉、無水碳酸鈉和氨水(優級純,國藥集團化學試劑有限公司);Be、Ce、Fe、In、Mg、Pb、U的混合標準調諧液(1.0 μg/L,美國珀金埃爾默公司),六價鉻標準溶液(100 mg/L,國家有色金屬及電子材料分析測試中心);Milli-Q去離子水發生器(美國Millipore公司)。

取10.0 g NaOH和15.0 g Na2CO3,水定容至1 L,得到0.25 mol/L的NaOH和0.14 mol/L的Na2CO3的混合堿性提取液。

硝酸銨溶液(0.05 mol/L):一定量水中加入3.4 mL硝酸和3.7 mL氨水,定容至1 L,搖勻;用10%硝酸溶液或10%氨水溶液調節pH值至7.0～7.2,得到50 mmol/L的硝酸銨緩沖鹽溶液。

1.3 樣品制備

茶葉樣品去雜后粉碎,過0.425 mm篩,稱取過篩樣品1.000 g(精確至0.001 g)于瓷坩堝中,放入微波灰化爐中在500 ℃,灰化時間50 min條件下灰化至白灰狀,灰化程序見表1。灰化完成冷卻至室溫,取出樣品加入30 mL的堿性提取液,置于磁力攪拌恒溫水浴鍋中,在90～95 ℃下不間斷攪拌10 min,取出后冷卻至室溫,轉移至100 mL容量瓶中,從中取1.0 mL用0.05 mmol/L的硝酸銨溶液定容至50 mL,用10%的硝酸調節pH值至7.0～7.2,過0.45 μm水系微孔濾膜,上機測定,同時做樣品空白。

表1 微波灰化程序升溫模式

1.4 儀器條件

用調諧液調諧儀器,使儀器靈敏度、氧化物、雙電荷、分辨率等各項指標達到測定要求,主要儀器參數見表2。

表2 HPLC-ICP-MS主要參數

1.5 標準曲線配制

標準中間液的配制(10.0 mg/L):準確移取1.00 mL六價鉻標準儲備溶液(100 mg/L)于10.0 mL容量瓶中,用0.05 mmol/L的硝酸銨溶液定容至刻度,得六價鉻標準中間液為10.0 mg/L。

標準使用液的配制(1.00 mg/L):準確移取10.0 mL六價鉻標準中間液于100 mL容量瓶中,用0.05 mmol/L的硝酸銨溶液定容至刻度,得六價鉻標準使用液為1.00 mg/L。

標準工作溶液的配制:分別吸取0、0.50、1.00、2.00、5.00、10.0、20.0、50.0 mL標準中間液于100 mL容量瓶中,用0.05 mmol/L的硝酸銨溶液定容、混勻,過水系微孔濾膜(0.45 μm),待上機測定。該標準工作液六價鉻的濃度分別為0、5.00、10.0、20.0、50.0、100、200、500 μg/L。該標準工作液現用現配。

2 結果與討論

2.1 前處理方法

目前國內外報道的常用六價鉻提取方法有堿提取[3,23-27]、緩沖鹽溶液提取[28-30]、ASE提取[31]、超聲輔助提取[10,31]等。結合相關文獻,本文先用0.25 mol/L的NaOH和0.14 mol/L的Na2CO3混合堿性提取液直接提取添加了100 mg/kg Cr(Ⅵ)的茶葉30 min,提取完成后轉移至100 mL容量瓶中并定容,上機測定。結果發現Cr(Ⅵ)沒有檢出,與王瑩等[3]研究結果一致;本文又參照超聲輔助提取法,用0.05 mol/L pH值為7.0～7.2的硝酸銨緩沖溶液超聲提取同一添加量的茶葉30 min,提取完畢后8 000 r/min離心,取上清液,重復提取2次,合并上清液,上機測定。結果發現Cr(Ⅵ)的回收率只有30%。其原因一方面是茶葉中含有多酚類的還原性有機化合物,在堿性提取和超聲輔助提取的過程中,同時也把茶葉中的茶多酚類化合物提取出來,在樣品處理的過程中將Cr(Ⅵ)還原成Cr3+[30,32];另一方面是茶葉具有吸附性,能夠吸附樣品中的Cr(Ⅵ),導致Cr(Ⅵ)的回收率不高[33-35]。根據倪張林等[16]的研究結果可知,Pb2CrO4在高溫條件下非常穩定。因此,為了消除茶葉基質的干擾,本文先對茶葉進行灰化處理,然后再提取灰分中的Pb2CrO4。

2.2 灰化方式的選擇

據相關報道可知,電爐灼燒、微波灰化以及馬弗爐煅燒均能消除樣品本身的干擾,但是馬弗爐在高溫煅燒前需要對樣品進行碳化,而微波灰化儀可以直接快速升溫灰化,且冷卻時間較快。因此,本文選擇電爐灼燒和微波灰化兩種方式進行比較,進一步研究更有利于消除茶葉基質干擾的灰化方式。

2.2.1 電爐灼燒灰化法

本文選擇4種添加了100 mg/kg Cr(Ⅵ)的茶葉分別在800、1 000、2 000 W使用功率下灼燒灰化茶葉,用于研究電爐功率對測定茶葉中Pb2CrO4含量的影響。實驗結果發現,由于樣品基質的不同,同一功率下樣品的回收率測定結果差異很大,達到最高回收率時電爐的功率也不同。由表3可以發現,茶葉3無論電爐使用功率是1 000 W還是2 000 W均不能灰化完全;茶葉2雖然在1 000 W下能灰化完全,但是回收率僅有55%,測定總鉻發現總鉻的回收率也只有65.92%;然而,茶葉1和茶葉4在1 000 W條件下就能灰化至灰白色,且樣品回收率均達到80%以上。4種茶葉同一功率下不同的灰化效果反應了電爐灼燒法的灰化效果受樣品基體的影響很大,說明電爐灼燒法不能夠滿足所有茶葉的測定要求,不具有普遍適用性。

表3 不同灰化功率下茶葉回收率的測定結果

另外,由表3還可以發現,茶葉1和茶葉4在使用功率達到2 000 W時,回收率反而只有50%左右,結合茶葉2總鉻的回收率只有65.92%的測定結果,分析其原因可能是高溫下鉻與炭發生反應,生成難溶的碳化鉻化合物,這一結果與李冰茹等[17]研究結果一致。為了進一步驗證在電爐灼燒的過程中存在Cr(Ⅵ)轉化,在同樣的條件下灰化茶葉2,灰化后向其中加入100 mg/kg的Cr(Ⅵ)標液,在90～95 ℃下不間斷攪拌10 min,取出后冷卻至室溫,轉移至100 mL容量瓶中,從中取1.0 mL用0.05 mol/L的硝酸銨溶液定容至50 mL,用10%的硝酸調節pH值至7.0～7.2,過0.45 μm水系微孔濾膜,上機測定。結果發現六價鉻的回收率幾乎100%,證明了在電爐灼燒茶葉樣品時存在Cr(Ⅵ)轉化,同時也說明在堿提取10 min的過程中不存在Cr(Ⅵ)的轉化。

2.2.2 微波灰化法

與電爐相比,微波灰化法隔絕空氣,能夠降低Cr3+向Cr(Ⅵ)的轉化[16-17]。本文參照微波灰化法測定茶葉的總灰分程序升溫方法[20]將上述4種茶葉[添加了100 mg/kg Cr(Ⅵ)]在500 ℃條件下,灰化40 min。按照擬定的堿提取方式,提取灰分,然后上機測定Cr(Ⅵ)的回收率,實驗結果見表4。結果發現4種茶葉均灰化完全,測定Cr(Ⅵ)的回收率在85%～95%。與電爐灼燒法相比,微波灰化法灰化效果好、準確度高,能夠滿足茶葉樣品的測定要求。因此選擇微波灰化作為茶葉的灰化方式。

表4 微波灰化法測定茶葉中Cr(Ⅵ)的回收率結果

2.3 微波灰化條件的優化

微波灰化溫度和灰化時間是影響灰化效果的重要因素[16]。選擇茶葉3[添加了100 mg/kg的Cr(Ⅵ)],按照擬定前處理方式,分別考察了灰化溫度和灰化時間對茶葉中鉻酸根測定結果的影響,優化了灰化溫度和灰化時間等條件。

2.3.1 灰化溫度的優化

在灰化時間40 min條件下,分別研究灰化溫度400、450、500、550、600 ℃對茶葉3[添加了100 mg/kg的Cr(Ⅵ)]中鉻酸根測定結果的影響。由表5可知,在450 ℃以下,茶葉灰化不完全,灰分中有較多的黑色炭顆粒,加標回收率不高;當灰化溫度在550 ℃以上時,雖然茶葉灰化完全,但是由于高溫Cr(Ⅵ)可能與茶葉中的礦物質發生反應,生成難溶的碳化鉻化合物,導致加標回收率不高;因此選擇500 ℃作為茶葉灰化溫度,加標回收率達90.2%。實驗結果如表5所示。

表5 不同灰化溫度下茶葉中Cr(Ⅵ)的加標回收率結果

2.3.2 灰化時間的優化

灰化時間是影響灰化效果另一個重要因素。在灰化溫度500 ℃的條件下,分別考察了灰化時間10、20、30、40、50 min對茶葉3[添加了100 mg/kg的Cr(Ⅵ)]中鉻酸根測定結果的影響,由表6可知灰化時間太短,茶葉樣品灰化不完全,回收率測定結果偏低,隨著灰化時間的增加,灰化效果越好,在灰化時間50 min的條件下,灰化效果最好,回收率達98%。結合灰化溫度和灰化時間的測定結果可知,灰化溫度500 ℃,灰化時間50 min是茶葉樣品的最佳灰化條件。

表6 不同灰化時間下茶葉中Cr(Ⅵ)的加標回收率結果

2.4 提取液的選擇

據報道,目前常用的提取液有NaOH和Na2CO3混合堿提取液[3,15]、水及EDTA和硝酸銨混合提取液[28]等。據王瑩等[3]研究結果可知0.25 mol/L的NaOH和0.14 mol/L的Na2CO3混合堿性提取液是提取茶葉中鉻酸根的最佳濃度。同時,又考慮到提取液與流動相的基體不一致,影響基線的穩定性。本研究在最佳的微波灰化條件下分別研究了0.25 mol/L的NaOH和0.14 mol/L的Na2CO3混合堿性提取液和0.05 mol/L,pH值為7.0～7.2的硝酸銨緩沖溶液對茶葉3[添加了100 mg/kg的Cr(Ⅵ)]灰分中鉻酸鉛提取效果的影響。結果發現0.25 mol/L的NaOH和0.14 mol/L的Na2CO3混合堿性提取液和0.05 mol/L的硝酸銨提取液均能很好地提取灰分中添加的Cr(Ⅵ)。由于茶葉3樣品中本底鉻酸根未檢出,添加的Cr(Ⅵ)回收率好,只能說明0.25 mol/L的NaOH和0.14 mol/L的Na2CO3混合堿性提取液和0.05 mol/L的硝酸銨提取液能夠很好地提取添加的六價鉻離子。為了證實這一結論,稱取0.027 9 g鉻酸鉛,分別用上述兩種提取液在相同條件下提取,轉移至1 000 mL容量瓶中,稀釋500倍,上機測定六價鉻的含量。結果0.05 mol/L的硝酸銨提取液中沒有Cr(Ⅵ)檢出,而0.25 mol/L的NaOH和0.14 mol/L的Na2CO3混合堿性提取液中Cr(Ⅵ)的檢測含量與理論值(20 μg/L)基本一致,說明Na2CO3和NaOH對茶葉中的Pb2CrO4具有更好的提取能力,因此選擇0.25 mol/L的NaOH和0.14 mol/L的Na2CO3混合堿性提取液作為茶葉中Pb2CrO4的提取液。

2.5 堿提取條件的優化

2.5.1 提取液體積的優化

考慮到堿的濃度能夠影響色譜柱的壽命、儀器的穩定性以及Cr3+向Cr(Ⅵ)的轉化率[36]。在最佳的灰化條件下,分別研究了提取液體積對茶葉3[添加了100 mg/kg的Cr(Ⅵ)和100 mg/kg的Cr(Ⅲ)]中Cr(Ⅵ)提取及Cr3+轉化的影響。實驗結果如表7所示,由表7可以看出,當提取液體積達到30 mL時,Cr(Ⅵ)的回收率為90.5%,Cr3+的轉化率也很低,隨后隨著提取液體積的增加,Cr(Ⅵ)的回收率基本保持不變。因此選擇30 mL作為堿提取液的提取體積。

表7 不同提取體積下Cr(Ⅵ)的提取結果及Cr3+的轉化結果

2.5.2 提取時間的優化

提取時間是影響茶葉中鉻酸根提取率的關鍵因素之一,同時也影響Cr3+向Cr(Ⅵ)轉化。在茶葉最優的灰化條件下,分別研究了提取時間對茶葉3[添加了100 mg/kg的Cr(Ⅵ)和100 mg/kg的Cr(Ⅲ)]中Cr(Ⅵ)提取及Cr3+轉化的影響。實驗結果見表8,由表8可知,隨著提取時間的增加,Cr(Ⅵ)的回收率和Cr3+轉化率基本變化不大,從節能環保提高效率考慮,選擇10 min作為茶葉灰分中鉻酸根的提取時間。

表8 不同提取時間下茶葉中Cr(Ⅵ)的提取結果和Cr3+的轉化結果

2.5.3 提取溫度的優化

提取溫度是影響鉻酸根提取率和Cr3+向Cr(Ⅵ)轉化的另一因素。本研究在茶葉最優的實驗條件下,分別研究了提取溫度對茶葉3[添加了100 mg/kg的Cr(Ⅵ)和100 mg/kg的Cr(Ⅲ)]中Cr(Ⅵ)提取及Cr3+轉化的影響。實驗結果見表9,由表9可以發現,隨著提取溫度的增加,Cr(Ⅵ)的回收率逐漸增加,Cr3+轉化率基本不變,提取溫度為95 ℃時,Cr(Ⅵ)的回收率最高,Cr3+轉化率低,因此選擇95 ℃作為茶葉灰分中鉻酸根的提取溫度。

表9 不同提取溫度下茶葉中Cr(Ⅵ)的提取結果和Cr3+的轉化結果

2.6 方法學驗證

2.6.1 線性范圍

按照實驗方法測定52Cr標準系列,以濃度為橫坐標,以色譜峰面積為縱坐標,建立標準曲線。結果相關性良好,相關系數為0.999 8,滿足GB/T 27404—2008規定的要求。

2.6.2 檢出限和定量限

檢出限按3倍的信噪比所產生的信號響應對應的濃度表示。通過將樣品空白中添加0.5 μg/L的Cr(Ⅵ)標準溶液產生的相應信號約為噪聲的3倍。因此,方法最低檢出濃度為0.5 μg/L。當稱樣量為1.000 g,定容體積為100 mL,稀釋50倍時,Cr(Ⅵ)檢出限為2.5 mg/kg,定量限為7.5 mg/kg。

2.6.3 精密度和準確度

為了進一步驗證該方法的準確度和精密度,對茶葉3進行三水平加標,6次平行測定,用于計算該方法的準確度和精密度。準確度結果用加標回收率表示,精密度結果用RSD表示。實驗結果見表10。從表10可知,加標回收率在91.3%～95.3%,精密度結果在1.1%～2.0%,均符合GB/T 27404—2008中的規定要求。表明該方法精密度高、準確度良好,完全滿足茶葉中鉻酸根的測定。

表10 精密度和準確度測定結果

3 結論

比對了電爐灼燒和微波灰化兩種灰化方式的測定結果,建立了微波灰化-HPLC-ICP-MS法測定茶葉中鉻酸鉛的方法,并對灰化溫度、灰化時間、堿提取液體積、提取時間以及提取溫度進行了優化。實驗結果表明該方法檢出限低至2.5 mg/kg,三水平加標回收率在91.3%～95.3%,精密度結果在1.1%～2.0%。研究表明,該方法檢出限低,靈敏度高,準確度結果良好,能夠滿足茶葉中鉻酸鉛的測定。