LRG1在乳腺癌組織中表達及臨床意義

張彥收 劉學良 張庚 曹淼 劉運江

(1河北醫科大學第四醫院乳腺中心,河北 石家莊 050011;2滄州市人民醫院甲乳外科)

中國國家癌癥中心發布的全國癌癥統計數據顯示:乳腺癌是國內女性發病首位的惡性腫瘤,每年發病人數約為30.4萬〔1〕。當前,隨著精準化治療模式的推進和新型藥物的不斷涌現,乳腺癌的治療效果已取得了巨大提升。然而,乳腺癌發病機制復雜,探尋乳腺癌發病、增殖和轉移關鍵基因,建立新的治療途徑和靶點對提高乳腺癌的生存率至關重要。富亮氨酸α-2糖蛋白(LRG)1是富亮氨酸重復序列(LRR)超家族蛋白成員之一,LRG1在多種惡性腫瘤中表達上調,并在細胞增殖、凋亡、侵襲轉移及血管生成方面扮演著重要角色。目前國內、外關于LRG1在乳腺癌中表達的研究報道較少。本研究通過檢測原發性乳腺癌組織中LRG1的表達,探討其與臨床病理參數的關系。

1 資料與方法

1.1臨床資料 收集2019年1～6月河北醫科大學第四醫院乳腺中心收治的125例原發性乳腺癌患者石蠟包埋組織標本及臨床病理資料,均為女性,中位年齡50歲;組織切片包括乳腺癌組織及癌旁組織。納入標準:(1)經病理診斷確診為浸潤性乳腺癌;(2)均接受手術治療(保乳或乳房切除術),腋窩接受前哨淋巴結活檢或淋巴結清掃。(3)術前未接受過放、化療及內分泌治療。排除標準:(1)合并其他惡性腫瘤;(2)初診有遠處轉移;(3)復發轉移性乳腺癌。(4)病理檢查結果為乳腺導管上皮重度不典型增生和導管原位癌。本研究經河北醫科大學第四醫院倫理委員會批準,患者均已知情同意。

1.2免疫組織化學染色方法 所有組織標本中LRG1蛋白的表達均由醫院病理科醫師采用免疫組織化學鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶(SP)法進行檢測,具體操作步驟如下:石蠟切片脫蠟、乙醇脫水;加3% H2O237 ℃下孵育10 min,以阻斷內源性過氧化物酶的活性;磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗3次×5 min;行抗原修復,山羊血清孵育,加LRG1抗體(1∶200)、4 ℃下孵育過夜;PBS沖洗3次×5 min;加生物素標記,37 ℃下孵育20 min;PBS沖洗3次×5 min;加辣根過氧化物酶標記,37 ℃下孵育30 min;PBS沖洗3次×5 min;加新配制的DAB 顯色,蘇木素復染10 s,PBS反藍,脫水、透明、封片。PBS 替代一抗作為陰性對照。

1.3結果判讀 兩位經驗豐富的病理醫師,采用雙盲法對免疫組化結果進行判讀。LRG1著色部位主要為胞膜和胞質,陽性信號表現為褐色顆粒狀外觀。在病灶處隨機選取10個高倍視野,每個視野計數100個細胞。半定量分析LRG1呈陽性的癌細胞在所觀察細胞中的百分比和染色強度。染色百分比為:陽性細胞數<5%=0分,5%～25%=1分,26%～50%=2分,≥51%=3分。染色強度分為:無染色=0分,輕度染色=1分,中度染色=2分,重度染色=3分。然后,根據染色強度與陽性細胞比率評分的乘積,確定每個標本的染色評分:≥3分為陽性,<3分為陰性。

1.4統計學方法 采用SPSS21.0軟件行χ2檢驗。

2 結 果

2.1LRG1在腫瘤組織及正常乳腺組織中的表達情況 在125例原發性乳腺癌患者中,59.2%(74/125例)患者LRG1呈陽性表達。LRG1著色部位主要位于胞膜和胞質,陽性信號表現為褐色顆粒狀外觀,見圖1。乳腺癌組織中LRG1表達高于癌旁組織〔36.7%(46/125)〕,差異有統計學意義(χ2=4.96,P=0.04)。

圖1 LRG1 在乳腺癌組織中表達(×200)

2.2LRG1表達與臨床病理參數的關系 不同淋巴結轉移、TNM分期患者LRG1陽性表達差異顯著(P<0.01,P<0.05)。未發現乳腺癌組織中LRG1蛋白陽性表達與患者年齡、月經狀態、腫瘤直徑、組織學分級、乳腺癌分型的相關性(P>0.05)。見表1。

表1 乳腺癌組織中LRG1陽性表達與臨床病理參數的關系(n)

3 討 論

LRG1是最早被發現的含有LRR結構的蛋白。早期研究認為LRG1可能是中性粒細胞早期分化的一種標志物〔2〕。近些年研究顯示LRG1在人類多種惡性腫瘤組織、血液、腦脊液、外泌體中異常表達,并且可以作為部分腫瘤早期診斷和預后判斷的生物標記物。LRG1可能在腫瘤的發生、發展、侵襲轉移、上皮間質轉化(EMT)和異常血管生成過程中扮演重要角色。

LRG1在健康人視網膜新生血管中表達水平較高,在其他正常組織如乳房、皮膚和胃腸道組織中呈現弱的不完全表達〔3〕。目前多項報道LRG1在惡性腫瘤組織中呈現表達上調。在239例胃癌患者中,44%的患者LRG1呈現高表達〔4〕;在肝癌患者中,LRG1的表達水平為85.8%(667/777)〔5〕。此外,在胰腺癌和非小細胞肺癌中,同樣發現LRG1表達水平的升高〔6,7〕。基于癌癥基因組圖譜(TCGA)數據庫中轉錄組測序技術(RNA-seq)測序結果,使用基因表達譜數據動態分析(GEPIA)數據庫(http://gepia.cancer-pku.cn/index.html)〔8〕分析TCGA中1 085例乳腺浸潤性癌和112例正常乳腺組織的數據,結果顯示LRG1 mRNA在乳腺癌組織中表達明顯高于正常乳腺組織。分析Breast Cancer Gene-Expression Miner數據庫〔9〕中乳腺癌資料,LRG1 mRNA表達在不同激素受體狀態和HER-2表達中存在顯著差異,雌激素受體(ER)、孕激素受體(PR)均陽性患者LRG1 mRNA表達顯著高于ER、PR均陰性組;HER-2陰性組LRG1 mRNA表達高于HER-2過表達組。本研究結果證明,LRG1蛋白在浸潤性乳腺癌組織的表達與LRG1 mRNA表達情況一致。但在不同分子亞型中未發現LRG1蛋白表達差異性,可能與本研究中納入HER-2陽性型和三陰性乳腺癌標本例數較少有關,可進一步擴大樣本量進行驗證。

目前研究顯示,LRG1不僅在惡性腫瘤組織中異常表達,且與惡性腫瘤的進展相關。于菁等〔10〕發現,乳酸脫氫酶(LDH)、LRG1及β2-微球蛋白(MG)在腫瘤分期晚、存在淋巴結結外侵犯及骨髓受累的彌漫大B細胞淋巴瘤患者血清中表達水平異常升高,血清中LRG1水平是影響彌漫大B胞淋巴瘤復發的獨立危險因素。先前的研究也證實,LRG1蛋白的表達是影響乳腺癌無疾病生存期(DFS)、總生存期(OS)的獨立危險因素,LRG1表達水平與DFS、OS呈負相關〔11〕。梁棟等〔12〕研究顯示,LRG1 mRNA表達還與子宮內膜癌淋巴結的轉移和臨床分期有關。Sun等〔13〕研究了結直腸癌組織中LRG1的表達與臨床病理相關指標的關系,結果顯示,LRG1蛋白的表達與血管微密度、腫瘤分期、組織分化和脈管浸潤等病理參數顯著相關。在胃癌研究中,有學者發現LRG1在胃癌組織中的表達與組織學類型、脈管浸潤、腫瘤直徑、淋巴結轉移及疾病分期顯著相關,抑制LRG1的表達可以降低體外胃癌細胞的遷移和侵襲〔14〕。進一步分析Breast Cancer Gene-Expression Miner數據庫〔9〕中乳腺癌資料發現,LRG1在1 525例淋巴結陽性患者中的表達高于2 345例淋巴結陰性組。本研究同樣發現乳腺癌組織中LRG1蛋白的表達與淋巴結轉移個數、病理TNM分期顯著相關,LRG1表達可能反映了疾病的進展。

LRG1主要通過轉化生長因子(TGF)-β信號通路作用于血管生成、EMT和細胞凋亡的調控機制,影響腫瘤的發生和發展〔15,16〕。Wang等〔17〕在小鼠視網膜疾病模型的研究中發現LRG1可能通過TGF-β1信號途徑發揮促腫瘤血管生成作用。在TGF-β1存在時,LRG1可以與內皮糖蛋白相互作用,激活TGF-β1/活化素受體樣激酶(ALK)1信號通路引起致病性血管生成。在非小細胞肺癌研究中發現細胞外泌體中富含LRG1蛋白,來自患者樣品或癌細胞外泌體可以顯著增加人臍靜脈內皮細胞(HUVEC)中血管生成標記物血管內皮生長因子(VEGF)A和血管生成素(Ang)1的表達,并增強HUVEC的成管能力〔18〕。其他研究還表明LRG1參與了誘導EMT過程,并可促進結直腸癌細胞中VEGFA表達,促進腫瘤血管生成。此外,LRG1還可以通過以濃度和時間依賴性方式誘導缺氧誘導因子(HIF)-1促進血管生成〔19〕。證據表明通過調節 LRG1抑制腫瘤遷移、侵襲具有很高的潛在臨床價值〔20,21〕。而針對LRG1作為新的抗體藥物耦聯物(ADC)靶點藥物,已證實在細胞外與標準化療相比具有相似的抗腫瘤活性〔22〕,LRG1在未來抗腫瘤領域可能作為新的治療靶點。

綜上,LRG1在浸潤性乳腺癌組織表達上調,并與淋巴結轉移個數、病理TNM分期相關。LRG1可能在乳腺癌發生、發展過程中發揮關鍵作用,通過進一步機制的進一步探索,可能為將來乳腺癌的診斷和治療提供新的思路。