死后人體組織中15種金屬元素的電感耦合等離子體質(zhì)譜(ICP-MS)法檢測(cè)及其結(jié)果分析

劉興勝 王愛(ài)華 于忠山 常 靖 李永剛 李 洋 劉 耀

(1.中國(guó)人民公安大學(xué) 偵查學(xué)院,北京 100038;2.吉林警察學(xué)院,長(zhǎng)春 130117;3.公安部鑒定中心,北京 100038)

金屬元素在人體內(nèi)含量很少,但它們?cè)谏^(guò)程中起著非常重要的作用,是人體保持健康生命活動(dòng)的必需成分。與此同時(shí),過(guò)量攝入金屬元素能夠不同程度地引起人體生理活動(dòng)的異常,造成中毒或死亡的結(jié)果[1]。金屬單質(zhì)及化合物廣泛存在于自然環(huán)境中[2],與人類生產(chǎn)、生活關(guān)系密切,許多有毒金屬化合物無(wú)色無(wú)臭,中毒癥狀與疾病易混淆,常被不法分子用于投毒犯罪活動(dòng),涉及金屬元素中毒的案事件時(shí)有發(fā)生[3]。在法醫(yī)金屬毒物中毒死亡案件檢測(cè)中,常見(jiàn)的檢材主要包括肝臟、腎臟、肺、腦等人體組織,通常采用檢測(cè)其金屬元素總量來(lái)實(shí)現(xiàn)。正常人體組織中可檢測(cè)到超過(guò)20種以上金屬元素,其中包括含量較高且為人體所必需的鎂、鈣、鐵、銅、鋅等元素,也包括鉻、錳、鍶、鋇等微量元素[4],因此,分析體內(nèi)金屬元素正常含量,對(duì)于金屬毒物檢測(cè)、區(qū)別金屬在人體中的正常含量與中毒含量具有重要意義。由于死后人體組織中金屬元素含量基礎(chǔ)數(shù)據(jù)缺失,無(wú)法將檢測(cè)結(jié)果與體內(nèi)正常含量做對(duì)比,導(dǎo)致在金屬元素中毒結(jié)果認(rèn)定上缺少科學(xué)參考和合理依據(jù)。

近年來(lái),電感耦合等離子體質(zhì)譜法(ICP-MS)因其具備檢出限低、準(zhǔn)確度高、能夠同時(shí)檢測(cè)多種元素的優(yōu)點(diǎn),已經(jīng)在生物樣品分析中廣泛應(yīng)用[5-7]。GONG等[8]采用ICP-MS檢測(cè)武漢地區(qū)孕婦和非孕婦全血中12種金屬元素含量,發(fā)現(xiàn)9種元素在孕婦和非孕婦之間含量有差異性,7對(duì)元素之間顯著相關(guān)。S?DERBERG等[9]采用ICP-MS對(duì)120例自殺上吊死亡患者的股骨血和尿進(jìn)行分析,獲得了68種元素的描述性統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù),為死后人體元素濃度評(píng)價(jià)提供參考。而利用ICP-MS對(duì)死后人體組織中金屬元素分析評(píng)價(jià)較少。本研究以非元素中毒者的死后人體組織為研究對(duì)象,采用微波消解-電感耦合等離子體質(zhì)譜法分析測(cè)定鎂、鋁、鈣、鉻、錳、鐵、銅、鋅、砷、鍶、鎘、鋇、汞、鉈、鉛等15種元素,獲得元素含量基礎(chǔ)數(shù)據(jù),通過(guò)相關(guān)性分析與主成分分析,研究死后人體組織中金屬元素含量之間的差異,分析其相關(guān)性,對(duì)元素含量做綜合評(píng)價(jià),為法醫(yī)金屬毒物分析和中毒認(rèn)定提供重要參考。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑與材料

65%濃硝酸、30%過(guò)氧化氫,ICP-MS調(diào)諧溶液,1.0 mg/mL標(biāo)準(zhǔn)溶液,以上供儀器分析使用的試劑均為優(yōu)級(jí)純,實(shí)驗(yàn)用水由Milli-Q系統(tǒng)(Millipore,美國(guó))制備,符合GB/T 6682中一級(jí)水規(guī)定。死后人體組織樣本來(lái)源于非正常死亡案件死者組織檢材(由公安部鑒定中心提供,死因均排除金屬元素中毒),置于冰箱中-24 ℃冷凍保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 儀器及工作條件

iCAP Q電感耦合等離子質(zhì)譜儀(Thermo Fisher Scientific,美國(guó)),Preps 全自動(dòng)微波消解儀(上海屹堯儀器科技發(fā)展有限公司),移液器,50 mL容量瓶(適用于ICP-MS檢測(cè))。釆用質(zhì)譜調(diào)諧液對(duì)儀器各項(xiàng)工作指標(biāo)進(jìn)行優(yōu)化,儀器工作條件達(dá)到測(cè)定要求,確定儀器最佳工作技術(shù)條件與參數(shù)值,見(jiàn)表1。

表1 電感耦合等離子質(zhì)譜儀工作條件

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

用濃度2%稀硝酸溶液將市售1 000 μg/mL的15種金屬元素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)溶液逐級(jí)稀釋配制混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液,As、Hg、Tl、Pb濃度分別為0、0.02、0.05、0.1、0.2、0.5、1、2、5、10 ng/mL,Cr、Mn、Cu、Sr、Cd、Ba濃度分別為0、2、5、10、20、50、100、200、500、1 000 ng/mL,Mg、Al、Ca、Fe、Zn濃度分別為0、20、50、100、200、500、1 000、2 000、5 000、10 000 ng/mL。用濃度2%稀硝酸溶液將市售1 000 μg/mL的Bi和In標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)溶液逐級(jí)稀釋配制成10 ng/mL的內(nèi)標(biāo)溶液。

1.3.2 樣品前處理

金屬元素在體內(nèi)與多種蛋白質(zhì)形成結(jié)合物,難以直接檢測(cè),需進(jìn)行氧化、分解等操作,將有機(jī)質(zhì)徹底破壞。取0.5 g(精確至0.000 1 g)組織樣品于消解罐中,加入5 mL濃硝酸(65%),2 mL過(guò)氧化氫(30%),經(jīng)微波消解儀消解(消解程序見(jiàn)表2)后,轉(zhuǎn)移消解液至50 mL容量瓶中,用去離子水清洗消解罐3次,將清洗液合并至樣品消解液中,并用去離子水定容至刻度,作為樣品提取液,供儀器檢測(cè)。

表2 微波消解程序

1.3.3 定量方法選擇

采用標(biāo)準(zhǔn)曲線-在線雙內(nèi)標(biāo)實(shí)時(shí)校正法進(jìn)行定量。Mg、Al、Ca、Cr、Mn、Fe、Cu、Zn、As、Sr、Cd、Ba等12種元素采用In為內(nèi)標(biāo),Hg、Tl、Pb等3種元素采用Bi為內(nèi)標(biāo)。

2 結(jié)果與分析

2.1 線性、檢出限和定量限

取15種金屬元素的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液和10份空白對(duì)照溶液進(jìn)行ICP-MS檢測(cè),通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程得到的樣品空白平均值加上3倍標(biāo)準(zhǔn)偏差作為檢出限(LOD),以3倍檢出限作為定量限(LOQ)。結(jié)果表明,As、Hg、Tl、Pb元素在0～10 ng/mL,Cr、Mn、Cu、Sr、Cd、Ba元素在0～1 000 ng/mL,Mg、Al、Ca、Fe、Zn元素在0～10 000 ng/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)具有良好線性關(guān)系,相關(guān)系數(shù)(r2)不小于0.998 7,各元素檢出限為0.000 1～1.2 ng/mL,定量限為0.000 3～3.7 ng/mL(表3),滿足人體組織等生物樣本的檢測(cè)要求。

表3 15種金屬元素的線性關(guān)系、檢出限和定量限

2.2 精密度實(shí)驗(yàn)

取15種金屬元素的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,連續(xù)6次進(jìn)行ICP-MS檢測(cè),統(tǒng)計(jì)6次檢測(cè)結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為0.27%～3.4%,見(jiàn)表3,精密度較高,符合檢測(cè)方法精密度要求。

2.3 加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)

以Bi和In作為內(nèi)標(biāo)在線實(shí)時(shí)校正儀器,降低儀器響應(yīng)信號(hào)變化的基體效應(yīng)和信號(hào)漂移影響,提高檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性和精密度。

同一組織樣品中分別取0.5 g(精確至0.000 1 g)制備低、中、高3個(gè)質(zhì)量濃度的加標(biāo)樣品和空白對(duì)照樣品,每個(gè)濃度設(shè)置3個(gè)平行樣品,按實(shí)驗(yàn)方法制備樣品溶液,進(jìn)行儀器檢測(cè),獲取樣品信號(hào)強(qiáng)度,cps。添加的標(biāo)準(zhǔn)混合液信號(hào)強(qiáng)度為A,加標(biāo)樣品信號(hào)強(qiáng)度為B,空白對(duì)照樣品信號(hào)強(qiáng)度為C,加標(biāo)回收率=(B-C)/A×100%,計(jì)算得出加標(biāo)回收率為82.1%～116%,見(jiàn)表4。

表4 樣品加標(biāo)量和回收率

2.4 樣品含量檢測(cè)結(jié)果

用ICP-MS對(duì)44份死后人體組織樣品中15種金屬元素進(jìn)行檢測(cè),結(jié)果見(jiàn)表5。肝組織中Fe含量最高,平均值達(dá)422 953 ng/g,其次為Mg、Ca、Zn元素,平均含量超過(guò)80 000 ng/g,其他微量元素中,Cu、Mn、Al、Cr、Cd元素含量較高,平均值超過(guò)700 ng/g,其余6種元素含量較少。表中4種組織間元素含量比較,腎中Cd、Hg元素含量高于其他組織含量,肺中Al、Ba元素含量較高,其中Al超過(guò)其他組織50倍以上,肺和胃中Ca含量高于肝和腎。不同組織中15種元素含量的變異系數(shù)為27.0%～224.2%,其中Al、Cr、Mn、Cu、Cd、As、Ba、Hg、Tl、Pb元素含量變異系數(shù)超過(guò)100%,說(shuō)明組織中金屬元素含量差異較大,有必要進(jìn)行分析和綜合評(píng)價(jià)[10]。表5中得到的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)可以為法醫(yī)金屬毒物檢驗(yàn)案件的中毒值認(rèn)定提供參考。

表5 死后人體肝、腎、肺、胃等組織中15種金屬元素含量

2.5 金屬元素相關(guān)性分析

采用Origin 2022軟件繪制15種元素的Spearman秩相關(guān)性分析圖,探討組織樣本金屬元素濃度之間的相關(guān)性,見(jiàn)圖1,發(fā)現(xiàn)有47對(duì)金屬元素之間具有顯著相關(guān)性(P<0.01)。其中Al、Sr分別與Cd顯著負(fù)相關(guān),其余顯著相關(guān)關(guān)系均為正相關(guān)。Mg、Cu與Mn,Cu與Zn,Fe與Pb呈極顯著正相關(guān)(P<0.01),相關(guān)系數(shù)>0.8,其中Cu與Zn相關(guān)系數(shù)達(dá)0.91,表明Cu含量高的樣本中對(duì)應(yīng)的Zn含量也高,死后人體組織樣本中金屬元素之間存在復(fù)雜的相關(guān)關(guān)系,具備進(jìn)行主成分分析的條件[10]。

圖1 死后人體組織中15種金屬元素之間相關(guān)性(n=44)Figure 1 Correlation between 15 metal elements in postmortem human tissues(n=44).

2.6 金屬元素含量主成分分析

采用SPSS 26統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)組織中15種金屬元素含量做主成分分析,對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理后,以特征值>1提取4個(gè)主成分(表6),所提取的主成分累計(jì)方差貢獻(xiàn)率達(dá)72.942%,包含了15種元素的主要信息,從KMO和巴特利特球形度檢驗(yàn)結(jié)果來(lái)看,KMO值=0.685,顯著性Sig值<0.001,各因素之間關(guān)聯(lián)程度較高,與相關(guān)性分析結(jié)果一致,符合開(kāi)展主成分分析的條件。表中第一主成分方差貢獻(xiàn)率較大,達(dá)31.34%,第一主成分中Al、Mn、Fe元素載荷值>0.7,主要受這3種金屬元素影響,第二主成分主要受Cu、Zn元素影響,第四主成分主要受Cd影響,可以得出,Al、Mn、Fe、Cu、Zn、Cd等6種元素是死后人體組織的主要特征金屬元素。

表6 死后人體組織中金屬元素含量主成分分析(n=44)

選取前4個(gè)主成分對(duì)不同組織中金屬元素含量進(jìn)行綜合評(píng)價(jià),計(jì)算4個(gè)主成分的單獨(dú)得分,然后以每個(gè)主成分因子對(duì)應(yīng)的方差相對(duì)貢獻(xiàn)率為權(quán)重得到每個(gè)樣品的綜合得分[11],按照綜合得分降序排序,結(jié)果見(jiàn)表7。綜合得分越高,說(shuō)明總體金屬元素含量越高,由表7可知,肝臟中總體金屬元素含量最高,其次是腎和肺,胃組織中總體金屬元素含量最低。

表7 死后人體組織金屬元素含量主成分得分及評(píng)價(jià)(n=44)

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn),4種組織中不同金屬元素含量存在明顯差異。上述15種金屬元素中毒性比較大的有Hg、Cd、Tl、Pb、Cr等[12],其中Cd檢測(cè)含量較高,不同組織間Cd含量大小排序?yàn)槟I>肝>胃>肺,腎中Cd含量達(dá)18 461 ng/g,遠(yuǎn)低于文獻(xiàn)中報(bào)道的(200 mg/kg)引起腎臟鎘毒性反應(yīng)的劑量[13]。POST等[13]利用掃描電鏡對(duì)死后人體腎、肝、肺組織中Cd金屬元素進(jìn)行檢測(cè),含量腎>肝>肺,依次為17.4、2.21、0.5 μg/g,王愛(ài)華等[14]對(duì)非鎘中毒者死后人體組織中Cd元素含量采取ICP-MS檢測(cè),含量腎>肝>胃>肺,依次為8.31、2.23、0.208、0.17 μg/g,與本研究濃度范圍一致。

對(duì)不同組織中金屬元素開(kāi)展相關(guān)性分析,發(fā)現(xiàn)有47對(duì)金屬元素之間具有顯著相關(guān)性,結(jié)果表明4種組織中不同金屬元素含量既存在差異性,也具有一定關(guān)聯(lián)性,有必要進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)。通過(guò)主成分分析,將15種金屬元素進(jìn)行正交變換轉(zhuǎn)化為幾個(gè)綜合變量(即主成分)來(lái)表征原有變量的大部分信息,可以依據(jù)原變量對(duì)主成分的貢獻(xiàn)率(即載荷變量)來(lái)反應(yīng)其在主成分中的重要性[15]。主成分分析篩選出Al、Mn、Fe、Cu、Zn、Cd等6種主要特征元素?；谠睾糠治霭l(fā)現(xiàn),肺中Al含量最高,腎中Cd含量最高,Cu和Zn元素在肝中含量最高,且在不同組織中含量呈顯著正相關(guān)關(guān)系。

4 結(jié)論

以Bi和In雙內(nèi)標(biāo)在線校正基體效應(yīng)和信號(hào)漂移干擾,采用微波消解-電感耦合等離子體質(zhì)譜法檢測(cè)死后人體組織樣本中15種金屬元素含量,方法干擾少,可同時(shí)分析多種元素,精密度和準(zhǔn)確度高。通過(guò)對(duì)測(cè)得金屬元素含量進(jìn)行相關(guān)性分析、主成分分析等綜合評(píng)價(jià),研究死后人體組織中金屬元素含量的差異與關(guān)聯(lián),本研究考察的金屬元素檢測(cè)方法可以為法醫(yī)金屬毒物分析案件檢測(cè)提供參考,所獲取的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)可以為相關(guān)案件中毒判定提供科學(xué)的數(shù)據(jù)支撐。