miR-145在甲狀腺乳頭狀癌組織中表達及其對淋巴結轉移和預后的預測價值

吳翠翠 張雪琦 吳志堅

(北華大學附屬醫(yī)院檢驗科,吉林 吉林 132011)

甲狀腺乳頭狀癌(PTC)的發(fā)病率呈逐年增加趨勢,尤其是發(fā)生淋巴結轉移后其生存期更短,這主要因為發(fā)生淋巴結轉移后腫瘤更易侵犯甲狀腺外血管和器官及與自身因素密切相關〔1〕。微小RNA(miR)在多種腫瘤中均有異常表達,在調節(jié)腫瘤發(fā)生和腫瘤發(fā)展方面起重要作用,包括生長、轉移和凋亡。既往研究表明,miR-145在大多數腫瘤組織中均呈低表達,發(fā)揮抑癌基因的作用。蘭天等〔2〕通過體內、體外實驗研究證實,miR-145-5p在甲狀腺癌細胞中低表達,miR-145-5p過表達可顯著降低甲狀腺癌細胞的遷移和侵襲能力,并降低裸鼠體內移植瘤的體積和重量,表明miR-145的異常表達有望作為PTC進展的生物標志物,但目前尚缺乏miR-145在人PCT組織中表達的報道。本文擬分析miR-145在PTC組織中的表達情況及其與淋巴結轉移和預后的臨床應用價值。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2015年1月至2021年12月在北華大學附屬醫(yī)院甲狀腺外科進行手術后經病理確診為PTC患者64例,平均年齡(59.4±5.6)歲,伴頸部淋巴結轉移者23例。

1.2組織標本的采集與處理 患者行全身麻醉或局部麻醉后,依據腫瘤發(fā)生部位、病變范圍、類型及淋巴結轉移情況行針對性手術治療。手術切除組織離體后,取部分癌組織和距癌組織邊緣3 cm處癌旁組織,用焦碳酸二乙酯(DEPC)-磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗后迅速置于液氮中保存?zhèn)溆?。查詢病例信息管理系統(tǒng),詳細了解并記錄患者年齡、性別、腫瘤直徑及淋巴結轉移等基本信息。

1.3主要儀器與試劑 Applied Biosystems 7500 Fast逆轉錄-熒光定量聚合酶鏈反應(RT-qPCR)儀購自美國ABI公司,RNA提取試劑Trizol購自美國Invitrogen公司,RevertAid First Strand cDNA Synthesis試劑盒購自美國Life Technologies公司,FS Universal SYBR Green Master實時熒光定量PCR試劑購自瑞士羅氏公司。根據NCBI GeneBank數據庫及Primer6.0設計引物,miR-145-5p-RT引物:5′-CTCAACTGGTGTCGTGGAGT-CGGCAATTCAGTTGAG-AGGGAT-3′,miR-145-5p正向引物:5′-ACACTCC-AGCTGGGGTCCAGTTTTCCCAGGA-3′,反向:5′-TGGTGTCGTGGAGTCG-3′。U6正向引物:5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′,反向:5′-AACGCTTCACGAAT-TTGCGT-3′,引物由蘇州吉瑪基因公司合成。

1.4RT-qPCR法檢測甲狀腺癌組織及癌旁組織中miR-145水平 將收集的組織從液氮中取出,剪碎后取適量體積的組織置于研磨器中研磨成粉末,加入1 ml Trizol充分混合,裂解15 min。依次加入氯仿、異丙醇、80%乙醇洗脫純化析出,超微量分光光度計檢測RNA濃度及純度,脂凝膠電泳成像檢測RNA完整性。使用RevertAid First Strand cDNA Synthesis試劑盒反轉錄為cDNA保存于-20 ℃冰箱中。取2 μl cDNA作為模板配制25 ml RT-qPCR體系,按照FS Universal SYBR Green Master說明書,以U6為內參,在Applied Biosystems 7500 Fast實時熒光定量PCR儀上進行PCR。反應條件:預變性95 ℃ 5 min,擴增步驟95 ℃ 30 s,60 ℃ 30 s,共40個循環(huán),擴增結束后繪制溶解曲線,根據2-ΔΔCt方法計算各組miR-145-5p表達水平差異。

1.5統(tǒng)計學方法 采用SPSS25.0軟件進行t檢驗、χ2檢驗、非參數檢驗、Kaplanmeier法及Logrank檢驗。通過非條件單因素和多因素Cox比例風險回歸模型分析影響PTC患者預后的相關因素。

2 結 果

2.1PTC及其癌旁組織中miR-145相對表達量比較 PTC組織中miR-145的相對表達量(0.437±0.099)顯著低于癌旁組織(1.076±0.216;t=-21.333,P<0.001)。

2.2PTC患者甲狀腺癌組織miR-145表達與臨床病理特征的關系 甲狀腺癌組織中miR-145表達水平與患者年齡、性別、腫瘤直徑、腫瘤部位及病灶情況無顯著相關性(P>0.05),與病理分級、UICC分期及淋巴結轉移具有顯著相關性(P<0.05,P<0.01),見表1。

表1 甲狀腺癌組織中miR-145的表達與患者臨床病理特征的關系及影響PTC患者預后的影響因素〔n(%)〕

2.3PTC患者預后生存情況 PTC患者自出院后隨訪8～62個月,中位時間686 d,生存分析結果表明,miR-145高表達(≥0.448)和低表達(<0.448)患者5年總生存率分別為93.75%(30/32)和81.25%(24/32),差異有統(tǒng)計學意義(χ2=4.267,P=0.039)。Kaplan-meier生存分析結果顯示,低表達miR-145患者與高表達患者相比預后較差,具有顯著差異(P<0.05),見圖1。

圖1 不同miR-145表達PTC患者生存分析

2.4影響PTC患者預后的危險因素 經單因素分析得出,腫瘤直徑越大、病理分級越高、分期越晚、有淋巴結轉移及miR-145低表達時,患者5年生存率越低(P<0.05,P<0.01),見表1。

2.5影響PTC患者預后的獨立危險因素 經多因素Cox 比例風險回歸模型分析得出,Ⅲ～Ⅳ期、有淋巴結轉移及miR-145低表達均為PTC患者預后的獨立危險因素(P<0.05,P<0.01),見表2。

表2 影響PTC患者預后的COX多因素分析

3 討 論

miRNA是一類短小的非編碼RNA分子,可以通過調節(jié)基因表達來參與細胞的生物學過程。研究表明,miRNA在PTC的發(fā)生和發(fā)展中起到重要調控作用〔3～6〕。miR-146b、miR-221和miR-222等miRNA的表達水平在PTC中顯著上調,而miR-181b和miR-21等miRNA的表達水平則下調,這些miRNA的異常表達可能與PTC的發(fā)生、轉移和預后密切相關〔7〕。研究發(fā)現,miR-146b的上調與PTC的增殖和侵襲能力增強有關〔8〕,而miR-221和miR-222的上調則與PTC的預后不良和復發(fā)有關〔9〕。另外,miR-181b和miR-21的下調可能會促進PTC的細胞增殖和侵襲〔10〕。

miRNA可以作為PTC的潛在生物標志物,用于診斷、預后評估和治療監(jiān)測。研究表明,特定miRNA的表達模式可以用于區(qū)分PTC和甲狀腺良性病變,為臨床診斷提供了新手段〔11～13〕。此外,一些miRNA也被發(fā)現與PTC的預后相關,可以作為預后評估的潛在標志物〔14～16〕。PTC的淋巴結轉移是其預后評估中的重要指標之一。研究表明,PTC的淋巴結轉移是其常見的臨床特征之一〔17,18〕。淋巴結轉移的存在與PTC的預后密切相關,可以影響患者生存率和疾病復發(fā)率。一般來說,淋巴結轉移的程度越大,預后越差〔19〕。研究還發(fā)現,淋巴結轉移的數量、大小和位置對于預后的評估具有重要意義〔20〕。近年來,有研究發(fā)現,一些基因突變和表達異常與PTC淋巴結轉移和預后有關〔21～23〕。此外,一些長鏈非編碼(lnc)RNA或環(huán)狀RNA也可以通過靶向某些miRNA的表達,進而影響PTC增殖、遷移和侵襲,促進淋巴結轉移和改變患者預后〔24～26〕。

miR-145作為一種重要的調控分子,參與了多種生物學過程的調節(jié),包括細胞增殖、凋亡和侵襲轉移等。在PTC中,miR-145下調可能與腫瘤的惡性程度和預后有關。本研究表明,miR-145可能與PTC的惡性程度及病情嚴重程度有關,且可能在淋巴結轉移過程中發(fā)揮了一定調控作用。此外,本研究還提示miR-145可能作為一個潛在的預后標志物和治療靶點,有助于指導PTC患者的治療策略和預后評估。然而,本研究還存在一些限制:首先,本研究是基于單一中心的回顧性研究,可能存在選擇偏倚;其次,本文樣本量相對較小,需要進一步擴大樣本量以驗證。