以肺泡灌洗液行結核/非結核分枝桿菌檢測對菌陰肺結核的診斷價值

王世艷 趙睿楨 張建勇 趙建軍

(遵義醫科大學附屬醫院呼吸與危重癥醫學科,貴州 遵義 563000)

結核病是由結核分枝桿菌(MTB)引起的一種慢性傳染病〔1〕。在2020年,有987萬新診斷的結核病患者,受到新型冠狀病毒(COVID-19)大流行影響,全球新診斷及報告的結核病患者數量有所下降〔2〕,且該年度在人類免疫缺陷病毒(HIV)陰性人群中有130萬人死于該病〔3〕,是單一病原體感染疾病造成死亡的主要原因。結核病以肺結核最常見,主要經呼吸道傳播。中國是全球結核病衛生經濟的高負擔國家之一,結核患者數量居于世界第二位〔4〕。近些年來,由于獲得性免疫缺陷綜合征和糖尿病發病率的增高,多種耐藥肺結核患者的增多,導致全球結核病形勢嚴峻〔5,6〕,且隨著結核病患者逐年增多,非結核分枝桿菌(NTM)肺病病例報道亦逐步增加。目前,現常用的痰涂片抗酸染色陽性率低,其中約70%為菌陰肺結核(3次痰涂片均陰性且痰培養陰性)且無法鑒別結核桿菌、非結核桿菌及奴卡氏菌等;利福平耐藥實時熒光定量核酸擴增檢測技術(GeneXpert MTB/RIF)檢測、MTB環介導等溫擴增技術(TB-LAMP)敏感性較高但也無法鑒別結核桿菌、非結核桿菌及奴卡菌等;羅氏培養法是金指標,但存在耗時長,靈敏度低等缺點,故肺結核的診斷困難,漏診、誤診等情況容易在臨床上出現,更使得結核病的控制成為難題,造成很大的衛生經濟負擔〔7～10〕。因此,如何提高菌陰肺結核患者的陽性診斷率,減少NTM誤診,是臨床亟待解決的問題。近年來,MTB/NTM檢測在結核病的診斷方面取得了良好效果,使得MTB/NTM檢測成為目前結核分子生物學檢測的檢測方法之一,在臨床上得到廣泛應用。本研究取菌陰肺結核患者肺泡灌洗液(BALF)作為標本,分別進行GeneXpert MTB/RIF、MTB/NTM及TB-LAMP檢測,評估MTB/NTM檢測的診斷價值。

1 對象與方法

1.1研究對象 收集遵義醫科大學附屬醫院2017年12月至2021年11月臨床診斷為菌陰肺結核(3次痰涂片陰性、1次痰結核菌培養陰性)的患者324例,其中男181例,女143例,平均年齡(54.22±18.33)歲。菌陰肺結核的診斷參照《中國結核病防治規劃實施工作指南(2008版)》〔11〕涂陰肺結核的診斷標準及我國衛生行業標準《肺結核診斷》WS288-2017〔12〕。納入標準:(1)年齡14～96歲;(2)患者3次痰找抗酸桿菌(即時痰、夜間痰、晨痰)均為陰性且1次痰培養陰性。排除標準:(1)患者痰抗酸桿菌涂片陽性;(2)有心肺功能嚴重下降、血小板、凝血功能障礙,難以耐受支氣管鏡檢查及支氣管鏡手術有禁忌證;(3)不愿接受支氣管鏡檢查患者。對納入患者進行支氣管鏡檢查并收集BALF。57例納入MTB/NTM組,其中男34例,女23例,平均年齡(52.02±17.81)歲。161例納入GeneXpert MTB/RIF組,男90例,女71例,平均年齡(54.61±19.03)歲。106例納入TB-LAMP組,男57例,女49例,平均年齡(54.81±17.57)歲。3組年齡、性別差異無統計學意義(P>0.05)。對所有患者進行涂片抗酸染色和羅氏培養。本研究經醫院倫理委員會批準。

1.2儀器與試劑 MTB/NTM核酸檢測試劑及儀器由中國北京博奧生物提供,GeneXpert MTB/RIF試劑盒、樣品試劑由美國Cepheid公司提供,TB-LAMP檢測試劑盒、恒溫擴增儀由榮研生物科技有限公司提供,抗酸染色試劑由中國珠海貝索生物技術有限公司提供,羅氏培養基按《結核病實驗室檢驗規程》〔13〕進行制備。

1.3涂片抗酸染色 取BALF于玻片正面涂片,自然干燥后滴加苯酚復紅染液染色5 min后以流水自玻片一端緩慢沖洗染液,待瀝干后滴加脫色液,脫色1～2 min至無可視染色,最后滴加亞甲藍溶液染色30～60 s,流水緩慢沖洗,瀝干后鏡檢。

1.4羅氏培養 將BALF標本加入4%NaOH溶液(兩者等體積),充分混勻后靜置10 min,吸取沉淀液1 ml均勻接種到羅氏培養基斜面上,37 ℃培養箱孵育,觀察培養結果。若8 w后未見MTB生長即認定結果為陰性;若酸性羅氏斜面培養基上見菌落生長,則需進一步行抗酸染色檢測,檢測結果為陽性時,再采用對硝基苯甲酸鑒定菌落為NTM還是MTB,并且進一步行菌群鑒定。

1.5MTB/NTM檢測 取BALF樣本提取核酸、聚合酶鏈反應(PCR)擴增、結果判定。對于MTB,其標本擴增曲線呈S形,且Ct值<36,判定其結果為陽性;對于NTM,其標本擴增曲線呈S形,且Ct值<40,判其結果定為陽性。在MTB、NTM均為陽性時,判定為MTB陽性,MTB、NTM均為陰性時,則表示無MTB檢出。

1.6GeneXpert MTB/RIF檢測 取BALF樣本離心15 min(3 000 r/min),取其沉淀液,按GeneXpert MTB/RIF操作說明進行GeneXpert MTB/RIF檢測,2 h后直接在檢測系統觀察結果。GeneXpert MTB/RIF同時檢測MTB對利福平的耐藥性。由A、B、C、D、E,5條分子探針針對MTB rpoB基因81 bp的利福平耐藥核心區間(RRDR)序列,可檢測rpoB基因是否突變,判斷對RIF耐藥性。

1.7TB-LAMP檢測 取BALF樣本離心15 min(3 000 r/min),取其沉淀液,按照LAMP試劑盒操作說明進行TB-LAMP檢測,40 min后由檢測儀器判定結果。

1.8統計學分析 采用SPSS17.0軟件進行McNemar檢驗、χ2檢驗。

2 結 果

MTB/NTM檢測陽性率〔43.86%(25/57)〕與羅氏培養〔14.04%(8/57)〕、涂片抗酸染色陽性率〔1.75%(1/57)〕比較,差異均有統計學意義(P<0.001)。GeneXpert MTB/RIF檢測陽性率〔54.66%(88/161)〕與羅氏培養〔16.77%(27/161)〕、涂片抗酸染色〔3.73%(6/161)〕陽性率比較,差異均有統計學意義(P<0.001)。TB-LAMP檢測陽性率〔49.06%(52/106)〕與羅氏培養〔18.87%(20/106)〕、涂片抗酸染色〔4.72%(5/106)〕陽性率比較,差異均有統計學意義(P<0.001)。3種方法陽性率比較,差異無統計學意義(χ2=2.185,P=0.335)。

3 討 論

我國每年新發的結核病例約有90萬例〔14〕。MTB是引起結核病的主要病菌,是單一病原體感染疾病造成死亡的主要原因,所以對其進行快速檢測及鑒別診斷是防控結核疫情傳播和擴散的關鍵。為了盡快發現和診斷肺結核,提高陽性診斷率,對MTB檢測方法的積極探索越來越多〔15～18〕。臨床上,痰液作為診斷肺部疾病的首選樣本,常被用于結核病的診斷〔19〕,但對肺結核兒童,尤其是年齡<5歲的兒童,存在標本采集困難〔20〕,少痰患者亦然。應用痰作為標本進行涂片抗酸染色陽性率低〔21〕,羅氏培養時效低,容易造成延誤及漏診〔22〕,同時部分患者為NTM感染,臨床癥狀、影像學及抗酸桿菌涂片無法鑒別,可能導致誤診,延誤病情及增加經濟負擔。故找到一種能夠提高檢測陽性率且能夠區分MTB與NTM的檢測方法成為結核病診療臨床策略急需解決的問題之一。一方面,臨床上通過對菌陰肺結核采取支氣管BALF樣本離心檢測提高陽性率;另一方面,對BALF樣本通過MTB/NTM檢測方法進行檢測提高檢測陽性率且能夠區分MTB與NTM,該方法采用 PCR-熒光探針法進行核酸檢測,采用 DNA 微陣列芯片法對 NTM 陽性的樣本進行菌種鑒定,具有簡便、快捷的特點。世界衛生組織(WHO)推薦的其他針對結核菌核酸檢測方法GeneXpert MTB/RIF,能夠快速檢測MTB,判斷是否對RIF耐藥。LAMP是日本學者Notom開發的一種適用于基因診斷的恒溫核酸擴增技術,該技術的核心是針對靶基因6個特定區域(F3c、F2c、F1c、B1、B2、B3)設計4個特異性引物(兩個外部引物F3、B3,兩個內部引物FIP、BIP),利用鏈置換型DNA聚合酶在等溫條件下進行基因擴增〔23〕。本研究結果顯示,MTB/NTM檢測具有較好診斷效能,對檢測人員專業技術要求相對較低,較為簡單、快捷,并能鑒別NTM,及時減少NTM患者使用結核藥物引起的身體損害及經濟損失。GeneXpert MTB/RIF、TB-LAMP檢出陽性率亦較高,但其費用偏高,加重了衛生經濟負擔。本研究中僅采用BALF作為標本對各種檢測方法進行比較,結合目前臨床需要,可進一步探討多種樣本如胸水、尿液等在各檢查方法中的陽性率,向臨床提供更加完整、優化的診斷策略。